Name: HPLC-MS/MS를 사용하여 뉴클레오시드/뉴클레오티드 함량 측정을 위한 식물 샘플 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: 배우세요 HPLC-MS/MS를 사용하여 식물 샘플에서 뉴클레오시드와 뉴클레오티드를 정량 분석하는 방법을. 이 기법은 신속하고 정확하며 다양한 생물체에 적용 가능하여 식물 대사 연구에 필수적인 도구입니다.

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이 작품은 중앙 대학 (KJQN202060), 중국 국립 자연 과학 재단 (31900907), 장쑤성의 자연 과학 재단 (BK20190528), 유전자 공학 및 생명 공학 국제 센터 (CRP / CHN20-04_EC.C) 및 중앙 대학 (LZ20)의 기초 연구 기금 (LZ20)에 의해 재정적으로 지원되었습니다.

1 식물 성장 및 재료 수집
<ol><li>아라비도시스 씨앗을 70% 에탄올로 살균하고 1반강도 무라시게와 스쿠그 영양소로 제조된 한천 접시에 뿌려야 합니다.</li>
	<li>48h에 대해 4°C에서 어둡게 아라비도시스 씨앗을 함유한 플레이트를 배양한 다음, 22°C에서 55 μmolm-2 s-1의 16h 빛 아래 제어된 성장 챔버로 옮기고 20°C에서 8시간 어둡게 옮깁니다.</li>
	<li>2주 묘목 100mg(신선한 체중)을 수확하고 대사 산물 추출을 위해 액체 질소를 동결하십시오. 주의: 연구원은 재료 수집 중에 인간 조직 오염을 피하기 위해 장갑, 보호 안경 및 실험실 코트를 적절하게 착용해야합니다.</li>
</ol>2 뉴클레오시드/뉴클레오티드 추출
<ol><li>60Hz 의 주파수에서 5 분 동안 사전 차가운 믹서 밀에 7-8 강철 구슬이있는 냉동 식물 조직 100 mg을 접지하십시오.</li>
	<li>메탄올, 아세토닐릴 및 물을 포함하는 추출 용액을 2:2:1의 비율로 준비한다.</li>
	<li>1mL의 추출 용액으로 균질화된 물질(대부분의 대사산물포함하지만 단백질은 포함되지 않음)을 다시 중단합니다.</li>
	<li>4°C에서 15분 동안 12,000 x g의 결과 용액원심분리기.</li>
	<li>서스펜션의 0.5mL를 새로운 1.5mL 튜브로 옮기고 액체 질소에서 동결한다.</li>
	<li>냉동 다이어에서 냉동 샘플을 증발시키고 5 % 아세토나이트와 95 %의 물0.1 mL로 재주중지하십시오.</li>
	<li>원심분리기 40,000 x g에서 4°C에서 10분 동안 생성된 용액(0.1 mL)을 원심분리합니다. LC-MS/MS 측정을 위해 상체를 유리병에 적재합니다.</li>
</ol>3 LC-MS/MS 측정
<ol><li>이중 증분 수(Mobile phase A)의 2L에서 1.1 g의 암모늄 아세테이트를 용해시켜 10mM 암모늄 아세테이트 버퍼를 준비한다. pH를 9.5% 암모늄 및 아세테이트산으로 조정합니다.</li>
	<li>뉴클레오시드 측정을 위해 초순수 100% 메탄올(모바일 상 B1)의 2L를 준비한다. 또한 뉴클레오티드 측정을 위해 초순수 100% 아세토닐릴(Mobile phase B2)의 2L을 준비한다.</li>
	<li>3중 사중대 질량 분광계(MS)와 결합된 이진 펌프(LC)를 가진 HPLC 시스템에 각 샘플의 전처리 된 대사 산물 추출0.02 mL을 주입한다. 주의: HPLC 시스템은 C18 컬럼(50 x 4.6mm)을 사용합니다. 입자 크기 5 μm; 25°C에서 작동) 뉴클레오시드 분리를 위한 이동상 A 및 B1(도1A)로완충하고 핵조류 분리를 위한 다공성 흑연 탄소(PGC) 컬럼(50 x 4.6mm, 입자 크기 5 μm; 25°C에서 작동)을 뉴클레오타이드 분리용 이동상 A 및 B2(도1B)로사용한다. 각 샘플은 기술 복제를 위해 세 번 주입되었다.</li>
	<li>C18 열에 대한 표 1에 도시된 메서드와 PGC 열에 대한 표 2에 표시된 메서드를 프로그래밍합니다. 0.65mL min-1의유량을 설정합니다. 참고: 질량전환(표 3)은질량 분광계에 의해 모니터링되었다. 8개의 뉴클레오시드및 5개의 뉴클레오티드의 질량 스펙트럼 분석 조건은 표준화 및 변형된 것들을 포함하는 표 3에열거된다.</li>
	<li>모든 표적 화합물의 피크 영역을 기록합니다(그림1).</li>
</ol>표준 교정 곡선 4세대
<ol><li>풀 6 샘플 추출, 섹션 2의 설명에 따라 생산 된, 그리고 소용돌이. 그런 다음 각 배경을 얻기 위해 6 개의 추출 (동일한 볼륨)에 다시 알리쿼트합니다.</li>
	<li>각 표준의 6가지 농도를 각각 6개의 추출에 추가하고 다음 단계 3.3을 하나씩 주입합니다.</li>
	<li>3.4 단계 및 3.5 단계에 설명된 바와 같이 질량 전이를 통해 각 표준의 피크 영역을 다른 농도로 기록한다.</li>
	<li>각 표준의 명목 농도에 대해 피크 영역을 플롯하여 6점 곡선을 생성합니다. 참고: 단계 3.5에 기록된 뉴클레오시드/뉴클레오티드의 피크 영역은 표준 교정 곡선의 범위에 속한다.</li>
	<li>각 표준 화합물에 대해 직선 방정식을 계산합니다: Y = aX + b</li>
</ol>5 대사 산물의 정량화
<ol><li>3.5단계에서 기록된 피크 영역과 4.5단계에서의 방정식을 사용하여 대사 산물의 내용을 계산합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Liu, B., Winkler, F., Herde, M., Witte, C. -P., Großhans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+link+between+deoxyribonucleotide+metabolites+and+embryonic+cell-cycle+control%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A link between deoxyribonucleotide metabolites and embryonic cell-cycle control.</a> Current Biology. 29 (7), 1187-1192 (2019).</li>
<li>Zrenner, R., Stitt, M., Sonnewald, U., Boldt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrimidine+and+purine+biosynthesis+and+degradation+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Pyrimidine and purine biosynthesis and degradation in plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 57, 805-836 (2006).</li>
<li>Witte, C. -P., Herde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+metabolism+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Nucleotide metabolism in plants.</a> Plant Physiology. 182 (1), 63-78 (2020).</li>
<li>Chen, M., Herde, M., Witte, C. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+the+nine+cytidine+deaminase-like+genes+in+Arabidopsis%2C+eight+are+pseudogenes+and+only+one+is+required+to+maintain+pyrimidine+homeostasis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Of the nine cytidine deaminase-like genes in Arabidopsis, eight are pseudogenes and only one is required to maintain pyrimidine homeostasis in vivo.</a> Plant Physiology. 171 (2), 799-809 (2016).</li>
<li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((m6A+RNA+degradation+products+are+catabolized+by+an+evolutionarily+conserved+N6-methyl-AMP+deaminase+in+plant+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">m6A RNA degradation products are catabolized by an evolutionarily conserved N6-methyl-AMP deaminase in plant and mammalian cells.</a> The Plant Cell. 30 (7), 1511-1522 (2018).</li>
<li>Chen, M., Witte, C. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinase+and+a+glycosylase+catabolize+pseudouridine+in+the+peroxisome+to+prevent+toxic+pseudouridine+monophosphate+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A kinase and a glycosylase catabolize pseudouridine in the peroxisome to prevent toxic pseudouridine monophosphate accumulation.</a> The Plant Cell. 32 (3), 722-739 (2020).</li>
