Name: Ca2+ 과도 현상 및 L형 칼슘 전류의 동시 측정을 위한 고품질 쥐 심방 및 심실 근세포의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: 배우세요 랑겐도르프 관류법을 이용하여 쥐 심방 및 심실 심근세포를 고품질로 분리하고 Ca²⁺ 과도 현상과 L형 칼슘 전류를 동시 측정하는 방법을. 이 기술은 부정맥 발생 기전 연구에 필수적입니다.

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이 연구는 독일 연구 재단 (DFG; 혈관 의학의 임상의 과학자 프로그램(PRIME), MA 2186/14-1 to P. Tomsits 및 D. Schüttler; VO1568/3-1, IRTG1816 및 SFB1002 프로젝트 A13 to N. Voigt), 독일 우수 전략(Excellence Strategy)에 따른 독일 연구 재단(EXC 2067/1- 390729940 to N. Voigt), 독일 심혈관 연구 센터(German Centre for Cardiovascular Research, DZHK; 81X2600255 to S. Clauss and N. Voigt; 81Z0600206 to S. Kääb), 코로나 재단(Corona Foundation) (S199/10079/2019 to S. Clauss), 심혈관 질환에 관한 ERA-NET (ERA-CVD; 01KL1910 to S. Clauss), Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (S. Clauss에게) 및 Else-Kröner-Fresenius 재단 (EKFS 2016_A20에서 N. Voigt까지). 자금 제공자는 원고 준비에 아무런 역할도 하지 않았습니다.

