Name: 소포체 스트레스 뉴런에서 렌티바이러스 전달 특정 shRNA에 의한 분자 조절 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: 학습하세요 소포체 스트레스에서 shRNA 매개 칼시뉴린 및 CHOP 녹다운이 일차 대뇌피질 뉴런의 축삭 위축에 미치는 영향을. 이 방법은 신경퇴행성 질환의 분자 메커니즘 이해에 기여합니다.

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이미징에 귀중한 도움을 주신 Gonzalo Quasollo 박사와 세포 배양 기술 지원을 해주신 Andrea Pellegrini 박사에게 감사드립니다.
이 연구는 미국 국립 보건원(#RO1AG058778-01A1, UTHSCSA-Instituto Investigación Médica M y M Ferreyra 간의 하위 계약 번호 165148/165147) 및 아르헨티나 국립 과학 기술 진흥청(ANPCyT, PICT 2017 #0618).

동물 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용을 위한 국립 보건원 가이드(National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)의 승인된 프로토콜에 따라 수행됩니다. 연구 수행 승인은 INIMEC-CONICET-UNC(결의안 번호 014/2017 B 및 006/2017 A)의 동물 관리 및 윤리 위원회(CICUAL)에 의해 부여됩니다.
1. 일차 쥐 피질 뉴런 배양
<ol><li>E18 Wistar 임신한 쥐를 80%CO2/20% O2의 혼합물로CO2 챔버에서 60초 동안 노출시킨 다음 경추를 탈구시켜 희생시킵니다.</li>
	<li>층류 후드에서 다음 단계를 수행합니다. 겸자 스타일 # 3 및 곧고 날카로운 작은 스프링 가위 (재료 표)를 사용하여 배아에서 뇌파를 세포 배양 접시의 행크스 용액으로 추출합니다.</li>
	<li>두 개의 미세한 집게 스타일 #5를 사용하여 20배 돋보기 아래에서 조직을 해부하여 수막에서 전두엽 피질을 분리합니다. 전두엽 피질을 15mL 원추형 튜브로 옮기고 화학적 소화를 위해 37°C에서 15분 동안 3-4mL의 트립신-EDTA(0.25%)로 조직을 배양합니다.</li>
	<li>소화 후 Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM) 3-4mL와 10% 태아 송아지 혈청(FCS)으로 희석합니다. 그런 다음 Ca 2+/Mg2+ 유리 행크스 밸런스드 솔트 용액과 0.1% 포도당으로 원심분리(3000g에서 5분)하여 3회 세척합니다.</li>
	<li>DMEM과 10% FCS(Table of Materials)에서 1000μL 팁을 사용하여 위아래로 피펫팅하여 조직을 기계적으로 10회 해리합니다. 그런 다음 균질액을 100 x g에서 1분 동안 원심분리하고 상층액을 수집하고 나머지 부피를 1000μL로 완성합니다.</li>
	<li>10% FCS, 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 1% 필수 아미노산 첨가제를 함유한 2mL의 DMEM을 사용하여 520 cell/mm의 밀도로 세포 배양 접시에 세포 현탁액을 플레이트합니다( 재료 표 참조). 이어서, 5%CO2 를 갖는 가습된 환경에서 37°C에서 2시간 동안 인큐베이션한다.<ol><li>세포 배양 접시의 유기물 제거 및 poly-L-lysine 코팅<ol><li>유리 재료를 반응 챔버에 넣어 유기물을 제거하고 96% 에틸 알코올을 첨가하여 재료를 덮습니다. 그런 다음 갈색-녹색 기포가 나타나기 시작할 때까지 68%(w/v) 질산을 한 방울씩 떨어뜨립니다. 이런 일이 발생하면 용기를 부분적으로 덮고 폭발이 멈출 때까지 반응을 계속하십시오. 알림: 유해 가스에 노출되지 않도록 가스 추출 캐빈 아래의 유기물을 제거하십시오.</li>
			<li>폴리-L-라이신 코팅 전에 멸균된 Mili-Q 물로 안경을 약 10회 헹굽니다. 그런 다음 배양 안경과 접시를 0.1μg/μL 폴리-L-라이신으로 4시간 동안 배양한 후 사용합니다. 배양 후 멸균 된 Mili-Q 물로 안경을 약 10 번 헹굽니다.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>신경 세포 분화를 허용하려면 무혈청 보충제를 사용하여 배지를 무혈청 신경기저 배지로 변경하십시오(재료 표). 처리될 때까지 5%CO2 로 37°C에서 배양물을 유지한다.</li>
</ol>2. 렌티바이러스 생산
참고: CN-Aα 이소형 또는 CHOP의 3'UTR을 표적으로 하고 비표적화 서열(스크램블)을 갖는 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드가 표 1에 열거되어 있다.
