Name: 경동공 이광자 마우스 망막의 생체 내 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: 배우세요 마우스 망막의 생체 내 이미징 방법을 이광자 현미경을 사용하여 안과 질환과 정상 망막 기능을 연구합니다. 이 기술은 신경과학 및 안과학 연구에 필수적인 고해상도 세포 시각화를 제공합니다.

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이 연구는 실명 예방 연구 재단 (PRW에 대한 경력 개발 상 및 세인트 루이스의 워싱턴 대학교 의과 대학 안과 및 시각 과학과에 대한 무제한 보조금), 국립 DrDeramus Research (BrightFocus Foundation의 프로그램) 및 McDonnell Center for Cellular and Molecular Neurobiology의 보조금으로 지원되었습니다. Z.W.는 기관 국립 연구 서비스 상 T32 EY013360의 지원을 받습니다. 이 연구는 또한 워싱턴 대학교 의과 대학의 희망 센터 바이러스 벡터 코어의 지원을 받았습니다.

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본원에 기재된 이광자 영상화 절차는 마우스 망막의 종방향 생체내 영상화를 가능하게 한다. 동일한 망막 영역의 반복 가능한 이미지는 이소플루란 하에서 최대 6시간 이상의 연속적인 기간 동안 획득될 수 있다. 마우스는 동일한 이미징 영역을 찾기 위해 세포 및 혈관 랜드마크를 사용하여 다른 날에 이미징할 수도 있습니다(그림 3). 이러한 목적을 위해 커버 글라스와 결합 된 투명 겔 침지의 사용은 이전에 망막 하 주사를위한 망막의 시각화, 레이저 유도 망막 손상 모델 및 안저 영상20,21,22를 포함한 다양한 절차에 적용되었습니다.
눈의 해부학은 마우스 각막과 렌즈의 높은 광출력이 교정 없이 동공을 통한 직접 이미징을 방해하기 때문에 생체 내 이미징에 고유한 문제를 제시합니다. 몇몇 다른 생체내 영상화 방법은 마우스 눈의 전방 광학의 교정을 위해 평면-오목한 콘택트 렌즈의 사용에 의존한다 7,17,18,19. 각막의 광학 교정만으로 마우스 렌즈의 높은 광학 파워는 불가피한 양의 시차, 특히 주변 스캔 필드의 구조를 초래하여 다른 Z 평면에서 XY 차원의 스트레칭 및 병진 운동으로 나타납니다. X 및 Y 차원에서 이미지 시차 관련 왜곡을 최소화하려면 이미징 영역에서 망막에 대한 접선면이 현미경 광 경로에 수직이 되도록 마우스 눈의 방향을 지정하는 것이 중요합니다. 여기에 설명된 설정은 이 정렬을 달성하기 위해 눈의 각도를 정밀하게 조작하는 데 도움이 됩니다. 두 축을 따라 회전할 수 있는 조정 가능한 마우스 헤드 홀더를 사용하면 실험자가 시차를 최소화하기 위해 Z 차원을 스크롤할 때 눈의 각도를 쉽게 수동으로 조정할 수 있습니다. 이 기울기는 또한 망막의 더 넓은 영역을 이미징 할 수 있도록 동공의 필드 정지 효과를 우회합니다. 헤드 홀더의 구속은 또한 호흡으로 인한 운동 아티팩트를 크게 줄입니다.
연속 이미징 중에 불투명화로 인해 이미지 품질이 저하되므로 마우스 눈의 선명도를 유지하기 위해 주의해야 합니다. 이미징 중에 윤활제 젤을 자주 다시 바르고 각 이미징 세션 후에 연고를 바르면 눈이 건조해지고 혼탁이 발생하는 것을 방지하는 데 도움이 됩니다. 일부 각막 혼탁은 24-48 시간 후에 자발적으로 해결됩니다. 이 프로토콜에 기술된 바와 같이 투명 젤 및 커버 글라스의 사용은 콘택트 렌즈(7)와 유사한 이미지 품질 및 수차 보정을 제공하는 한편, 커버 글라스를 재정렬할 필요 없이 눈 각도의 보다 용이한 조정을 허용한다. 또한 젤은 눈에 지속적인 수분 공급을 제공하여 최대 몇 시간의 급성 영상 세션을 수행 할 수 있습니다. 마지막으로, 커버 글라스가 각막에 접촉하지 않기 때문에, 반복적인 이미징 세션에 대한 광학적 선명도를 감소시킬 수 있는 눈에 대한 자극을 최소화한다.
이 접근법의 한계는 광학 수차가 완전히 보정되지 않는다는 사실입니다. 이것은 무거운 시차로 인해 축 방향 분해능을 심각하게 감소시키는 반면, 소마의 정량적 측정은 단일 이미지 평면에서 얻을 수 있습니다. 망막 뉴런의 형광 신호 강도는 이 방법을 사용한 샘플 정렬에 따라 달라지기 때문에 여기 및 방출 비율 기반 센서는 다양한 이미징 세션에서 샘플을 만성적으로 비교하는 실험에 더 적합합니다. 시스템 수준에서 광학 수차를 교정하는 접근법은 망막 8,9,14,21에서 세포 하 해상도를 허용하는 적응 광학입니다. 그러나 적응형 광학을 구현하려면 고도로 전문화된 장비와 광범위한 전문 지식이 필요합니다.
생체 내 망막 영상에 대한 2 광자 접근법은 컨 포칼 현미경 또는 검안경6이다. 여기에 제시된 접근 방식은 광시야 또는 컨포칼 현미경으로 쉽게 변환할 수 있어야 합니다. 단일 광자 이미징은 아마도 더 견고하고 눈의 각막과 렌즈를 통해 효율적인 2 광자 효과를 달성하는 데 필요한 2 광자 레이저의 높은 에너지로 인해 망막 손상 위험이 적습니다. 2광자 레이저 손상을 방지하려면 이미징 실험 완료 후 전체 망막을 검사하고 이미징된 층의 세포 유형에 대한 면역 염색을 통해 최대 레이저 출력에 대한 임계값을 경험적으로 결정해야 합니다. 여기에 제시된 시스템에서 RGC는 pan-RGC 마커 인 Rbpms로 레이블이 지정되었으며 밀도는 최대 45mW 이미징 전력까지 정상인 반면 55mW는 RGC의 상당한 손실을 초래했습니다 (표시되지 않음).
단일-광자 영상화의 단점은 이러한 접근법이 이광자 영상(23)에 비해 망막의 고유 시각 회로를 매우 심하게 자극할 것이라는 사실이다. 망막 전체 마운트 또는 아이컵 준비를 사용한 이전 실험은 2광자 레이저 스캐닝이 대체로 일시적인 회로 활성화를 유도한다는 것을 보여주었습니다24. 여기에서 Ca 2+ 센서 Twitch2b를 사용한 RGC 활동의 이미징은 레이저 스캐닝의 시작이 대부분의 RGC에서 5-20초 동안 기준선으로 돌아가는 Ca2+ 상승을 유도한다는 것을 보여줍니다(그림 8). 이 프로토콜에서의 레이저 파워가 생체내 망막 광 반응(8)을 보고하는 이전 실험의 범위 내에 있다는 것을 감안할 때, 현재 기술된 방법은 망막에서의 회로 활성의 기록에 복종할 가능성이 높다. 이러한 고려 사항은 회로 활동의 영향을 받을 수 있는 실험에 중요합니다.
이 프로토콜은 두 가지 유형의 망막 뉴런, RGC와 무축삭 세포의 생체 내 이미징을 보여줍니다. 수평 세포 (Cx57-Cre 25), 양극성 세포 (Chx10-Cre 26; mGluR6-GFP 27), 원뿔 광 수용체 (S- 또는 M-옵신 -Cre 28), 막대 광 수용체 (Nrl-Cre 29), 뮐러 아교 세포 (Foxg1-Cre 26) 및 혈관 주위 세포 (NG2-DsRed9)를 포함한 다른 주요 세포 유형의 유사한 표지가 달성 될 수 있습니다. 트랜스제닉 마우스는 또한 RGC의 개별 서브세트를 표지하는데 이용가능하다 (예를 들어, αRGCs30에 대한 KCNG4-Cre; OPN4-Cre for ipRGCs31; J-RGCs 32) 및 무축삭 세포 (예를 들어, 성화상 무축삭 세포26에 대한 ChAT-Cre 및 다양한 무축삭 세포 아형에 대한 신경펩티드 프로모터 드라이버 3,34). 바이러스 벡터는 트랜스제닉 마우스 대신 특정 세포 집단을 표적으로 하는 데 사용할 수 있습니다. 유비쿼터스 CAG 프로모터 요소를 갖는 AAV2의 유리체내 주사는 거의 독점적으로 RGC, 무축삭 세포 및 수평 세포25를 표지한다. 변형된 AAV2.7m8-Y444F 캡시드를 조작된 mGluR6 프로모터 구축물과 페어링하는 것은 ON 양극성 세포(35)의 광범위한 표지를 허용한다. AAV의 망막 하 주사는 광 수용체의 농축을 유도하며, 혈청 형 AAV2 / 5는 가장 높은 형질 도입 효율을 갖는다36. 변형된 AAV6 캡시드 단백질인 Shh10은 신경교 섬유소 산성 단백질 프로모터 요소와 짝을 이루어 Müller glia37에 특이적으로 입증되었습니다.
완전히 비 침습적 인 접근법으로 중추 신경계의 세포를 관찰하는 능력은 신경 회로8의 기본 특성과 신경 퇴행 3,4,5,6,38의 메커니즘을 연구하는 데 사용될 수 있습니다. 많은 맹목 질환은 망막의 세포 집단을 표적으로 하며, 마우스의 생체 내 영상 접근법은 시신경 손상 1,3,4, 황반 변성13, 뇌졸중5, 녹내장 2,6 및 포도막염 7을 연구하는 데 사용되었습니다. 또한, 많은 중추 신경계 신경 퇴행성 상태가 알츠하이머 병39, 다발성 경화증40 및 파킨슨 병41을 포함하여 망막에서 나타납니다. 따라서, 망막의 생체내 영상화를 위해 쉽게 접근할 수 있는 이 기술은 광범위한 신경퇴행성 상태를 연구하기 위한 도구로서 적용될 수 있다.