모든 동물 절차는 니더작센 동물 검토 위원회(LAVES, AZ-18/2900)의 승인을 받았으며 동물 복지에 대한 모든 제도적, 국가적 및 국제 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 사전 준비
<ol><li>1L의 10x 관류 완충액(표 1), 500mL의 1x 관류 완충액(표 2), 50mL의 소화 완충액(표 3), 10mL의 정지 완충액(표 4), 1L의 Tyrode 용액(표 5), 10mL의 각 칼슘 단계 용액(포도당 및 표시된 각 양의 칼슘을 포함하는 Tyrode 용액)을 준비하고, 제공된 레시피에 따라 1L의 4-AP 용액(표 5), 100mL의 피펫 용액(표 6) 및 5mL의 플루론산. 참고: 목욕 용액(Tyrode 및 4-AP 용액)은 미리 준비하여(포도당 없이) +4°C에서 보관할 수 있으며 실험 당일에 포도당을 첨가합니다. 피펫 용액은 -20°C에서 보관할 수 있으며, 칼슘 지시약은 실험 당일에 첨가하고, 용액은 그 후 추가 사용 시까지 얼음 위에 보관한다. 10x 관류 완충액은 실온에서 보관할 수 있으며, 1x 관류 완충액, 소화 완충액 및 정지 완충액은 실험 당일에 새로 준비해야 합니다.</li>
	<li>수조와 롤러 펌프를 켭니다.</li>
	<li>Langendorff 장치를 관류 완충액으로 미리 채우십시오. 공기가 없는지 확인하십시오.</li>
	<li>대동맥 캐뉼라를 해부 현미경으로 고정하여 준비하고 관류 완충액으로 채워진 1mL 주사기에 연결하고 캐뉼라를 헹구어 공기를 맑게 합니다. 알림: 관류 시스템 내부의 공기는 관상 동맥 관류에 직접적인 영향을 미치므로 소화 효과에 직접적인 영향을 미치므로 피하는 것이 중요합니다. 공기 트래핑을 안전하게 방지하기 위해 필요한 경우 설정에 버블 트랩을 추가할 수 있습니다.</li>
	<li>장기 수집 및 현미경 검사를 위한 충분한 관류 완충액으로 페트리 접시를 준비합니다(완충액은 전체 장기를 단단히 덮어야 하며 사용된 페트리 접시 크기에 따라 몇 밀리리터이면 충분해야 함).</li>
	<li>조직 해리 및 현미경 검사를 위한 소화 완충액이 있는 3개의 페트리 접시를 준비하고, 완충액은 각 페트리 접시 내에서 현미경으로 해부할 장기를 덮어야 하며, 양은 사용된 페트리 접시 크기에 따라 다릅니다. 해리를 위해 심실 조직의 경우 3mL, 심방 조직의 경우 1.5mL를 사용합니다.</li>
</ol>2. 장기 적출
<ol><li>27G 캐뉼라가 있는 1mL 주사기를 사용하여 0.1mL의 헤파린(1,000U/mL) i.p.를 마우스에 주입하고 5-10분 동안 기다립니다.</li>
	<li>마우스를 약 500μL의 이소플루란에 담근 작은 조직과 함께 유도 챔버에 넣습니다. 동물은 조직과 접촉해서는 안됩니다. 이를 피하기 위해 플라스틱 생검 내장 카세트를 사용하여 조직을 덮을 수 있습니다. 동물이 완전히 마취되면 발가락 꼬집음 반사를 확인하고 더 이상 존재하지 않는 즉시 자궁 경부 탈구로 마우스를 신속하게 안락사시킵니다.</li>
	<li>마우스를 뒤쪽의 플랫폼(예: 종이 타월로 덮인 스티로폼 위)에 놓고 캐뉼라로 발을 고정하여 제자리에 고정합니다.</li>
	<li>가슴과 복부의 일부를 덮고있는 모피와 피부를 제거하고 jugulum에서 symphysis쪽으로 명확한 절개로 제거하고 가위를 사용하여 장기 구조를 손상시키지 않고 xiphoid 바로 아래에서 복부를 엽니 다. 수술용 집게로 흉골을 들어 올리고 갈비뼈 가장자리를 따라 가위로 횡격막을 자른 다음 내측 겨드랑이 라인에서 갈비뼈를 자르고 흉곽을 제거하여 심장을 노출시킵니다.</li>
	<li>뭉툭한 집게를 사용하여 심낭을 조심스럽게 제거하고 아래에서 뭉툭한 집게로 들어 올리고 가위를 사용하여 한 번의 절단으로 큰 혈관을 절단하여 심장을 빠르게 제거합니다.</li>
	<li>심장을 실온 관류 완충액에 넣고 현미경으로 뭉툭한 끝 바늘로 대동맥을 가능한 한 빨리 캐뉼러냅니다. 알림: 장기에 부착된 폐 조직과 지방 조직을 너무 많은 시간을 낭비하지 않고 제거하십시오. 캐뉼러를 삽입하는 동안 바늘 끝이 대동맥 판막을 통해 확장되지 않도록 하면 완충액이 관상 동맥으로 들어가는 것을 방지하여 결과를 손상시킬 수 있습니다.</li>
	<li>봉합 실크 조각으로 심장을 바늘에 단단히 묶고 주사기에서 분리하십시오. 참고: 심장을 채취하는 것(큰 혈관이 절단되는 순간)부터 대동맥을 바늘에 봉합할 때까지의 전체 절차는 가능한 한 적은 시간이 소요됩니다. 관류가 시작될 때까지 심장을 제거하는 데 90-180초 이상 걸리지 않는 것이 좋습니다.</li>
</ol>3. 효소 소화
<ol><li>대동맥 캐뉼라 삽입 후, 캐뉼러 된 심장을 즉시 Langendorff 장치에 연결하여 공기가 시스템에 유입되지 않도록하십시오. 알림: Langendorff 장치 하단에 관류 완충액 한 방울을 매달고 바늘 상단에 관류 완충액 한 방울을 놓아 시스템에 공기가 유입되는 것을 방지하는 데 도움이 될 수 있습니다.</li>
	<li>정확히 37°C의 온도와 정확히 4mL/분의 관류 속도에서 1분 동안 관류 완충액으로 심장을 관류합니다. 참고: 관류 바늘 끝의 온도가 37°C가 되려면 수조 온도를 약 40°C보다 약간 높게 설정해야 합니다. 이것은 관류 팁의 온도를 측정하여 정기적으로 테스트해야 합니다.</li>
	<li>정확히 37°C의 온도와 정확히 4mL/분의 관류 속도에서 정확히 9분 동안 관류를 소화 완충액으로 전환합니다.</li>
	<li>소화된 심장을 완전히 덮을 수 있도록 충분한 소화 완충액이 있는 페트리 접시에 옮깁니다. 그런 다음 현미경으로 심방과 심실을 조심스럽게 해부하십시오.</li>
	<li>심방을 1.5mL의 소화 완충액이 있는 페트리 접시에 옮기고 심실을 3mL의 소화 완충액이 있는 다른 페트리 접시에 옮깁니다.</li>
	<li>심방 박리<ol><li>조심스럽게, 그러나 시간을 낭비하지 않고, 뭉툭한 집게를 사용하여 심방을 작은 조각으로 떼어 내십시오.</li>