<li>Dahncke, K., Witte, C. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+purine+nucleoside+catabolism+employs+a+guanosine+deaminase+required+for+the+generation+of+xanthosine+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Plant purine nucleoside catabolism employs a guanosine deaminase required for the generation of xanthosine in Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 25 (10), (2013).</li>
<li>Jung, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uridine-ribohydrolase+is+a+key+regulator+in+the+uridine+degradation+pathway+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Uridine-ribohydrolase is a key regulator in the uridine degradation pathway of Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 21 (3), 876-891 (2009).</li>
<li>Jung, B., Hoffmann, C., Moehlmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+nucleoside+hydrolases+involved+in+intracellular+and+extracellular+degradation+of+purines%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis nucleoside hydrolases involved in intracellular and extracellular degradation of purines.</a> Plant Journal. 65 (5), 703-711 (2011).</li>
<li>Riegler, H., Geserick, C., Zrenner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+thaliana+nucleosidase+mutants+provide+new+insights+into+nucleoside+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis thaliana nucleosidase mutants provide new insights into nucleoside degradation.</a> New Phytologist. 191 (2), 349-359 (2011).</li>
<li>Zrenner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+analysis+of+the+pyrimidine+catabolic+pathway+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">A functional analysis of the pyrimidine catabolic pathway in Arabidopsis.</a> New Phytologist. 183 (1), 117-132 (2009).</li>
<li>Hauck, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uric+acid+accumulation+in+an+Arabidopsis+urate+oxidase+mutant+impairs+seedling+establishment+by+blocking+peroxisome+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance.</a> The Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).</li>
<li>Qu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+nucleosides%2C+nucleobases%2C+and+amino+acids+in+different+parts+of+Angelicae+Sinensis+Radix+by+ultra+high+performance+liquid+chromatography+coupled+to+triple+quadrupole+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Separation+Science%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of nucleosides, nucleobases, and amino acids in different parts of Angelicae Sinensis Radix by ultra high performance liquid chromatography coupled to triple quadrupole tandem mass spectrometry.</a> Journal of Separation Science. 42 (6), 1122-1132 (2019).</li>
<li>Zong, S. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+simultaneous+determination+of+13+nucleosides+and+nucleobases+in+Cordyceps+sinensis+by+UHPLC-ESI-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Fast simultaneous determination of 13 nucleosides and nucleobases in Cordyceps sinensis by UHPLC-ESI-MS/MS.</a> Molecules. 20 (12), 21816-21825 (2015).</li>
<li>Moravcová, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+nucleobases%2C+nucleosides%2C+and+nucleotides+using+two+zwitterionic+silica-based+monolithic+capillary+columns+coupled+with+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography.+A%22%5BJournal%5D)">Separation of nucleobases, nucleosides, and nucleotides using two zwitterionic silica-based monolithic capillary columns coupled with tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography. A. 1373, 90-96 (2014).</li>
<li>Guo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophilic+interaction+ultra-high+performance+liquid+chromatography+coupled+with+triple+quadrupole+mass+spectrometry+for+determination+of+nucleotides%2C+nucleosides+and+nucleobases+in+Ziziphus+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography.+A%22%5BJournal%5D)">Hydrophilic interaction ultra-high performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry for determination of nucleotides, nucleosides and nucleobases in Ziziphus plants.</a> Journal of Chromatography. A. 1301, 147-155 (2013).</li>
<li>Seifar, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+quantification+of+free+nucleotides+in+complex+biological+samples+using+ion+pair+reversed+phase+liquid+chromatography+isotope+dilution+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous quantification of free nucleotides in complex biological samples using ion pair reversed phase liquid chromatography isotope dilution tandem mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 388 (2), 213-219 (2009).</li>
<li>Baccolini, C., Witte, C. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMP+and+GMP+catabolism+in+Arabidopsis+converge+on+xanthosine%2C+which+is+degraded+by+a+nucleoside+hydrolase+heterocomplex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">AMP and GMP catabolism in Arabidopsis converge on xanthosine, which is degraded by a nucleoside hydrolase heterocomplex.</a> The Plant Cell. 31 (3), 734-751 (2019).</li>
</ol>