중추 신경계의 생체 내 시각화에는 일반적으로 두개골 얇아짐 및 유리창 또는 광학 릴레이 렌즈 설치와 같은 침습적 절차가 필요합니다. 망막은 기본적으로 환경으로부터 빛을 받기 때문에 침습적 준비 없이 직접 관찰할 수 있는 신경계의 유일한 구조입니다. 망막에 대한 광학 접근의 용이성은 중추 신경계를 연구하기위한 매력적인 모델 시스템입니다.
생쥐의 망막에 대한 라이브 형광 영상은 녹내장 1,2, 시신경 손상 1,3,4 및 뇌졸중5의 모델에서 RGC 사망뿐만 아니라 퇴행성 조건에서 소교 세포 활성화 6,7,8 및 혈관 구조 9의 변화를 추적하는 데 사용되었습니다. 내재적 신호는 또한 광수용체(10,11,12) 및 망막 색소 상피 세포(13)를 시각화하는데 사용될 수 있다. 망막의 생체 내 영상에 대한 많은 접근법은 안과 목적을 위해 특별히 설계된 고도로 전문화된 장치6 또는 각막 및 수정체 8,9,11,12,13,14의 기본 수차를 교정하기 위해 고도로 수정된 광학 시스템을 사용합니다.
본 프로토콜은 마우스 눈의 전방 광학을 부분적으로 보정하는 기본 방법을 활용하여 세포 분해능에서 망막 내의 형광 신호의 생체내 이미징에 대한 접근 방식을 보여줍니다. 이 전략은 뇌의 생체 내 이미징에 일반적으로 사용되는 다광자 현미경 설정에 대한 아주 작은 적응이 필요합니다. 이 접근 방식은 설정하기 쉽고 마우스는 스트레스가 거의 없기 때문에 급성 및 만성 기간 동안 타임 랩스 실험을 수행하는 데 도움이됩니다. 또한 RGC, 무축삭 세포, 미세아교세포 및 혈관계를 포함한 개별 망막 구성 요소를 표지하는 유전 및 유기 염료 기반 절차는 이 이미징 기술과 호환되며 망막 기능에 중요한 세포 유형 및 구조의 생체 내 관찰을 가능하게 합니다. 이러한 도구는 대부분의 다른 신경 세포 유형과 망막의 신경교 및 혈관 구성 요소를 표시하는 데 적용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>#1.5 커버슬립</td><td>ThermoFisher</td><td>152440</td><td>Richard-Allan #1.5 24 mm x 40 mm</td></tr><tr><td>50 mL 유리 주사기</td><td>Hamilton</td><td>80950</td><td>22G 시멘트 바늘</td></tr><tr><td>아데노 관련 바이러스(AAV2)</td><td>희망 센터 바이러스 코어</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>마취 공기 펌프</td><td>RWD 생명 과학</td><td>R510-30</td><td></td></tr><tr><td>아트로핀</td><td>시그마</td><td>A0132</td><td>학생용 확장기 용액</td></tr><tr><td>기본 소동물 마취 장치</td><td>RWD 생명 과학</td><td>R500IE</td><td></td></tr><tr><td>붕규산 유리 모세관</td><td>Sutter</td><td>B150-86-10</td><td>외경 1.50mm, 내경 0.86mm, 길이 10cm</td></tr><tr><td>CFP/YFP 필터 큐브</td><td>Chroma</td><td>사용자 정의</td><td>480/40, 505 긴 패스, 535/30</td></tr><tr><td>ChromoFlex - 2채널 PMT 검출 장치</td><td>Scientifica</td><td>S-MPLG-1002</td><td></td></tr><tr><td>순환 난방 펌프</td><td>Braintree Scientific</td><td>tp-700</td><td>37로 설정 > C</td></tr><tr><td>집착 필름</td><td>VWR</td><td>10713-916</td><td></td></tr><tr><td>소형 필터 홀더</td><td>ThorLabs</td><td>DH1</td><td>마우스 눈</td></tr><tr><td>Cx3cr1-GFP 형질전환 마우스 (B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J)</td><td>Jackson Laboratory</td><td>005582</td><td></td></tr><tr><td>DAQ 컨트롤러 섀시</td><td>National Instruments</td><td>PXIe-1073</td><td></td></tr><tr><td>데이터 수집 장치</td><td>National Instruments</td><td>BNC-2090A</td><td></td></tr><tr><td>Evans Blue dye</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1677409</td><td></td></tr><tr><td>FPGA 모듈과 디지타이저</td><td>National Instruments</td><td>NI-5734</td><td></td></tr><tr><td>가스 배출 장치</td><td>RWD Life Science</td><td>R546W</td><td></td></tr><tr><td>GenTeal Severe 윤활제 눈 젤&nbsp; &nbsp;</td><td>Alcon</td><td>(현지 약국에서)</td> <td>이미징 중 사용</td></tr><tr><td>GFP/Red 필터 큐브</td><td>Chroma</td><td>사용자 정의</td><td>535/30, 560 롱 패스, 605/70</td></tr><tr><td>가열 패드</td><td>McKesson 의료 및 외과</td><td>190147</td><td></td></tr><tr><td>HyperScope Launch Pockels Cell</td><td>Scientifica</td><td>S-MP-101080</td><td></td></tr><tr><td>HyperScope 메인 모듈</td><td>Scientifica</td><td>S-MP-100466</td><td></td></tr><tr><td>HyperScope 스캔 경로</td><td>Scientifica</td><td>S-MP-100406</td><td></td></tr><tr><td>HyperScope X 갈보 모듈</td><td>Scientifica</td><td>MP-100443</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 피지 소프트웨어</td><td></td><td>프리웨어</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Patterson 