HPLC-MS/MS를 사용하여 뉴클레오시드/뉴클레오티드 함량 측정을 위한 식물 샘플 준비

뉴클레오시드와 뉴클레오티드는 모든 살아있는 유기체의 중심 대사 구성 요소입니다. 그(것)들의 물질 대사는 세포 발달을 위해 요구됩니다. 이 방법은 이러한 대사 산물의 정량화를 위한 강력한 도구를 제공합니다.

이 방법은 식물에서 뉴클레오시드와 뉴클레오티드의 신속하고 정확한 정량화를 허용한다. 완전한 샘플 사전 처리 및 LC-MS/MS 분석은 10~20개의 샘플 세트에 약 2일이 소요됩니다. 이 방법은 모든 식물과 다른 유기체에도 적용 될 수있다.

절차를 시연하는 것은 첸 연구소의 부교수인 창화 주(Changhua Zhu)가 될 것입니다. 식물을 재배하려면 아라비도시스 씨앗을 70%에탄올로 살균하여 1/2 강도의 무라시게와 스쿠그 영양소로 한천 접시에 뿌려야 합니다. 48시간 동안 어둠 속에서 판을 배양한 다음 섭씨 22도에서 16시간 이하의 통제된 성장챔버로 옮기고, 섭씨 20도에서 8시간 동안 어두워집니다.

2주 모종의 100밀리그램을 수확하고 대사산물 추출을 위해 액체 질소로 동결하십시오. 60 Hertz의 주파수에서 5 분 동안 사전 냉각 믹서 밀에 7 ~ 8 개의 강철 구슬로 냉동 식물 조직의 100 밀리그램을 분쇄하십시오. 메탄올, 아세토닐릴 및 물을 2대 2대 1의 비율로 포함하는 추출 용액을 준비합니다.

추출 용액의 1 밀리리터로 균질화된 물질을 다시 중단합니다. 결과용 액액을 섭씨 4도에서 12, 000 XG에서 15분 동안 원심분리한 다음, 서스펜션0.5 밀리리터를 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 액체 질소로 동결합니다. 냉동 건조기에서 냉동 샘플을 증발시키고 5 %의 아세토나이트와 95 %의 물로 0.5 밀리리터로 재보힙합니다.

4, 000 XG에서 4°C에서 10분 동안 생성된 용액을 원심분리합니다. LC-MS/MS 측정을 위해 상체를 바이알에 적재합니다. 10 밀리머라 암모늄 아세테이트 버퍼를 2리터의 이중 분해수에 1.5그램의 암모늄 아세테이트를 용해시켜 준비합니다.

10%의 암모늄과 아세테이트산으로 pH를 9.5로 조정합니다. 뉴클레오시드 측정을 위해 초순수 100% 메탄올 2리터를 준비한 다음 뉴클레오티드 측정을 위해 초순수 아세토나이트 2리터를 준비합니다. 이전에 준비된 각 시료의 전처리된 대사산물 추출에 대해 0.02 밀리리터를 트리플 쿼드러플 질량 분광계와 결합한 이진 펌프를 HPLC 시스템에 주입합니다.

표준 교정 곡선을 생성하려면 6개의 샘플 추출을 함께 풀링하고 혼합물을 소용돌이쳐 낸 다음, 각 배경을 얻기 위해 6개의 추출에 다시 알리쿼트합니다. 각 표준의 6가지 농도를 각각 6개의 추출에 추가하고 HPLC 시스템에 하나씩 주입합니다. 질량 전환을 통해 각 표준의 피크 영역을 서로 다른 농도로 기록합니다.

이 프로토콜은 2주 된 아라비도시스 야생 형 모종에서 알려진 수정 된 뉴클레오시드 인 N1-메틸라데로신을 식별하고 정량화하는 데 사용되었습니다. 질량 분석 프로파일은 N1-메틸라데로신 표준에서 생성된 제품 이온이 150 및 133 MZ 비율임을 나타냈다. 그리고 콜롬비아 제로 추출에서 동일한 프로파일이 관찰되었습니다.

150MZ의 제품 이온이 풍부하기 때문에 N1-메틸라데노사인 식별을 위해 282.1에서 150의 대량 전환이 선택되었습니다. 목표 피크의 보존 시간은 7.05분이었습니다. N1-메틸라데노신 표준의 보존 시간과 동일합니다.

N1-메틸라데노신 표준의 농도 시리즈는 6개의 견본 추출에 추가되었습니다. 표준 샘플은 LC-MS/MS에 주입되었고 N1-메틸라데로신의 피크 영역이 증가하여 표준의 명목 농도에 대해 플롯되었습니다. 6개의 동일한 배경 추출은 정량화를 위해 정확하고 반복 가능한 교정 곡선을 만드는 데 중요합니다.

우리의 방법은 식물의 신진 대사 경로를 탐구하기 위해 적용 할 수 있습니다. 야생 형 과 기능 상실 돌연변이 사이의 대사 산물 프로파일을 비교함으로써 신진 대사 플럭스를 그릴 수 있었습니다.