저자는 공개 할 이해상충이 없습니다.

유기체는 정경및 비정상적인 것들을 포함하는 각종 뉴클레오시드/뉴클레오티드를 포함합니다. 그러나, 그(것)들의 기원 그리고 신진 대사 끝점, 특히 수정된 뉴클레오시드는 아직도 모호합니다. 더욱이, 뉴클레오시드/뉴클레오티드 대사의 기능및 항상성에 대한 현재의 이해는 탐구되고 확장되어야 한다. 이를 조사하기 위해서는 이러한 대사 산물 식별 및 정량화를 위한 정밀하고 금본적인 방법을 채택해야 합니다. 여기서, 우리는 뉴클레오시드/뉴클레오티드 검출을 위한 질량 스펙트럼을 이용한 프로토콜을 기술했다. 예를 들어 N 1-메틸라데노신을 예로 들면, 이 방법은 0.02 ng 표준으로 낮은 것을 검출할 수 있고 교정 곡선의 정확도는 매우 높다(R2 = 0.999; 그림 4B). HPLC 방법과 비교하여 MS 기반 프로토콜은 훨씬 더 나은 검출 제한과 정확도를 제공합니다. 더 중요한 것은, 이 방법은 LC-MS/MS가 있는 생물학 실험실에 있는 연구원에 의...