수의학</td><td>NDC 14043-704-06</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane 가스 필터 캐니스터 (활성 청소)</td> <td>RWD 생명 과학</td><td>R510-31</td><td></td></tr><tr><td>이소플루란 가스 필터 캐니스터(수동 소기)</td><td>RWD 생명 과학</td><td>R510-31S</td><td></td></tr><tr><td>케타민 HCl(100mg/mL)</td><td>Vedco</td><td>NDC 50989-161-06</td><td></td></tr><tr><td>M32 to M26 어댑터</td><td>ThorLabs</td><td>M32M26S</td><td></td></tr><tr><td>MaiTai GUI 소프트웨어</td><td>Spectra-Physics</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB 소프트웨어</td><td>MathWorks</td><td>NA</td><td>R2015b</td></tr><tr><td>meloxicam (5 mg/mL)</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>NDC 0010-6013-01</td><td>진통제</td></tr><tr><td>Micorscope Objective</td><td>Edmund Optics</td><td>46-404</td><td>Mitutoyo</td></tr><tr><td>WE715042319 마이크로피펫 풀러</td><td>Sutter</td><td>Flaming/Brown 모델 P-97</td><td></td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>Fisher</td><td>BP2629-1</td><td></td></tr><tr><td>Mini bulldog 지혈 클램프</td><td>Fine Science Tools</td><td>18053-28</td><td></td></tr><tr><td>미니어처 EVA 튜빙 0.02 "ID, 0.06 "OD</td><td>McMaster Carr</td><td>1883T1</td><td></td></tr><tr><td>미니어처 EVA 튜빙 0.05 "ID, 0.09 "OD</td><td>McMaster Carr</td><td>1883T4</td><td></td></tr><tr><td>마우스 헤드 홀더</td><td>Narishige</td><td>SGM-4</td><td></td></tr><tr><td>No. 5 집게</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>광학 포스트 1/2 "</td><td>ThorLabs</td><td>TR3-P5</td><td></td></tr><tr><td>광 파워 미터 키트</td><td>ThorLabs</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>pE-300 Ultra LLG Deivery</td><td>Scientifica</td><td>COO-LED3ULLGs</td><td></td></tr><tr><td>페닐에프린 염산염</td><td>시그마</td><td>P6126</td><td>동공 확장기 용액</td></tr><tr><td>Pockels 셀</td><td>Conoptics</td><td>350-80-02</td><td></td></tr><tr><td>Pockels 셀 증폭기</td><td>Conoptics</td><td>모델 302RM</td><td></td></tr><tr><td>프로파라카인 염산염</td><td>시그마</td><td>1571001</td><td>눈 고정용</td></tr><tr><td>레드 & 원적외선, 단거리 통과 필터, 큐브,</td><td>크로마</td><td>사용자 정의</td><td>560, 짧은 통과</td></tr><tr><td>, 회전 1/2 "포스트 클램프</td>, <td>ThorLabs,</td><td>SWC,</td><td></td></tr><tr><td>ScanImage, 패키지</td><td>, Vidrio Technologies</td>, <td>프리웨어</td>, <td>이미지 수집 소프트웨어; 버전 5.4.0(2018); MATLAB</td></tr><tr><td>염화나트륨 용액, 멸균 (0.9 %)</td> <td>Fresenius Kabi</td><td>NDC 63323-186-01</td><td></td></tr><tr><td>실체 현미경</td><td>Leica</td><td>S9 E</td><td></td></tr><tr><td>탁상용 원심 분리기</td><td>Oxford</td><td>Benchmate C8</td><td></td></tr><tr><td>Terramycin oxytetracycline / polymyxin B 항생제 안과 연고</td><td>Zoetisus</td><td>NA</td><td>유리체 내 주사</td></tr> <tr><td>후 사용ThermoRack 냉각 시스템</td><td>솔리드 스테이트 냉각 시스템</td><td>ThermoRack 401</td><td>20으로 설정 > C</td></tr><tr><td>Ultrafast Ti:Sapphire laser</td><td>Spectra-Physics</td><td>Mai Tai DeepSee</td><td></td></tr><tr><td>Vgat-Cre 형질전환 마우스(Slc32a1tm2(cre)Lowl/J)</td><td>Jackson Laboratory</td><td>016962</td><td></td></tr><tr><td>VGlut2-Cre 형질전환 마우스(Slc17a6tm2(cre)Lowl/J)</td><td></td><td></td>In Vivo 이미징을 위한 Jackson Laboratory 016963 <td></td></tr><tr><td>VivoScope Scientifica</td><td></td><td>S-MPVS-1200-00P</td><td></td></tr><tr><td>백색 바셀린-미네랄 오일 윤활제 눈 연고</td><td>다래끼</td><td>NA</td><td>이미징 후 사용</td></tr><tr><td>xylazine HCl (20 mg/mL)</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-110-20</td><td></td></tr></tbody></table>