		<li>팁 입구를 넓히기 위해 이전에 절단한 1,000μL 피펫 팁을 사용하여 조심스럽게 위아래로 피펫팅하여 조직을 용해합니다.</li>
		<li>용액을 15mL 원심분리기 튜브로 옮기고 튜브 측면에서 조심스럽게 피펫팅하여 동일한 양의 정지 완충액(1.5mL)을 추가하여 반응을 종료합니다.</li>
		<li>3mL의 세포/조직 용액을 모두 200μm 나일론 메쉬에 조심스럽게 통과시켜 완전히 소화되지 않은 나머지 더 큰 조직 조각을 제거합니다. 알림: 소화가 성공하면 단단한 덩어리가 거의 남지 않습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>심실 박리<ol><li>해부 가위와 피펫을 위아래로 사용하여 심실 조직을 작은 조각으로 빠르게 잘라 용해시킵니다. 위아래로 피펫팅을 위해 다른 1,000μL 피펫 팁을 사용하고, 개구부를 넓히기 위해 단축할 수 있습니다.</li>
		<li>세포/조직 용액을 15mL 원심분리기 튜브로 옮기고 튜브 측면에서 조심스럽게 피펫팅하여 동일한 양의 정지 완충액(3mL)을 추가하여 반응을 종료합니다.</li>
		<li>6mL의 모든 세포/조직 용액을 200μm 나일론 메쉬에 조심스럽게 통과시켜 완전히 소화되지 않은 더 큰 조직 조각을 제거합니다. 알림: 소화가 성공하면 단단한 덩어리가 거의 남지 않습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>두 튜브(심방 및 심실 세포 현탁액)를 실온에서 6분 동안 벤치에 두어 안정시킵니다.</li>
	<li>두 15mL 튜브를 5 x g 에서 2분 동안 원심분리합니다.</li>
</ol>4. 칼슘 재도입
참고: 다음 단계는 심방 및 심실 세포 모두에 대해 동일하며(달리 언급되지 않는 한) 실온에서 수행됩니다.
<ol><li>플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층액을 버리고 칼슘이 없는 티로드 용액 10mL에 펠릿을 조심스럽게 재현탁합니다.</li>
	<li>침전을 위해 세포를 8분 동안 그대로 두십시오.</li>
	<li>5 x g 에서 1 분 동안 원심 분리합니다 (심방 세포 만, 심실 세포에는 침전으로 충분합니다).</li>
	<li>상층액을 버리고 100μM 칼슘 농도의 Tyrode 용액 10mL에 펠릿을 조심스럽게 재현탁합니다.</li>
	<li>침전을 위해 세포를 8분 동안 그대로 두십시오.</li>
	<li>5 x g 에서 1 분 동안 원심 분리합니다 (심방 세포 만, 심실 세포에는 침전으로 충분합니다).</li>
	<li>상층액을 버리고 400μM 칼슘 농도의 티로드 용액 10mL에 펠릿을 조심스럽게 재현탁합니다.</li>
	<li>침전을 위해 세포를 8분 동안 그대로 두십시오.</li>
	<li>5 x g 에서 1 분 동안 원심 분리합니다 (심방 세포 만, 심실 세포에는 침전으로 충분합니다).</li>
	<li>상층액을 버리고 펠릿을 1mM 칼슘 농도의 티로드 용액 5mL(심방)/1mL(심실)에 조심스럽게 재현탁합니다.</li>
</ol>5. 형광 칼슘 지표 Fluo-3 AM으로 근세포 로딩
알림: 형광 칼슘 표시기의 감광성으로 인해 다음 단계는 빛으로부터 보호되어야 합니다(예: 튜브를 알루미늄 호일로 덮음).
<ol><li>무수 DMSO에 20% 플루로닉 F-127 44μL를 50μg의 Fluo-3AM에 첨가하여 Fluo-3 AM 원액을 준비합니다(빛으로부터 보호되는 -20°C에서 보관 가능).</li>
	<li>10 μL의 Fluo-3 AM 원액을 1 mL의 세포 현탁액에 첨가하고 빛으로부터 보호되는 실온에서 10 분 동안 배양합니다.</li>
	<li>5 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 상청액을 버리고 펠릿을 적절한 양의 목욕 용액에 재현탁하여 좋은 작업 농도(세포 밀도에 따라 1-5mL의 목욕 용액)를 얻습니다.</li>
	<li>실험을 시작하기 전에 에스테르 제거를 위해 30분 동안 그대로 두십시오.</li>
</ol>6. 앞서 설명한 바와 같이 동시 패치 클램프 및 epifluorescent Ca2+-과도 측정16
알림: 패치 clamp 측정은 이 기사의 주제가 아니며 관심 있는 독자는 이 방법 17,18,19,20,21,22에 대한 자세한 설명을 제공하는 주요 간행물을 참조할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 더 나은 전반적인 이해를 위해, 현재 유도된 칼슘 과도 현상과 함께 L형 칼슘 전류를 측정하기 위한 프로토콜에 대한 요약이 제공된다.
<ol><li>근세포를 세포 챔버로 옮기고 37°C에서 수조 용액으로 슈퍼퓨즈합니다.</li>
	<li>표 5에 표시된 대로 4-아미노피리딘과 염화바륨을 수조 용액에 첨가하여 칼륨 전류를 차단합니다.</li>
	<li>붕규산 미세 전극의 팁 저항이 피펫 용액으로 채워진 2-5MΩ인지 확인합니다(표 6).</li>
	<li>전기 신호와 에피형광을 동시에 기록할 수 있도록 측정을 설정합니다. 전압 클램프 모드는 전지를 -80mV로 유지하고 600ms의 램프 펄스를 -40mV로 유지하여 빠른 Na+ 전류를 비활성화한 다음 0.5Hz에서 +10mV까지 100ms 테스트 펄스를 유지하는 프로토콜로 L형 Ca2+ 전류를 측정하는 데 사용됩니다(그림 2).</li>
	<li>488 nm에서 여기, &lt;520 nm에서 방출된 빛을 사용하여 검출하고 [Ca2+]I 로 변환한다고 가정합니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61964/61964equ01.jpg"> 여기서 kd = Fluo-3 (864 nM)의 해리 상수, F = Fluo-3 형광; Fmax =Ca2+-포화 형광은 각 실험종료 시 얻어진다 19.</li>
</ol>