<ol><li>어닐링을 위해 어닐링 완충액(10mM Tris-HCl, pH 7.5-8.0, 50mM NaCl, 1mM EDTA)을 사용하여 상보적 서열을 가진 두 개의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 동일한 몰량으로 혼합합니다.</li>
	<li>95°C에서 2분 동안 가열한 다음 샘플을 열 블록 또는 수조에서 실온의 벤치 탑으로 옮겨 천천히 냉각합니다. 얻어진 생성물[짧은 헤어핀 RNA, (shRNA)와 응집성 말단]을 0.5 μM의 최종 농도로 희석하고, 이를 분취하여 -20°C에서 보관한다.</li>
	<li>shRNA 삽입물을 렌티바이러스 벡터 pLKO.3G에 클로닝하고 GFP를 녹색 형광 마커로 사용합니다. 이를 위해 멸균 튜브에서 다음을 혼합하여 EcoRI 및 PacI 제한 효소로 벡터 1μg을 분해합니다: 10x 제한 효소 완충액 2μL(100mM 비스-트리스 프로판-HCl, pH 6.5, 100mM MgCl2, 1mg/mL 소 혈청 알부민), 1μg/μL pLKO.3G 1μL, 10 U/μL ECoRI 0.5μL, 0.5 μL의 PacI(10 U/μL) 및 16 μL의 멸균 이온수.<ol><li>피펫팅으로 부드럽게 섞습니다. 37°C에서 3-4시간 동안 반응을 배양한다. 참고: 하룻밤 소화는 일반적으로 불필요하며 DNA 분해를 초래할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>결찰을 위해 분해된 벡터를 혼합하고 3:1의 몰비로 삽입하고 T4 리가아제 및 리가제 완충액(제조업체에서 제공)과 함께 16°C에서 밤새 배양합니다. 참고: 이 시점에서 결찰 반응은 추가 사용이 있을 때까지 4°C에서 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>DH5α 적격 세포(Table of Materials) 또는 다른 적합한 대장균 균 주를 다음과 같이 결찰 반응으로 형질전환시킨다.<ol><li>유능한 대장균 을 결찰 반응의 총량과 혼합하고 얼음에서 15분 동안 식힌 후 42°C 수조에 2분 동안 담갔다가 다시 얼음에서 15분 동안 식힌다.</li>
		<li>열충격을 받은 총 부피를 15 mL 튜브로 옮기고 이전에 37°C로 유지해 온 Luria-Bertani(LB) 액체 배지로 부피를 1000 μL로 완성한다. 박테리아를 약 330 rpm의 궤도 쉐이커에서 37°C에서 90분 동안 흔들어 줍니다.</li>
		<li>4°C에서 5분 동안 5,000 x g로 원심분리하고 900μL의 상층액을 버립니다. 나머지 상청액을 사용하여 펠릿을 재현탁하십시오. 박테리아 현탁액을 고체 암피실린(100μg/mL) LB 플레이트에 골고루 펴 바릅니다.</li>
		<li>37°C에서 하룻밤 동안 배양한 다음 박테리아 성장을 확인합니다. 이 시점에서, 박테리아는 4°C에서 4-5일 동안 저장될 수 있다.</li>
		<li>단일 콜로니를 선택하여 10mL의 LB 액체 배지와 암피실린(100μg/mL)이 있는 50mL 튜브로 옮깁니다. 박테리아 ON을 37°C에서 약 330rpm으로 흔들어 줍니다.</li>
		<li>배양액을 원심분리하여 박테리아를 5,000 x g에서 4°C에서 5분 동안 펠렛화하고, 상층액을 버리고, 박테리아 펠릿을 보존합니다. 이것은 -20 °C에서 보관할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>제조자의 지시에 따라 박테리아 펠릿으로부터 DNA 정제 키트로 플라스미드를 정제한다(재료 표). 260nm에서 흡광도를 측정하고 다음 관계를 사용하여 희석 계수를 곱하여 DNA 농도를 계산합니다: 1.0 = 50μg/mL 순수 이중 가닥(ds) DNA의260 .</li>
</ol>3. 렌티바이러스 감염
알림: Class II 층류 후드에서 렌티바이러스 생성 절차를 수행합니다.