경동공 이광자 마우스 망막의 생체 내 이미징

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

망막은 환경의 빛 신호를 뇌로 전파되는 전기 신호로 변환합니다. 망막의 질병은 널리 퍼져 있으며 시각 장애와 실명을 유발합니다. 그러한 질병이 어떻게 진행되는지 이해하는 것은 새로운 치료법을 공식화하는 데 중요합니다. 질병의 동물 모델에서 생체 내 현미경은 신경 퇴행을 이해하는 강력한 도구이며 알츠하이머 병에서 뇌졸중에 이르는 상태의 치료를 향한 중요한 진전을 가져 왔습니다. 망막이 광학 접근법에 의해 본질적으로 접근 할 수있는 유일한 중추 신경계 구조라는 점을 감안할 때, 그것은 자연스럽게 생체 내 영상에 적합합니다. 그러나 수정체와 각막의 기본 광학은 효과적인 이미징 접근에 몇 가지 문제를 제시합니다.
이 프로토콜은 급성 및 만성 기간 이미징 실험 모두에 적용할 수 있는 세포 분해능에서 마우스 망막의 세포 코호트 및 구조의 생체 내 2광자 이미징 방법을 설명합니다. 망막 신경절 세포(RGC), 무축삭 세포, 소교세포 및 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터, 형질전환 마우스 및 무기 염료를 포함한 일련의 라벨링 기술을 사용한 혈관 이미징의 예를 제시합니다. 중요하게는, 이들 기술은 망막의 모든 세포 유형으로 확장되고, 관심있는 다른 세포 집단에 접근하기 위한 제안된 방법이 설명된다. 또한 디스플레이 및 정량화를 위한 수동 이미지 후처리를 위한 예제 전략도 자세히 설명되어 있습니다. 이러한 기술은 건강 및 질병의 망막 기능 연구에 직접 적용 할 수 있습니다.