뉴클레오시드/뉴클레오티드는 모든 살아있는 유기체의 중심 대사 성분으로, 핵산과 니코티나미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD)와 같은 많은 코엔자임의 전구체이며 인지질, 글리콜리오드 및 폴리삭카라이드와 같은 거대 분자의 합성에 중요합니다. 구조적으로, 뉴클레오시드는 아데닌, 구아닌, 우라실, 시토신, 또는 티민이 될 수 있는 뉴클레오베이스를 함유하고 있으며, 리보오스 또는 데옥시리보제1,2일수 있는 슈가 모에티가 있다. 뉴클레오티드는 뉴클레오시드3의슈가 모이티의 5탄소 위치에 결합하는 최대 3개의 인산염 군을 가지고 있다. 식물에서 뉴클레오티드의 물질 대사는 종자 발아 및 잎 성장에 필수적이다4,5,6. 식물 발달에서 그들의 생리적 역할을 더 잘 이해하기 위해 생체 내의 다른 뉴클레오시드/뉴클레오티드의 절대적인 정량화를 위한 방법을 확립해야 한다.
뉴클레오시드/뉴클레오티드를 측정하는 가장 일반적으로 사용되는 접근법 중 하나는 자외선가 시동(UV-VIS) 검출기4,7,8,9,10,11과결합된 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 채용한다. 2013년, HPLC를 사용하여, Dahncke및 Witte는 아라비도시스 탈리아나7에서여러 종류의 뉴클레오시드를 정량화시켰다. 그(것)들은 야생 형 식물에 비교된 과노신 deaminase 유전자에 있는 T-DNA 삽입 돌연변이 표적화에 있는 향상된 guanosine 함량을 확인했습니다. 또 다른 피리미딘 뉴클레오시드인 시티딘도 이 방법을 사용하는 식물에서 정량적으로 검출되어 보나 피데 시티딘 데아미나아제 유전자4의식별을 초래하였다. 그러나 UV 검출기에 기초하여, 이 방법은 구아노신 또는 산토신과 같은 유사한 스펙트럼 및 보존 시간을 갖는 뉴클레오시드를 쉽게 구별할 수 없다. HPLC 방법의 검출 한계는 상대적으로 높기 때문에 시티딘, 우리딘 및 구아노신과 같은 생체 내의 핵세포의 높은 함량을 측정하는 데 자주 사용된다.
또한, 질량 분광법(GC-MS)에 결합된 가스 크로마토그래피는 또한 뉴클레오시드 측정에 사용될 수 있다. 그것에서 혜택을, Hauck et. al. 성공적으로 검출 된 uridine 및 요산, 뉴 클레 오 사이드 이화 경로의 하류 대사 산물, A. thaliana의씨앗에서12. 그러나, GC는 일반적으로 휘발성 화합물을 분리하는 데 사용되지만 열음부 물질에는 적합하지 않다. 따라서, 질량 분광법(LC-MS/MS)에 결합된 액체 크로마토그래피는 아마도 뉴클레오시드/뉴클레오티드(13)및14의생체 내 식별, 분리 및 정량화를 위한 보다 적합하고 정확한 분석 기술일 것이다. 여러 이전 연구는 HILIC 컬럼이 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드분리(15,16) 및 동위원소 표지된 내부 표준에 사용될 수 있다고 보고하여 화합물 정량화(17)를 위해 사용되었다. 그러나 두 구성 요소는 상대적으로 비싸며 특히 상업용 동위원소 라벨 표준이 있습니다. 여기서는 뉴클레오시드/뉴클레오티드 측정을 위한 경제적으로 적용되는 LC-MS/MS 접근법을 보고합니다. 이 방법은 이미 ATP, N-6-메틸 AMP, AMP, GMP,우리딘, 시티딘, 및 의사요양1,5,6,18,식물 및 드로소필라를포함한 다양한 뉴클레오시드/뉴클레오티드의 양에 성공적으로 사용되어 왔다. 더욱이, 여기에서 보고하는 방법은 그밖 유기체에서또한 이용될 수 있습니다.

```html
<table>
 <tbody>
 <tr>
 <td>아세토니트릴</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>1000291000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>아데노신</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A9251-1G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>암모늄 아세테이트</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>73594-100G-F</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>AMP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>01930-5G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CMP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C1006-500MG</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>시티딘</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C122106-1G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GMP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G8377-500MG</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>구아노신</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G6752-1G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hypercarb 컬럼</td>
 <td>Thermo Fisher Scientific GmbH</td>
 <td>35005-054630</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IMP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>57510-5G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>이노신</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>I4125-1G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>메탄올</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>34860-1L-R</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>N1-메틸아데노신</td>
 <td>Carbosynth</td>
 <td>NM03697</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>O6-메틸구아노신</td>
 <td>Carbosynth</td>
 <td>NM02922</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>무라시게와 스코그 배지</td>
 <td>Duchefa Biochemie</td>
 <td>M0255.005</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polaris 5 C18A 컬럼</td>
 <td>Agilent Technologies</td>
 <td>A2000050X046</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>유사유리딘</td>
 <td>Carbosynth</td>
 <td>NP11297</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>UMP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>U6375-1G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>유리딘</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>U3750-1G</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
```