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<li>Chugh, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Worldwide+epidemiology+of+atrial+fibrillation%3A+a+global+burden+of+disease+2010+study%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Worldwide epidemiology of atrial fibrillation: a global burden of disease 2010 study.</a> Circulation. 129 (8), 837-847 (2014).</li>
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<li>Kirchhof, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2016+ESC+Guidelines+for+the+management+of+atrial+fibrillation+developed+in+collaboration+with+EACTS%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">2016 ESC Guidelines for the management of atrial fibrillation developed in collaboration with EACTS.</a> European Heart Journal. 37 (38), 2893-2962 (2016).</li>
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<li>Clauss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+arrhythmia%3A+classic+electrophysiology+to+genetically+modified+large+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals.</a> Nature Reviews. Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).</li>
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이 기사는 동시 칼슘 과도 기록과 함께 패치 클램프 연구를 위해 동일한 마우스에서 고품질 심방 및 심실 근세포를 얻을 수 있는 쉽고 기능적인 방법을 제공합니다. 얻어진 데이터의 품질은 세포 분리의 품질에 크게 의존한다. 상기 언급한 바와 같이, 쥐 심근세포를 단리하는 많은 방법들이 이전에 기술되었다 9,10,11,12. 분리된 세포는 패치 클램프 실험에서 수축성 연구, 형태학적 연구, 단백질체학, 미토콘드리아 기능 연구 등에 이르기까지 다양한 분석에 사용됩니다. 각각의 개별 목적에는 다르게 최적화된 분리된 셀이 필요합니다. 이로 인해 어떤 프로토콜도 한 마우스에서 심방 및 심실 근세포의 칼슘 처리 특성을 동시에 측정하는 패치 클램프 실험에 적합한 고품질 분리로 이어지지 않았습니다. 이를 변경하기 위해 ...