다양한 형질전환, 바이러스 벡터 또는 무기 염료 표지 접근법을 사용하여 기본 다광자 현미경의 간단한 적응을 사용하여 생체 내에서 여러 망막 세포 유형 및 구조를 특이적으로 시각화할 수 있습니다. RGCs 및 무축삭 세포를 시각화하기 위해, VGlut2-Cre 및 VGat-Cre 형질전환 마우스는 각각 시안 및 황색 형광 단백질(각각 CFP 및 YFP) 및 트로포닌15의 Ca2+ 결합 도메인을 포함하는 세포질 형광 공명 에너지 전달(FRET) 기반Ca 2+ 센서인 Twitch2b를 암호화하는 Cre 의존성 AAV 발현 구조체의 유리체내 주사를 받았습니다. . VGlut2-Cre 마우스에서 RGC 체세포는 명확하게 식별 할 수 있으며 축삭의 근막이 종종 분명합니다 (그림 3).
축삭의 궤적과 혈관계의 부정적인 이미지는 만성 영상 실험에서 랜드 마크로 유용한 VGlut2-Cre 마우스에서 시신경 두를 식별하는 것을 매우 간단하게 만듭니다 (그림 3). 무축삭 세포는 RGC보다 덜 밝게 보이지만, 아마도 더 작은 소마 크기 및/또는 덜 효율적인 AAV 형질도입으로 인해 소마는 여전히 내부 핵층에서 쉽게 나타납니다. RGC와 달리 무축삭 세포 신경돌기는 내부 플렉시 폼 층에서 더 자주 관찰됩니다 (그림 4). 망막 미세아교세포는 Cx3cr1-GFP 트랜스제닉 마우스 라인6에서 이미지화될 수 있습니다. 미세아교세포는 혈관구조와 연결되어 타임랩스 이미징 실험에서 동일한 영역을 찾을 수 있습니다.
이 접근법은 미세 미세아교세포 과정의 역학, 단일 평면 이미지에서 더 나은 공간 해상도를 갖는 절차 또는 개별 세포에 초점을 맞춘 최대 강도 투영이 준비되는 경우 (그림 5)를 추적하는 데 사용할 수 있습니다. 마우스 렌즈를 통한 광학 수차로 인한 축 해상도가 낮기 때문에 z 차원의 미세한 세부 사항을 검사할 수 없습니다. 이 이미징 기술이 세포 미세 구조의 퇴행성 변화를 관찰 할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 1 μL의 50 mM N- 메틸 -D- 아스 파르 테이트 (NMDA)를 유리체에 주입하여 흥분 독성 병변을 유도했다. 주사 후 1일, 미세아교세포는 이전 보고16에 따라 짧은 과정 또는 아메보이드 형태를 나타냈다(그림 5). Cx3cr1-GFP 형질전환 라인의 세포는 형광 단백질 발현 카세트의 AAV 매개 전달 실험에서보다 세포 코호트에서 더 균일하고 완전한 형광 단백질 발현을 나타냈다는 점에 유의해야 합니다. 실험을 설계할 때 다양하고 희소한 라벨링과 완전하고 균일한 라벨링의 이점을 고려해야 합니다.
앞서 설명한바와 같이 망막 혈관구조를 표지하기 위해 8, 마우스를 영상화 30-60분 전에 200μL의 Evans blue 염료(멸균 식염수 중 20mg/mL)를 복강내 주사했습니다. 이로 인해 시신경 머리에서 나오는 혈관이 강력하게 표시되었습니다 (그림 6). 놀랍게도, 단일 주사의 형광 신호는 적어도 7 일 동안 지속되었습니다. 생체내 이미지의 치수를 추정하기 위해 두 가지 별개의 방법이 사용되었습니다. 먼저, 동일한 망막 영역을 생체 내에서 그리고 고정 후 컨포칼 현미경을 사용하여 평평한 망막 전체 마운트에서 이미지화했습니다(그림 7). 무작위 세포 쌍을 4개의 서로 다른 생체내 샘플에서 선택하고, 세포 쌍 사이의 실제 거리를 컨포칼 스캔에서 측정하고 생체 내 픽셀 거리와 일치시켜 1x 디지털 배율로 0.99μm의 평균 픽셀 크기를 얻었습니다. 생체 내 이미지와 컨포칼 전체 마운트 스캔을 연관시키는 유사한 방법을 사용하면 단일 머리 위치가 약 650mm2 의 망막 패치에 대한 이미징을 허용하는 것으로 나타났습니다.
하나의 비틀림 축을 따라 헤드 홀더를 재배치하면 2.2mm 길이의 망막의 선형 영역에 접근 할 수 있습니다 (도시되지 않음). 또한, 1 또는 2 μm 직경의 형광 마이크로스피어를 마우스의 눈에 주입하고, 그 직경을 10x 디지털 줌을 사용한 생체 내 이미지로부터 라인 스캔의 전폭 절반-최대치로 측정하였다. 이것은 약간 더 큰 픽셀 크기 추정치를 제공했지만 더 많은 분산을 보였습니다(그림 7). 전반적으로 생체 내 실험 완료 후 전체 마운트 샘플의 컨포칼 이미징은 각막 및 렌즈 특성의 분산이 샘플마다 이미지 스케일을 변경할 수 있기 때문에 개별 이미지에 스케일을 할당하는 가장 일관된 방법입니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig1v2.jpg"> 그림 1: 광 경로 회로도. 이 프로토콜에 사용되는 2광자 현미경의 기본 구성 요소는 레이저 출력을 조절하는 Pockels Cell, 현미경 대물렌즈의 후면 조리개와 일치하도록 레이저 빔 직경을 줄이는 렌즈 쌍, 빔 스티어링을 위한 한 쌍의 갈보 스캔 미러로 구성됩니다. 한 쌍의 스티어링 미러가 각 주요 광학 부품 앞에 있습니다. 초점은 대물 렌즈를 구동하는 모터에 의해 제어됩니다. 방출광 경로는 다이크로익 및 배리어 필터를 교체하여 다양한 형광단에 맞게 사용자 정의할 수 있습니다. 단역 통과 다이크로익 미러가 적색광을 첫 번째 PMT로 향하게 하고 적절한 대역 통과 필터와 쌍을 이루는 롱 패스 다이크로익 미러를 사용하여 청록색과 노란색 방출을 분리하는 청록색/노란색/적색 이미징을 위한 일반적인 설정이 표시됩니다. 약어 : PMT = 광전자 증배관. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig2v2.jpg"> 그림 2: 생체 내 이미징을 위한 마우스 위치 지정. 동공이있는 마우스를 광 경로가있는 축에 배치하기 위해 마취 된 마우스를 먼저 헤드 홀더에 고정하고 헤드를 회전시키고 각도를 맞추고 윤활제 아이 젤을 큰 방울로 눈에 놓고 마우스를 스테이지에 놓습니다. 커버슬립은 광 경로에 수직인 커버슬립 홀더에 장착되고 눈 쪽으로 내려갑니다. 커버 슬립은 각막이나 마우스 머리 (왼쪽)에 접촉해서는 안되며, 커버 슬립이 편향되면 분명합니다. 그러나 커버 슬립은 물방울 (오른쪽)의 허리를 피할 수있을만큼 충분히 가까워 야하는데, 이는 샘플에 확대 효과가 있기 때문입니다. 젤 이멀젼을 적용하고 커버슬립을 고정한 후 스테이지를 현미경 대물렌즈 바로 아래로 이동해야 합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig2v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig3v3.jpg"> 그림 3: 망막 신경절 세포 이미징. 이미지 표시를 위해 관심 셀이 포함된 z-평면을 사용한 최대 강도 투영이 생성되고 결과 이미지가 중앙값 필터링되어 PMT 샷 노이즈가 제거됩니다. VGlut2-Cre 형질전환 마우스에 AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b를 주입하여 표지된 망막 신경절 세포의 두 가지 예, 구체적으로 CFP 신호를 나타낸다. 