hplc-ms/ms를 사용하여 뉴클레오시드/뉴클레오티드 함량 측정을 위한 식물 샘플 준비

Plant Sample Preparation for Nucleoside/Nucleotide Content Measurement with An HPLC-MS/MS

뉴클레오시드/뉴클레오티드는 많은 세포 활동에 관여하는 핵산, 코기타산 및 코엔자임, 세포 신호 분자 및 에너지 운반선의 구성 요소입니다. 여기서, 우리는 식물에서 뉴클레오시드/뉴클레오티드 함량의 절대적 자격을 위한 신속하고 신뢰할 수 있는 방법을 설명한다. 간단히, 균질화된 식물 물질의 100 mg은 추출 버퍼 (메탄올, 아세토나이트 및 물의 비율로 2:2:1)로 추출되었다. 나중에, 시료는 동결 건조기에서 5회 농축된 다음 HPLC-MS/MS. 뉴클레오티드로 주입되어 다공성 흑연 탄소(PGC) 컬럼및 뉴클레오시드를 C18 컬럼상에 분리하였다. 각 뉴클레오시드와 뉴클레오티드의 질량 전이는 질량 분석법에 의해 모니터링되었다. 뉴클레오시드와 뉴클레오티드의 내용물은 그들의 외부 표준(ESTDs)에 대하여 정량화되었다. 따라서 이 방법을 사용하여 연구자들은 다른 식물에서 뉴클레오시드/뉴클레오티드를 쉽게 정량화할 수 있습니다.

여기서, 우리는 2주 된 아라비도시스 야생 형 (Col-0) 모종에서 알려진 수정 된 뉴클레오시드 인 N1-메틸라데로신의 식별 및 정량화를 예로 들 수 있습니다. 질량 분석 프로파일은 N 1-메틸라데로신 표준으로부터 생성된 제품 이온이 150m/z 및 133m/z(도2A)이며동일한 프로파일도 Col-0 추출(도2B)에서관찰된다는 것을 나타낸다. 150m/z의 높은 제품 이온으로 인해 282.1에서 150(m/z)의 질량 전환이N 1-메틸라데노신 정량화에 선택됩니다. 또한, 목표피크(도 3B)의보유 시간(RT)은 7.05분이며, 이는 N 1-메틸라데로신 표준(도3A)의RT와 동일하다.<s...

식물에서 생체 내 뉴클레오시드/뉴클레오티드 정량화를 위한 정밀하고 재현 가능한 방법은 여기에 설명된다. 이 방법은 HPLC-MS/MS를 사용합니다.

HPLC-MS/MS를 사용하여 뉴클레오시드/뉴클레오티드 함량 측정을 위한 식물 샘플 준비

Nucleosides/nucleotides are building blocks of nucleic acids, parts of cosubstrates and coenzymes, cell signaling molecules, and energy carriers, which ...