심장 부정맥은 흔하며 전 세계 수백만 명의 사람들에게 영향을 미치기 때문에 현재 주요 의료 문제 중 하나입니다. 부정맥은 높은 이환율 및 사망률과 관련이 있으며1,2 대부분의 심장 돌연사3의 근본 원인이다. 최신 치료 옵션은 환자 생존율을 향상시켰지만 여전히 기본 메커니즘을 표적으로 삼기보다는 주로 대증 치료입니다. 따라서, 이러한 치료법은 효능이 제한적이며 종종 심각한 부작용을 일으킬 수 있다 4,5,6. 현재 치료 옵션을 개선하려면 근본적인 병태생리학에 대한 통찰력이 필요하므로 연구에 적합한 모델이 필요합니다. 작은 동물 모델, 특히 마우스 모델은 부정맥 생성의 주요 메커니즘, 예를 들어 세포 전기 생리학, 이온 채널 기능 또는 칼슘 처리에 대한 유전 적 영향을 연구 할 수 있기 때문에 부정맥 연구에서 중요한 역할을합니다 7,8.
이를 위해서는 충분한 양과 생존력을 가진 고립 된 심방 및 심실 심근 세포가 필요합니다. 심방 및 심실 근세포를 얻기 위한 다양한 분리 접근법의 광범위한 스펙트럼이 이전에 설명되었으며9,10,11,12,13 일부 그룹은 심방 14 또는 심실 15에서 L형 전류 및 칼슘 전류 유도 칼슘 과도 현상의 동시 측정 데이터를 제시했습니다 쥐 심근 세포. 그러나 우리가 아는 한 동물의 심방 및 심실 측정에 대한 데이터는 없습니다. 연구자들은 전기생리학에서 단백질체학, 세포 수축성 또는 단백질 상호 작용과 같은 기능 연구, 미토콘드리아 기능 또는 유전학에 이르기까지 다양한 주제에 중점을 두고 있으며, 이 모든 것은 분리된 심근 세포를 필요로 합니다. 따라서 발표된 프로토콜 중 다수는 패치 클램프 연구를 위해 특별히 개발되지 않았기 때문에 패치 클램프 연구를 위한 수율이 제한되고 세포 품질이 불충분했습니다. 따라서 한 동물에서 분리된 심방 및 심실 세포의 동시 패치 클램프 및 칼슘 과도 측정은 확립된 프로토콜로 수행할 수 없습니다.
패치 클램프 실험을 위한 쥐, 특히 심방 근세포의 분리는 여전히 어려운 과제입니다. 이 기사는 역행 효소 기반 Langendorff 관류를 통해 고품질 쥐 심방 및 심실 근세포를 분리하는 간단하고 빠른 방법을 제공하며, 이를 통해 한 동물에서 순 막 전류와 전류 유도 칼슘 과도 현상을 동시에 측정할 수 있습니다. 이 기사는 야생형 마우스와 유전적 돌연변이를 가진 마우스에서 파생된 심방 및 심실 근세포의 분리를 위한 프로토콜을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 수컷과 암컷 마우스 모두에 사용할 수 있습니다. 아래에 기술된 근세포 분리, 이미지 및 대표적인 결과는 6개월(± 1)개월의 야생형 C57Bl/6 마우스에서 얻었습니다. 그럼에도 불구하고, 이 프로토콜은 상이한 유전자형을 갖는 2개월에서 24개월에 이르는 다양한 연령의 마우스에 성공적으로 사용되었다. 그림 1 은 효소 관류 중 캐뉼러화된 심장의 분리 설정 및 확대 사진을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>2,3-부탄디온 단독심</td><td>시그마-알드리치</td><td>31550</td><td></td></tr><tr><td>27G 캐뉼라</td><td>Servoprax</td><td>L10220</td><td></td></tr><tr><td>4-아미노피리딘</td><td>시그마-알드리치</td><td>A78403</td><td></td></tr><tr><td>무수 DMSO</td><td>시그마-알드리치</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>대동맥 캐뉼라</td><td>Radnoti</td><td>130163-20</td><td></td></tr><tr><td>BaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342920</td><td></td></tr><tr><td>무딘 수술 겸자</td><td>Kent Scientific</td><td>INS650915-4</td><td></td></tr><tr><td>소 송아지 혈청</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12133C</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>순환 온수 수조</td><td>Julabo</td><td>ME</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐분해효소 유형 II</td><td>Worthington</td><td>LS994177</td><td></td></tr><tr><td>분산 가위</td>, <td>Kent Scientific</td><td>INS600124</td><td></td></tr>, <tr><td>DL-aspartat K+-salt</td><td>, Sigma-Aldrich</td>, <td>A2025</td><td></td></tr>, <tr><td>EGTA</td><td>, Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr>, <tr><td>Fluo-3</td>, <td>Invitrogen</td><td>F3715</td><td></td></tr>, <tr><td>Fluo-3 AM</td>, <td>Invitrogen</td><td>F1242</td><td></td></tr>, 포도당, <tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>구아노신 5&prime;-triphosphate tris salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9002</td><td></td></tr><tr><td>가열 코일</td><td>Radnoti</td><td>158821</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Ratiopharm</td><td>25.000 IE/5ml</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9136</td><td></td></tr><tr><td>유도 챔버</td><td>CWE incorporated</td><td>13-40020</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Cp-pharma</td><td>1214</td><td></td></tr><tr><td>재킷 심장 챔버</td><td>Radnoti</td><td>130160</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1049360250</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>MgCl x 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0250</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 x 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9397</td><td></td></tr><tr><td>Na2ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 x 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>나일론 메쉬(200 &마이크로; m)</td> <td>VWR-Germany</td><td>510-9527</td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z331759</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Thermo Fisher</td><td>150318</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic Acid F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Probenecid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8761</td><td></td></tr><tr><td>롤러 펌프</td><td>Ismatec</td><td>ISM597D</td><td></td></tr><tr><td>외과 겸자</td><td>Kent Scientific</td><td>INS650908-4</td><td></td></tr><tr><td>수술용 가위</td><td>Kent Scientific</td><td>INS700540</td><td></td></tr><tr><td>봉합 실크</td><td>Fine Science Tools</td><td>NC9416241</td><td></td></tr><tr><td>주사기</td><td>Merck</td><td>Z683531-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Taurin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86330</td><td></td></tr></tbody></table>