이미지는 4 일 간격으로 세션에서 획득되었으며 혈관 랜드 마크는 시신경 머리 근처의 동일한 영역으로 돌아가는 데 사용되었습니다. 시신경 헤드는 이미지의 아래쪽을 향합니다. 두 샘플 모두 방향에 약간의 차이가 있지만(강도가 감소한 영역은 화살표로 표시됨) 대부분의 세포는 두 시점에 모두 존재합니다. 스케일 바 = 약 50 μm. 약어 : PMT = 광전자 증배관; AAV = 아데노-관련 바이러스; EF1α = 신장 계수 -1 알파; FLEX = 플립 절제; VGlut2 = 소포성 글루타메이트 수송체 2; CFP = 시안 형광 단백질. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig3v3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig5v2.jpg"> 그림 4: 무축삭 세포 이미징. 무축삭 세포는 AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b를 VGat-Cre 형질전환 마우스에 주입하여 표지하였다. Twitch 2b의 CFP 신호가 구체적으로 표시됩니다. 내부 핵층의 깊이에 초점을 맞춘 작은 최대 강도 투영은 무축삭 세포 체세포를 나타내고 내부 플렉시 폼에 초점을 맞추면 무축삭 세포 신경 돌기가 해결됩니다 (화살표). 시신경 머리는 이미지의 오른쪽을 향하고 있습니다. 스케일 바 = 약 50 μm. 약어: AAV = 아데노-관련 바이러스; EF1α = 신장 계수 -1 알파; FLEX = 플립 절제; VGat = 수포 감마 아미노부티르산 수송체; CFP = 시안 형광 단백질; INL = 내부 핵층; IPL = 내부 플렉시 폼 층. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig5v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig4v2.jpg"> 그림 5: 영상 미세아교세포. 마이크로아교세포를 표지하기 위해 형질전환 마우스 라인 Cx3cr1-GFP를 사용하였다. 전체 스캔 볼륨의 최대 강도 투영은 많은 미세아교세포를 보여주며, 일부는 해결할 수 있는 미세한 공정 세부 사항을 보여줍니다. 필드의 왼쪽 하단을 향한 셀은이 영역의 시차로 인해 오른쪽 상단으로 향하는 셀보다 최대 투영에서 왜곡이 적습니다. 관심 셀만 포함하는 최대 강도 투영은 이 시차(중앙, 해당 색상으로 박스형)를 크게 줄입니다. 또한, 이 이미징 전략은 미세 미세아교세포 공정 리모델링(하단 패널)의 역학을 문서화할 수 있습니다. 이에 비해 많은 미세아교세포는 50mM NMDA(오른쪽)의 유리체내 주사에 의한 흥분독성 병변 후 하루 만에 짧은 과정 또는 아메보이드 형태로 볼 수 있습니다. 스케일 바 = 약 50 μm. 약어: GFP = 녹색 형광 단백질; Cx3cr1 = Cx3 케모카인 수용체 1; NMDA = N- 메틸 -D- 아스 파르 테이트. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig4v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig6v2.jpg"> 그림 6: 혈관 랜드마크 라벨링. 마우스는 첫 번째 이미징 세션 30-60분 전에 200μL의 20mg/mL Evans blue를 복강내 주사했습니다. 전체 두께 최대 강도 투영은 최소 7일 동안 지속된 망막 혈관계에서 지속적인 형광을 보여줍니다. 스케일 바 = 약 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig6v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig7v2.jpg"> 그림 7: 이미지 크기. VGlut2-Cre 형질전환 마우스에 AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b를 주입하여 표지된 망막 신경절 세포를 생체 내에서 이미지화한 다음, 망막의 고정 및 전체산 준비 후 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경으로 동일한 영역을 이미지화했습니다. 노란색 형광 단백질 채널은 둘 다에 대해 나타내었다. 컬러 화살표 쌍은 두 준비 (상단 패널)에서 동일한 셀을 나타냅니다. 유리체 내에 주입되고 생체 내에서 이미징된 직경 2μm 형광 마이크로스피어의 단일 평면 이미지(왼쪽 하단 패널). 마이크로스피어는 침전되지 않아 일정한 운동을 하여 축 방향 분해능을 측정하는 것이 불가능했습니다. 생체 내 형광 마이크로스피어의 전폭 절반 최대 측정 또는 그룹당 2-4개의 망막에서 가져온 상관 공초점 측정에서 계산된 픽셀 크기(오른쪽 아래). 스케일 바 = 50 μm. 약어: AAV = 아데노-관련 바이러스; EF1α = 신장 계수 -1 알파; FLEX = 플립 절제; VGlut2 = 소포성 글루타메이트 수송체 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig7v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig8v2.jpg"> 그림 8: 이광자 스캐닝에 의해 유도된 칼슘 활동. 망막 신경절 세포 VGlut2-Cre 형질전환 마우스에 AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b를 주입하여 표지된 YFP는 의사 착색 마젠타 및 CFP 녹색이며 단일 평면에서 4.22Hz에서 시계열로 이미지화됩니다. 모든 RGC는 유사한 시작 YFP/CFP 비율을 가졌습니다. 대부분은 FRET 비율(주황색 셀 제외)의 증가로 응답했으며 하나는 시계열(노란색 셀) 전반에 걸쳐 높은 YFP/CFP 비율을 유지했습니다. YFP/CFP 비율은 첫 번째 프레임 평균으로 정규화되었으며 컬러 원은 컬러 트레이스와 일치합니다. 별표는 왼쪽에 대표 이미지가 표시된 시점을 나타냅니다. 스케일 바 = 20 μm. 약어: AAV = 아데노-관련 바이러스; EF1α = 신장 계수 -1 알파; FLEX = 플립 절제; VGlut2 = 소포성 글루타메이트 수송체 2; YFP = 황색 형광 단백질; CFP = 시안 형광 단백질; RGCs = 망막 신경절 세포; FRET = 형광 공명 에너지 전달. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig8v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