뉴클레오시드와 뉴클레오티드는 모든 살아있는 유기체의 중심 대사 구성 요소입니다. 그(것)들의 물질 대사는 세포 발달을 위해 요구됩니다. 이 방법은 이러한 대사 산물의 정량화를 위한 강력한 도구를 제공합니다.이 방법은 식물에서 뉴클레오시드와 뉴클레오티드의 신속하고 정확한 정량화를 허용한다. 완전한 샘플 사전 처리 및 LC-MS/MS 분석은 10~20개의 샘플 세트에 약 2일이 소요됩니다. 이 방법은 모든 식물과 다른 유기체에도 적용 될 수있다.절차를 시연하는 것은 첸 연구소의 부교수인 창화 주(Changhua Zhu)가 될 것입니다. 식물을 재배하려면 아라비도시스 씨앗을 70%에탄올로 살균하여 1/2 강도의 무라시게와 스쿠그 영양소로 한천 접시에 뿌려야 합니다. 48시간 동안 어둠 속에서 판을 배양한 다음 섭씨 22도에서 16시간 이하의 통제된 성장챔버로 옮기고, 섭씨 20도에서 8시간 동안 어두워집니다.2주 모종의 100밀리그램을 수확하고 대사산물 추출을 위해 액체 질소로 동결하십시오. 60 Hertz의 주파수에서 5 분 동안 사전 냉각 믹서 밀에 7 ~ 8 개의 강철 구슬로 냉동 식물 조직의 100 밀리그램을 분쇄하십시오. 메탄올, 아세토닐릴 및 물을 2대 2대 1의 비율로 포함하는 추출 용액을 준비합니다.추출 용액의 1 밀리리터로 균질화된 물질을 다시 중단합니다. 결과용 액액을 섭씨 4도에서 12, 000 XG에서 15분 동안 원심분리한 다음, 서스펜션0.5 밀리리터를 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 액체 질소로 동결합니다. 냉동 건조기에서 냉동 샘플을 증발시키고 5 %의 아세토나이트와 95 %의 물로 0.5 밀리리터로 재보힙합니다.4, 000 XG에서 4°C에서 10분 동안 생성된 용액을 원심분리합니다. LC-MS/MS 측정을 위해 상체를 바이알에 적재합니다. 10 밀리머라 암모늄 아세테이트 버퍼를 2리터의 이중 분해수에 1.5그램의 암모늄 아세테이트를 용해시켜 준비합니다.10%의 암모늄과 아세테이트산으로 pH를 9.5로 조정합니다. 뉴클레오시드 측정을 위해 초순수 100% 메탄올 2리터를 준비한 다음 뉴클레오티드 측정을 위해 초순수 아세토나이트 2리터를 준비합니다. 이전에 준비된 각 시료의 전처리된 대사산물 추출에 대해 0.02 밀리리터를 트리플 쿼드러플 질량 분광계와 결합한 이진 펌프를 HPLC 시스템에 주입합니다.표준 교정 곡선을 생성하려면 6개의 샘플 추출을 함께 풀링하고 혼합물을 소용돌이쳐

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

급진적 기반 biomimetic 화학은 biomarker 개발에 필요한 건물 업 라이브러리에 적용되었습니다.

화학 생물학에서의 자유 부수 : 화학 행동의 Biomarker 개발에

여기에 설명 된 프로토콜은 수정 된 뉴 클레오 사이드 트리 포스페이트로 이어지는 복잡한 경로의 방법으로 다양한 장애물을 설명하고 요약하다하는 것을 목표로하고있다. 따라서,이 프로토콜은 이러한 활성화 된 빌딩 블록의 합성과 실제 응용 프로그램의 가용성 모두를 용이하게합니다.

뉴 클레오 사이드 트리 포스페이트 - 합성에서 생화학 적 특성에

식물 바이오 매스 연료, 사료, 음식과 다양한 재료를 포함한 여러 제품에 대한 재생 가능한 자원을 제공합니다. 본 논문에서 우리는 담배 나무 (는 담배 glauca)과 바이오 리파이너리 파이프 라인 포플러으로 적합 소스의 속성을 조사합니다.

바이오 기반 산업을위한 원료로 담배 나무와 포플러의 평가에 대한 성적 증명서 및 대사 산물 프로파일

여기에 설명된 프로토콜은 다양한 조건에서 배양된 만성 림프구성 백혈병(CLL) 세포의 퓨린 대사를 측정하기 위해 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)를 사용하는 쉽고 재현 가능한 방법을 나타냅니다.