ca2+ 과도 현상 및 l형 칼슘 전류의 동시 측정을 위한 고품질 쥐 심방 및 심실 근세포의 분리

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

마우스 모델은 부정맥 연구에서 중요한 역할을 하며 변경된 이온 채널 기능 및 칼슘 처리를 포함한 부정맥 생성의 주요 메커니즘을 연구할 수 있습니다. 이를 위해 고품질의 심방 또는 심실 심근 세포는 패치 클램프 측정을 수행하거나 칼슘 취급 이상을 탐색하는 데 필요합니다. 그러나 현재 격리 프로토콜에 의해 얻어진 고품질 심근 세포의 제한된 수율은 동일한 마우스에서 두 측정을 모두 허용하지 않습니다. 이 기사에서는 역행성 효소 기반 Langendorff 관류를 통해 고품질 쥐 심방 및 심실 근세포를 분리하여 한 동물에서 칼슘 과도 현상 및 L형 칼슘 전류를 동시에 측정하는 방법을 설명합니다. 마우스 심장을 채취하고, 대동맥을 빠르게 캐뉼라 화하여 혈액을 제거합니다. 그런 다음 심장은 처음에 칼슘이 없는 용액(37°C)으로 관류되어 삽입된 디스크 수준에서 조직을 해리한 다음 세포외 기질(37°C)을 파괴하기 위해 칼슘이 거의 포함되지 않은 효소 용액으로 관류합니다. 소화 된 심장은 이후 심방과 심실로 해부됩니다. 조직 샘플을 작은 조각으로 잘게 썰고 위아래로 조심스럽게 피펫팅하여 용해시킵니다. 효소 소화가 중단되고 세포가 생리적 칼슘 농도로 단계적으로 재도입됩니다. 형광 Ca2+ 지시약으로 로딩 한 후, 칼슘 전류와 과도 현상을 동시에 측정하기 위해 분리 된 심근 세포를 준비합니다. 또한, 분리 함정이 논의되고, 위에서 설명한 바와 같이 분리된 심방 및 심실 쥐 근세포에서 동시 칼슘 과도 측정과 함께 L형 칼슘 전류의 패치 클램프 프로토콜 및 대표적인 흔적이 제공됩니다.

분리 수율은 칼슘 재도입 후 10 μL의 세포 현탁액을 현미경 슬라이드에 피펫팅하여 측정합니다. 심방 세포 분리를 위한 100개 이상의 생존 가능한 막대 모양의 비수축 세포/10μL 및 심실 세포 분리를 위한 1,000개 이상의 생존 가능한 막대 모양의 비수축 세포/10μL가 충분한 수율로 간주되며 일반적으로 이 프로토콜을 사용하여 얻습니다. 이 프로토콜로 얻은 심방 세포는 심장 전도 시스템의 세포, 특히 부비동 결절뿐만 아니라 우심방 및 좌심방의 다른 근세포 및 심방 부속기를 포함하는 다양한 세포 유형을 보여주었습니다. 이 영역은 개별적으로 해부되지 않기 때문에 다양한 세포 형태가 생성됩니다. 모든 심방 세포는 작으며 세포 커패시턴스 범위는 약 35 pF-100 pF이며 일부는 다른 것보다 더 줄무늬입니다. 그림 3 패널 A는 이 프로토콜로 얻은 측정에 사용할 준비가 된 칼슘 민감성 염료가 로드된 심방 작동 심근의 일반적인 세포를 보여줍니다. 심실 근세포는 100에서 약 4...

마우스 모델을 사용하면 부정맥 발생의 주요 메커니즘을 연구 할 수 있습니다. 이를 위해 패치 클램프 측정을 수행하기 위해 고품질 심근 세포가 필요합니다. 여기에서는 역행 효소 기반 Langendorff 관류를 통해 쥐 심방 및 심실 근세포를 분리하는 방법을 설명하며, 이를 통해 칼슘 과도 현상과 L형 칼슘 전류를 동시에 측정할 수 있습니다.