<ol><li>형질감염 24시간 전에, 종자 1-5 ×10 HEK 293 세포를 8 mL의 성장 배지에 직경 100 mm의 배양 접시에 넣고 이를 37°C, 5%CO2 에서 밤새 배양하였다.</li>
	<li>14μg의 pKLO.3G 벡터를 특정 삽입물, 10.5μg의 패킹 플라스미드 psPAX 및 3.5μg의 외피 플라스미드 pMD2.G(재료 표)와 혼합합니다. 45 μL의 플라스미드 형질주입 시약(Table of Materials)을 700 μL의 환원된 혈청 배지(Table of Materials)에 희석하고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 DNA 혼합물을 희석된 플라스미드 형질주입 시약과 결합하고 부드럽게 혼합한 다음 실온에서 20분 동안 배양합니다.</li>
	<li>한편, HEK 293 세포 배양액의 배지를 신선한 DMEM에 대해 변화시켰다(형질감염시에 70% confluent). 그런 다음 DNA 용액의 전체 부피를 한 방울씩 추가합니다. 접시를 부드럽게 흔든다. 형질감염 후 배지를 추가/변경할 필요가 없습니다.</li>
	<li>세포를 37°C, 5% CO2에서 48시간-72 시간 동안 인큐베이션하여 shRNA가 형광 현미경을 사용하여 GFP 형광으로 검사한 최적의 형질도입에 도달할 수 있도록 합니다. 그 후, 렌티바이러스로 배지를 수집하고 4°C에서 보관한다.</li>
	<li>바이러스 상청액을 0.45μm 나일론 멤브레인으로 여과합니다. 1mL의 플로우 스루를 분취합니다. 다음으로, 17,000 x g에서 4시간 동안 원심분리한다. 상청액을 버리고 펠릿을 보존하십시오. 보이지 않는 펠릿을 건조시키고, 건조되면, -80 °C에서 보관하십시오.<ol><li>플럭스 세포측정법으로 바이러스 적정을 수행합니다. 4 x 105 HEK 293 세포를 24-웰 플레이트에 시딩하고, 37°C에서 24시간 동안 인큐베이션한다. 그런 다음 바이러스 입자를 200μL의 DMEM 배양 배지(표 재료)에 재현탁하고 각 웰에 0.05, 0.02 및 0.005μL를 추가합니다.</li>
		<li>72시간 동안 바이러스 감염을 배양하고 배지를 제거하고 3분 동안 트립신화(0.05% 트립신, 1mL)합니다. 10% FCS 용액에 DMEM 1mL를 넣고 500 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 버리고 PBS로 펠릿을 두 번 세척하십시오.</li>
		<li>펠릿을 PBS 100μL로 재현탁하고 PBS에 2% 파라포름알데히드(PFA) 100μL로 세포를 고정합니다. 플럭스 세포분석기로 세포를 분석하고 GFP 형광 세포의 백분율을 결정합니다. 이 데이터를 수집하여 다음 공식을 사용하여 바이러스 적정을 계산합니다. 바이러스 적정 <img alt="Equation1" src="/files/ftp_upload/61974/61974eq01.jpg"></li>
	</ol></li>
</ol>4. 강글리오사이드 GM2 축적 및 항-MAP2 항체를 사용한 면역세포화학으로 스트레스를 받은 1차 뉴런 배양
<ol><li>CN-Aα 또는 CHOP의 3' UTR을 표적으로 하는 특이적 shRNA 올리고뉴클레오티드로 일차 피질 뉴런 배양물 (시험관내 15일)을 감염시키고, 이들을 37°C에서 1일 동안 5%CO2 와 함께 인큐베이션한다. 참고: 시험관 내에서 7-8일의 일차 피질 뉴런 배양은 세포가 높은 신경돌기 성장을 보이는 경우에도 사용할 수 있습니다.<ol><li>에탄올에서 강글리오사이드 GM2의 500 μM 원액을 준비하고 1 시간 동안 초음파 처리한다.</li>
		<li>GM2 원액을 2 μM의 최종 농도로 배양 접시 배지에 첨가하고, 37°C에서 5%CO2 와 함께 16, 24 및 48시간 동안 배양한다.</li>