생체 내 이미징은 건강 및 질병 생물학 연구를위한 강력한 도구입니다. 이 프로토콜은 표준 2 광자 현미경으로 마우스 망막의 경공 영상을 설명합니다. 또한 망막의 여러 세포 코호트를 형광으로 표지하는 다양한 생체 내 이미징 방법을 보여줍니다.

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

망막 세포의 생체 내 이미징 방법은 안과 질환을 조사하고 망막의 정상적인 기능을 이해할 수있게합니다. 이 방법은 이광자 현미경에 의한 망막의 생체 내 이미징에 대한 간단하고 재현성이 높은 접근 방식을 제공합니다. 마우스를 적절하게 안정화하는 것은 고품질 in vivo 이미지를 얻는 데 중요합니다.헤드 홀더에 마우스를 놓는 연습을 하고 이미지를 획득하기 전에 절차에 익숙해집니다. 승인 된 동물 사용 프로토콜에 따라 동물을 진정시킵니다. 동공 확장 용액을 바르고 마우스를 5 분 동안 어둠 속에 두어 동공이 팽창되도록하십시오.아래쪽 외이도 핀을 안쪽으로 확장 된 위치에 고정하고 위쪽 외이도 핀을 빼낸 위치에 고정합니다. 이어피스 바가 수평 아래 60도 각도로 기울어질 때까지 헤드 홀더의 메인 암을 돌립니다. 마우스가 바이트 바를 향하도록 한 상태에서 핀을 외이도에 삽입하여 한쪽 귀를 확장된 하단 핀에 장착합니다.상부 외이도 핀을 고정하는 나사를 푼 후 핀을 다른 외이도로 확장하고 나사를 다시 조여 머리를 고정합니다. 마우스가 헤드 홀더에 고정되어 있는지 확인하십시오. 머리 꼭대기를 아래로 누릅니다.마우스는 이어 바에 단단히 고정되어야하며 머리는 외이도 축을 중심으로 자유롭게 회전해야합니다. 바이트 바가 마우스 머리 쪽으로 오도록 한 상태에서 마우스 헤드를 부드럽게 들어 올려 상악 앞니가 바이트 바 홀더로 내려갈 수 있도록 하고 바이트 바를 부드러운 힘으로 집어넣어 헤드를 고정합니다. 나사를 사용하여 바이트 바를 제자리에 고정하고 마우스와 홀더를 현미경 스테이지에 놓습니다.마우스의 양쪽 눈에 윤활유 안약을 바릅니다. 한쪽 눈의 동공이 광 경로와 일직선이 될 때까지 헤드 홀더의 메인 암을 돌리고 1.5번 커버슬립을 컴팩트 필터 홀더에 넣습니다. 홀더를 현미경 스테이지에 고정한 후 각막에 닿지 않고 윤활제 아이 젤에 닿을 때까지 커버슬립을 내리고 광시야 여기광이 각막을 완전히 덮을 때까지 XY 차원과 대물렌즈 Z 위치에서 스테이지를 조정합니다.접안 렌즈를 사용하여 망막의 형광 세포 또는 구조에 초점이 맞춰질 때까지 Z 위치를 계속 조정하고 필요에 따라 에피 형광 조명기를 증가시켜 개별 세포 또는 관심 구조를 해결합니다. 망막과 이미징 광 경로의 정렬을 미세 조정합니다. 초점면을 변경할 때 초점이 맞지 않는 조명의 확장 또는 수축만 발생할 때까지 헤드 각도를 조정하여 X-Y 왜곡을 최소화합니다.그런 다음 에피형광 조명기를 끄고 조명기 셔터를 닫습니다. 2광자 이미징의 경우 모든 기관 레이저 안전 프로토콜을 따르십시오. 모든 주변광을 끄고 덮고 여기광 경로를 레이저로, 방출광 경로를 PMT로 전환합니다.이미지 수집 소프트웨어에서 프레임 크기를 512 x 512로 설정하고 프레임 평균을 3으로 설정합니다. Z 스테핑을 스택의 상단에서 시작하여 아래쪽으로 진행하도록 설정하여 광 수용체의 2 광자 레이저 활성화를 최소화합니다. PMT를 켜고 활성화하고 전압을 680볼트로 조정합니다.이미징 및 방출 셔터를 활성화합니다. 1%레이저 출력에서 시작하여 표적 조직의 라이브 이미지 미리보기를 시작하고 디스플레이 밝기를 자동으로 조정하여 관심 있는 세포 또는 구조를 시각화합니다. 표적 조직이 어둡거나 불분명하면 구조가 45밀리와트를 초과하지 않고 보일 때까지 레이저 출력 비율을 높입니다.현미경 스테이지를 X-Y 방향으로 움직여 원하는 이미징 영역의 중심을 맞추고 관심 구조에 초점이 맞춰진 Z 평면으로 이동합니다. 만성 타임랩스 실험의 경우 이전에 얻은 이미지를 열어 관심 있는 셀에 대한 참조로 사용하고 현재 이미지의 이미징 각도가 이전 이미지의 이미징 각도와 유사한지 확인합니다. 그런 다음 관심 있는 맨 위 및 맨 아래 Z 평면으로 이동하여 이미징 스택의 Z 제한을 설정하고 이미지를 획득합니다.모든 이미지가 획득되면 PMT와 레이저 셔터를 비활성화합니다. 여기 광 경로를 에피 형광 조명으로 전환하고 방출 광 경로를 접안 렌즈로 다시 전환합니다. 그런 다음 이미지 수집 소프트웨어를 종료하고 컴퓨터 인터페이스에서 레이저를 끄고 항상 켜져 있는 장비를 제외하고 역순으로 하드웨어를 종료합니다.분석이 끝나면 헤드 홀더에서 마우스를 제거하고 보푸라기가없는 조직을 사용하여 아이 젤을 부드럽게 제거합니다. 그런 다음 윤활제 눈 연고를 양쪽 눈에 바르고 마우스를 완전히 누울 때까지 모니터링하면서 섭씨 37도의 따뜻한 물 순환 가열 패드에 놓고 마우스를 하우징으로 되돌립니다. VGlut-2-Cre 마우스에서 망막 신경절 세포 체종은 명확하게 식별 할 수 있으며 축삭 근막이 종종 나타납니다.축삭의 궤적과 혈관계의 부정적인 이미지는 VGlut-2-Cre 마우스에서 시신경 두의 식별을 용이하게하며, 이는 만성 영상 실험의 랜드 마크로 유용합니다. 망막 신경절 세포와는 달리, 무축삭 세포 신경 돌기는 내부 플렉시 폼 층에서 더 자주 관찰됩니다. 안구 내 NMDA 주사 후 하루, 망막 미세아교세포는 이전 보고에 따라 짧은 과정 또는 아메보이드 형태를 보여줍니다.영상 촬영 30-60 분 전에 단일 복강 주사를 통해 Evans 청색 염료를 전달하면 적어도 7 일 동안 지속되는 시신경 머리에서 나오는 혈관의 강력한 표지가 유도됩니다. 고정 후, 평평한 망막 전체 마운트 내의 세포 쌍 사이의 실제 거리는 컨포칼 스캔에서 측정되고 생체 내 픽셀 거리와 일치하여 생체 내 이미지의 평균 픽셀 크기를 결정할 수 있습니다. 마우스의 눈에 주입된 형광 마이크로스피어는 생체 내에서 마이크로스피어 직경을 측정할 수 있게 하여 약간 더 큰 픽셀 크기 추정치를 제공하지만 더 많은 분산을 제공합니다.생체 내 이미징은 면역염색 및 현장 혼성화와 같은 조직학적 분석과 함께 사용할 수 있습니다. 이러한 방법은 특정 세포 유형을 식별하고 이미징된 세포의 유전자 발현을 검사할 수 있습니다.

transpupillary-two-photon-in-vivo-imaging-of-the-mouse-retina

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

출처: Wang, Z., et al. Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina.  J. Vis. 특급 (2021). 이 동영상은 이광자 현미경을 사용한 in vivo 망막 이미징 기술을 보여줍니다. 마취된 마우스는 머리를 고정하고, 눈 윤활제를 바르고, 눈 위에 커버슬립을 놓아 이미징을 준비합니다. 형광 단백질을 발현하는 망막 신경절 세포(Retinal ganglion cell, RGC)는 정렬을 위해 상피형광(epifluorescence)을 사용하여 먼저 시각화됩니다. 마지막으로, 이광자 이미징이 사용되어 망막 신경절의 고해상도 시각화가 가능합니다.