Ca2+ 과도 현상 및 L형 칼슘 전류의 동시 측정을 위한 고품질 쥐 심방 및 심실 근세포의 분리

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

패치 클램프 및 칼슘 이미징 실험은 노동 집약적이고 시간이 많이 걸리며 까다롭습니다. 이 프로토콜은 패치 클램프 실험에 적합하고 동시에 칼슘 이미징을 수행하는 고품질 쥐 심방 및 심실 심근 세포를 분리하는 편리한 방법을 제공합니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 동일한 동물에서 심방 및 심실 심근 세포를 얻을 수 있다는 것입니다.쥐 심방 심근세포의 분리는 특히 까다로우며 이전 실험의 제한 요소였습니다. 먼저 Langendorff 장치에 관류 완충액을 미리 채우고 공기가 없는지 확인합니다. 해부 현미경 아래에 대동맥 캐뉼라를 고정하고 관류 완충액으로 채워진 1ml 주사기로 연결합니다.안락사된 쥐에서 심장을 제거한 후 심장을 실온 관류 완충액에 넣고 가능한 한 빨리 현미경으로 뭉툭한 바늘로 대동맥을 캐뉼레이션합니다. 봉합 실크 조각으로 심장을 바늘에 단단히 묶고 주사기를 분리하십시오. 대동맥 캐뉼레이션 삽입 후 즉시 캐뉼레이션 심장을 Langendorff 장치에 연결하여 공기가 시스템으로 유입되지 않도록 합니다.정확히 섭씨 37도에서 1분 동안 관류 버퍼로 심장을 관류하고 분당 4ml의 관류 속도로 심장을 관류합니다. 관류에서 분해 완충액으로 전환하고 섭씨 37도의 온도와 분당 4밀리리터의 관류 속도에서 정확히 9분 동안 관류합니다. 완료되면 소화된 심장을 완전히 덮을 수 있도록 충분한 소화 완충액이 있는 페트리 접시에 옮깁니다.그런 다음 현미경으로 심방과 심실을 조심스럽게 해부합니다. 심방을 1.5ml의 소화 완충액이 있는 페트리 접시로 옮기고 심실을 3ml의 소화 완충액이 있는 다른 페트리 접시로 옮깁니다. 조심스럽지만 빠르게 뭉툭한 집게를 사용하여 심방을 작은 조각으로 떼어냅니다.팁 입구를 넓히기 위해 미리 절단한 1000마이크로리터 피펫 팁으로 조심스럽게 위아래로 피펫팅하여 조직을 용해합니다. 용액을 15ml 원심분리기 튜브로 옮기고 튜브 측면을 피펫팅하여 동일한 양의 정지 버퍼를 추가합니다. 용액 3ml를 모두 200마이크로미터 나일론 메쉬에 통과시켜 완전히 소화되지 않은 나머지 큰 조직 조각을 제거합니다.심실 박리를 수행하려면 해부 가위나 집게를 사용하여 심실 조직을 작은 조각으로 자르고 다른 1000마이크로리터 피펫 팁으로 위아래로 피펫을 만들어 용해합니다. 세포와 조직 용액을 15ml 원심분리 튜브로 옮기고 반응 종료를 위해 튜브 측면에 조심스럽게 피펫으로 넣어 동일한 양의 정지 버퍼를 추가합니다. 6ml의 세포와 조직 용액을 모두 200마이크로미터 나일론 메쉬에 통과시켜 완전히 소화되지 않은 큰 조각을 제거합니다.심방 및 심실 세포 현탁액을 모두 실온에서 6분 동안 벤치에 두어 안정화시킵니다. 그런 다음 5G에서 2분 동안 튜브를 원심분리합니다. 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 상등액을 버리고 칼슘이 없는 Tyrode 용액 10ml에 세포 펠릿을 조심스럽게 재현탁합니다.침강을 위해 심방 세포와 심실 세포를 8분 동안 방치합니다. 5G에서 1분 동안 심방 세포를 원심분리합니다. 그런 다음 두 세포 샘플에서 상등액을 버리고 100 마이크로몰 칼슘이 함유된 10 밀리리터의 Tyrode 용액에 펠릿을 조심스럽게 재현탁시킵니다.침전을 위해 세포를 8분 동안 그대로 둔 다음 심방 세포의 원심분리를 반복합니다. 상층액을 버리고 세포 펠릿을 400마이크로몰 칼슘이 함유된 10ml의 Tyrode 용액에 조심스럽게 재현탁합니다. 이 과정을 한 번 더 반복하여 Tyrode 용액의 세포를 1밀리몰 칼슘으로 재현탁시킵니다.모든 심방 세포는 약 35에서 100 피코파라드 범위의 세포 용량으로 작습니다. 심방에서 작동하는 심근의 일반적인 세포가 여기에 나와 있습니다. 심실 근세포는 막대 모양이고 더 크며 세포 용량은 100에서 약 400 피코패럿 사이입니다.하나의 심방 근세포와 하나의 심실 근세포에서 동시 세포질 칼슘 과도 현상을 사용한 L형 칼슘 전류 측정의 예가 여기에 나와 있습니다. 이 기술을 시도하기 전에 장기 적출을 연습해야 합니다. 단계를 빠르게 수행하고 모든 조직을 올바른 위치에서 절단하는 것이 중요합니다.장기 적출이 재현 가능한 품질로 수행되는 경우 완벽한 캐뉼레이션을 위해 시간을 할애하십시오. 이 프로토콜로 분리된 셀은 패치 클램프 측정에 적합합니다. 또한 형광 염료를 적재할 수 있어 광범위한 이미징 실험이 가능합니다.

isolation-high-quality-murine-atrial-ventricular-myocytes-for

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

KV 채널 장애는 심장 arrhythmias과 연결되어 있습니다. 우리가 KV 채널 보조의 subunit의 녹아웃 마우스에서 심방과 심실 cardiomyocytes의 분리에 대한 체계적인 프로토콜을 활용 이러한 arrhythmias로 이어질 분자 메커니즘을 연구하기 위해. 절연 cardiomyocytes는 다음 즉시 세포 electrophysiological 연구, 생화학 또는 immunofluorescence (IF) assays에 사용하실 수 있습니다.