HPLC 기반 분석은 인간의 만성 림프 구성 백혈병 세포에 세포 외 뉴클레오티드 / 뉴 클레오 시드 신진 대사를 모니터링하기

우리는 RNA 의무적인 단백질을 확인 하 고 중재 하는 UV photocrosslinking 및 질량 분석을 사용 하 여 라이브 셀에서 그들의 RNA 바인딩 영역 지도를 프로토콜을 설명 합니다.

질량 분석 기반 식별 RNA 바인딩 영역에 대 한 샘플 준비

우리는 마우스 배아 줄기 세포 배양에 대 한 두 개의 화학 기반 프로토콜 자세히 설명 합니다. 이 새로운 메서드 (비타민 C)에 의해 Tet 중재 산화를 촉진 하 고 DNA hypomethylation 마우스 배아 줄기 세포의 pluripotency를 유지 하기 위해 5-methylcytosine (PD0325901)에 의해의 de novo 종합 억압의 시너지 메커니즘을 활용 합니다.

MEK 억제제 PD0325901와 비타민 C를 사용 하 여 마우스 배아 줄기 세포의 게놈 Hypomethylation 유지 하는 대안 문화 방법

여기, 우리는 활성 태그 인간의 효율적인 단일 단계 정화에 대 한 프로토콜 10-11 전 2 (TET2) 제시 5-methylcytosine dioxygenase 이온-교환 크로마토그래피와 액체 크로마토그래피 탠덤 질량을 사용 하 여 그 분석 결과 사용 하 여 분석 (LC-MS/MS)-기반 접근.

효율적인 정화와 10-11 전-2 5-Methylcytosine Dioxygenase에 대 한 LC-MS/MS 기반 분석 결과 개발

우리는 병 변의 민감하고 정확한 정량화를 위한 방법을 여기에 설명 합니다. 8-옥 소-7, 8 디 하이드로 deoxyguanosine),1n6조-2-deoxyadenosine 및1, n6조-2dado deoxyguanosine (1,n2-dguo) DNA에. 이 방법은 노출 된 A/J 마우스의 조직 (폐, 간 및 신장)에서 주변 미세 미 립 자 물질 (PM2.5)의 영향에 대 한 평가에 적용 되었다.

질량 분 광 법에 의해 3 개의 DNA 병 변의 정량화 및 주변 미세 입자 상 물질에 노출 된 마우스의 조직에서 그들의 수준에 대 한 평가

여기에서는 cDNA 중간체 없이 짧은 RNA(실행당 &lt;35nt)를 염기서열분석하는 직접 방법과 단일 염기 정밀도에서 단일 연구에서 다른 뉴클레오티드 변형을 염기서열분석하는 일반적인 방법으로 사용할 수 있는 LC-MS 기반 염기서열분석 방법에 대한 자세한 프로토콜에 대해 설명합니다.

2D-HELS MS 염기서열분석(2D-HELS MS SEQ): 뉴클레오티드 변형이 다른 RNA 혼합물의 직접 및 새로운 염기서열분석을 위한 일반적인 LC-MS 기반 방법

이 프로토콜에서는 많은 샘플의 효율적이고 빠른 샘플 준비를 결합한 최적화된 워크플로를 제시합니다. 또한, 대사 GWAS 연구의 고처리량 평가를 위한 분석 변형을 줄이기 위한 단계별 가이드를 제공합니다.

대규모 다중 오믹스 게놈 전체 연관 연구 (Mo-GWAS) : 샘플 준비 및 정상화에 대한 지침

RNA의 전사 후 변형은 최근에 중추 신경계 가소성과 관련이있는 번역 조절의 과소 연구 된 층을 나타냅니다. 여기에서, 샘플 준비 및 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분광법 접근법은 단일 뉴런에서 수많은 RNA 변형의 동시 특성화를 위해 기술된다.

질량 분광법을 사용하여 단일 뉴런의 RNA 변형 특성화

배우세요 HPLC-MS/MS를 사용하여 식물 샘플에서 뉴클레오시드와 뉴클레오티드를 정량 분석하는 방법을. 이 기법은 신속하고 정확하며 다양한 생물체에 적용 가능하여 식물 대사 연구에 필수적인 도구입니다.

HPLC-MS/MS를 사용하여 뉴클레오시드/뉴클레오티드 함량 측정을 위한 식물 샘플 준비

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