마우스 망막의 Two-Photon In Vivo 이미징

출처: Bosco, A., et al. In vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma(신경 퇴행 중 망막 미세아교세포 활성화의 생체 내 역학: 마우스 녹내장의 컨포칼 안과 영상 및 세포 형태 측정).   J. Vis. 특급 (2015년) 이 비디오는 녹내장의 마우스 모델에서 망막 미세아교세포의 생체 내 이미징을 보여줍니다. 형광 단백질 발현 망막 미세아교세포를 가진 형질전환 마우스가 검안경 아래에 위치합니다. 적외선 조명은 시신경두(ONH)를 찾는 데 사용되며, 초점면은 망막 혈관을 랜드마크로 사용하여 설정됩니다. 그런 다음 형광 미세아교세포를 시각화하기 위해 형광 이미징을 사용합니다. 세포체가 커지고 분지 복잡성이 감소하는 것을 특징으로 하는 활성화된 미세아교세포를...

In Vivo Imaging of Retinal Microglia in a Mouse Model of Glaucoma

출처: Jongbloets, B. C., et al. Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-Fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy(생체 내 이광자 형광 수명 이미징 현미경을 사용한 머리 고정 동작 마우스의 활성) Protein Kinase A Activity. J. Vis. Exp. (2019) 이 비디오는 강제 이동 중 머리 고정, 행동 마우스에서 단백질 키나아제 A 활성을 시각화하기 위한 이광자 형광 수명 이미징 현미경 검사 절차를 보여줍니다.

Visualizing Protein Kinase: Two-Photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy를 사용한 마우스의 활성 

출처: Jagodzinska, J., et. al., Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo. J. Vis. 특급. (2017) &lt;br /&gt; 이 비디오에서는 SD-OCT(spectral-domain optical coherence tomography)를 사용하여 망막층을 이미지화하고 시신경병증이 있는 유전자 변형 마우스 모델의 구조적 변화를 평가하는 방법을 보여줍니다.

광간섭 단층촬영(Optical Coherence Tomography)을 사용한 마우스 망막의 In vivo 이미징

출처: Mizuno, H., et al. In Vivo 신생아 마우스의 피질 뉴런의 이광자 이미징. J. Vis. 특급. (2018)이 비디오는 마취된 형질전환 생쥐 새끼의 뇌에 있는 뉴런을 이미지화하는 데 사용되는 이광자 현미경을 보여줍니다. 이광자 레이저는 높은 공간 해상도와 최소한의 광 산란으로 더 깊은 이미징을 가능하게 하여 수지상 투영을 포함한 신경 형태를 자세히 캡처할 수 있습니다.

생쥐 강아지의 신경 형태학 이미징을 위한 이광자 현미경

Source: Nishimura, C.  외. HIV-induced Neuroinflammation의 마우스 모델에서 이광자 현미경을 사용하여 대뇌 혈관 건축의 정량화. J. Vis. 특급. (2016). 이 비디오는 이광자 현미경을 사용하여 마우스 뇌의 피질 모세혈관의 생체 내 시각화를 보여줍니다. 얇은 두개골 피질 창이 있는 마취된 마우스에 형광 염료를 주입하고, 이미징을 위한 설정을 준비하고, 분석을 위해 뇌 미세혈관 구조의 상세한 이미지를 획득하는 단계를 간략하게 설명합니다.

 마우스 뇌 미세혈관 구조의 생체 내 이미징을 위한 이광자 현미경 

출처: Kulkarni, M. et al. Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (2015)이 비디오는 형질전환 마우스 망막의 원뿔 광수용체에서 칼슘 역학을 모니터링하기 위해 이광자 현미경을 사용하는 방법을 보여줍니다. 망막 절편을 준비하고, FRET 기반 칼슘 바이오센서를 이미징하고, 형광 변화를 분석하여 배경 조명 및 빛 자극 하에서 칼슘 수치를 정량화하는 단계를 간략하게 설명합니다.

마우스 망막 원뿔 광수용체의 칼슘 역학을 모니터링하기 위한 이광자 현미경 검사

이 비디오는 Thy1-GFP 형질전환 라인에서 생체 내 2광자 현미경을 사용하여 마우스 후비장 피질의 뉴런을 만성적으로 이미징할 수 있는 개두술 절차를 보여줍니다. 이 접근법은 mCherry 발현 아데노 관련 바이러스를 배측 해마에 주입하는 것과 결합됩니다. 이러한 기술을 통해 RSC에서 경험 의존적 구조적 가소성을 장기간 모니터링할 수 있습니다.

동시에 두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 마우스 Retrosplenial 코어 텍스에서 시냅틱 입력의 이미징 및 시냅스 대상

여기, 선물이 쥐에서 안 neovascularization 레이저 유도의 형태학 변화의 후속에서 경도 vivo에서 화상의 유용성.

Vivo에서 복합 이미징 및 마우스 레이저 유도 안 Neovascularization 모델의 분석

자극된 라만 산란(SRS) 현미경은 특정 화학 결합의 고유 진동을 기반으로 생체 분자의 라벨 없는 이미징을 가능하게 합니다. 이 프로토콜에서, 통합 SRS 및 이광자 형광 현미경의 도구 셋업은 살아있는 마우스의 척수에서 세포 구조를 시각화하기 위해 기술된다.

생체 내 결합 된 이광자 형광 및 자극 된 라만 산란 현미경을 사용한 생물학적 조직 이미징

여기에서는 이광자 현미경을 사용하여 이식된 쥐의 왼쪽 폐를 생체 내 이미징하는 프로토콜을 제시합니다. 이는 쥐 폐 이식 후 실시간으로 세포 역학 및 상호 작용을 연구하는 데 유용한 도구입니다.

이식된 마우스 폐의 생체 내 2광자 현미경

배우세요 마우스 망막의 생체 내 이미징 방법을 이광자 현미경을 사용하여 안과 질환과 정상 망막 기능을 연구합니다. 이 기술은 신경과학 및 안과학 연구에 필수적인 고해상도 세포 시각화를 제공합니다.

경동공 이광자 마우스 망막의 생체 내 이미징

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