손쥐 심방과 심실 Cardiomyocytes의 절연 및 KV 채널 레코딩

우리는 세포 내 칼슘에 사용할 수있는 인간의 심방 근육 세포의 분리를...

칼슘의 동시 측정을위한 인간의 심방 근육 세포의 분리<sup&gt; 2 +</sup&gt; 과도하고 막 전류

여기서 우리는 랑겐 관류 시스템을 사용하여 성인 마우스 된 심근의 분리에 대해 설명합니다. 얻어진 세포 + 내성 전기적 무부하 외 Ca2이며 배양 및 아데노 - 또는 유전자 발현을 조작하기 lentiviruses로 형질 감염 될 수있다. 그 기능 또한 MMSYS 시스템 및 패치 클램프 기술을 이용하여 분석 될 수있다.

절연, 문화, 그리고 성인 마우스 된 심근의 기능적 특성

심장 질환의 세포 기준으로 현재의 지식은 주로 동물 모델에 대한 연구에 의존한다. 여기에서 우리는 기술과 인간의 심실의 심근의 작은 수술 샘플에서 하나의 실행 가능한 심근을 얻기 위해 새로운 방법을 확인합니다. 인간 심실 근세포은 전기 생리학 연구와 약물 검사를 위해 사용될 수있다.

신선한 수술 샘플에서 분리 및 인간의 심실 심근 기능 특성

이 프로토콜 설명 electrophysiological murine atria는 높은 시간적, 공간적 해상도, 막 전압의 듀얼 녹음을 포함 한 광학 매핑 시스템을 활용 하 여 평가 하 고 캘리포니아2 + 에서 과도 프로그램 특수 전극 카 테 터를 통해 자극입니다.

고해상도 광학 매핑 Murine Atria electrophysiological 평가

여기, 우리가 보존된 방출 분수와 함께 대사 증후군 관련 심장 마비의 쥐 모델에서 단일 셀 심 방 cardiomyocytes의 격리에 대 한 최적화, Langendorff 기반 절차를 설명합니다. 심장 구멍의 intraluminal 압력의 수동 조절 기능 그대로 myocytes 흥분-수축-결합 연구에 대 한 적합 한를 구현 됩니다.

심 방 Cardiomyocytes 보존된 방출 분수와 함께 대사 증후군 관련 심장 마비의 쥐 모델에서의 격리

이 프로토콜은 청크 소화 접근법을 사용하여 성인 마우스 심장으로부터 단일 심방 심근세포를 분리하는 데 사용됩니다. 이 접근법은 패치 클램프 연구에서 심방 근세포 전기 생리학을 특성화하는 데 사용할 수 있는 우측 또는 좌심방 근세포를 분리하는 데 사용됩니다.

성인 마우스에서 심방 근세포의 격리

우리는 뮤린 근세포를 분리하는 방법론과 동시 디지털 세포 기하학 측정을 통해 형광 광도계를 사용하여 sarcomere 단축 추적과 동시에 전압 또는 칼슘 흔적을 얻는 방법을 제시합니다.

고립 된 뮤린 심실 근세포의 광학 이미징

단일 성인 마우스 심장의 심실과 심실 모두에서 심근세포 및 비근구의 동시 절연을 위한 방법이 설명된다. 이 프로토콜은 매우 실행 가능한 심장 심근세포 및 비 근구세포의 일관된 수율을 초래하고 페노티핑 및 체외 분석을 위한 최적의 세포 별 배양 조건을 자세히 설명합니다.

성인용 마우스 심장에서 심방 심근 세포, 심실 심근 세포 및 비근구의 동시 격리 및 문화

이 프로토콜은 성인 마우스에서 심방 및 심실 근세포의 동시 격리를 위한 대동맥 통조림의 깊이를 포함하는 Langendorff 방법의 변형을 설명합니다.

성인 마우스에서 심방 및 심실 근세포의 동시 격리를위한 랑엔도르프 방법의 수정

배우세요 랑겐도르프 관류법을 이용하여 쥐 심방 및 심실 심근세포를 고품질로 분리하고 Ca²⁺ 과도 현상과 L형 칼슘 전류를 동시 측정하는 방법을. 이 기술은 부정맥 발생 기전 연구에 필수적입니다.

Ca²⁺ 과도 현상 및 L형 칼슘 전류의 동시 측정을 위한 고품질 쥐 심방 및 심실 근세포의 분리

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