	</ol></li>
	<li>일부 배양물을 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 위한 세포 균질액을 준비합니다(항체 사양은 재료 표 참조).</li>
	<li>1.4단계를 따릅니다. 및 1.5. 세포를 37°C에서 20분 동안 PBS에 4% PFA와 120 mM 수크로오스로 고정한 다음 PBS로 세척하였다. 젖은 챔버의 미끄럼 방지 멤브레인에서이 절차를 수행하십시오. 그 후, 투과화 용액(PBS 중 0.2% Triton X-100)을 5분 동안 첨가하고 PBS로 세척합니다.<ol><li>블로킹을 허용하기 위해 PBS에 희석된 5% BSA를 45분 동안 사용한 다음 블로킹 용액에 1:800으로 희석된 항-MAP2 항체와 함께 4°C에서 밤새 배양합니다.</li>
		<li>배양 시간이 끝나면 PBS로 2회 세척하고 2차 항체(표 of Materials)와 함께 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 PBS로 세포를 세척하고 수성 장착 매체(재료 표)를 사용하여 안경을 슬라이드에 장착합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>5. 신경돌기 위축 분석
<ol><li>CCD 카메라가 장착된 에피형광 도립 현미경을 사용하여 20x 에어 렌즈(NA 0.8)로 이미지를 얻습니다. ImageJ 플러그인으로 이미지를 분석합니다. 이를 위해 사진을 ImageJ에 로드하고 프로세스 | 배경을 뺍니다.</li>
	<li>이미지 | 조정 | 임계값 또는 Ctrl(또는 Cmd) + Shift + T 키를 입력합니다. 최소값을 조정할 수 있는 창이 열리면 경로 추적과 소마 추적을 구별할 수 있습니다. 바이너리 이미지를 클릭하십시오 (신경돌기와 소마는 흰색입니다). 이 이미지에서 자유형 선택을 사용하여 somas를 삭제합니다. 선택한 SOMA 영역이 다시 검은색으로 바뀝니다.</li>
	<li>추적을 선택하고 편집 | 선택 | 선택 영역 만들기를 클릭합니다. 선택 항목의 Ctrl (또는 Cmd) 및 T 키를 클릭하여 ROI를 얻고 보존합니다. 원본 이미지를 연 다음 ROI 관리자 패널을 클릭하고 이전에 얻은 소속 ROI를 선택합니다. 그런 다음 원본 이미지를 클릭합니다.</li>
	<li>이미지에서 ROI가 추적되면 Ctrl(또는 Cmd) 및 M 키(분석 | 측정). 창이 열립니다. 평균값(임의의 단위 A.U.)을 복사하여 통계 분석을 처리합니다. 참고: μm 단위로 값을 얻으려면 Analyze(분석) | 배율을 설정합니다. 값을 설정할 수 있는 창이 열립니다. 올바른 척도를 추가해야 합니다(분석 | Set Scale)은 사용하는 현미경의 특성에 따라 다릅니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이해 관계가 없습니다.

우리는 신경 세포 모델에서 생존에서 세포자멸사 UPR 단계로의 전환의 분자 조절을 가능하게 하는 실험 시스템을 설명합니다.
신경돌기 위축의 적절한 분석을 위해서는 수많은 길고 고도로 분지된 과정을 가진 1차 뉴런 배양을 얻는 것이 필수적입니다 9,11. 이것은 뉴런 프로세스 확장의 검사를 용이하게 하여 치료 간의 명확한 차이를 감지할 수 있도록 합니다. 시험관 내 7-8일의 일차 피질 뉴런 배양이 이미 높은 신경돌기 성장을 보이는 경우, 이는 시험관 내 배양 15일 대신 스트레스를 유발하고 후속 분석을 수행하는 데 사용될 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.
또한, ER 스트레스 매개 CHOP 과발현의 억제 백분율은 약 65-70% 이상이어야 한다. 중요하게는, CN-Aα 발현 수준의 침묵...

소포체(ER) 스트레스는 세포 소기관의 단백질 접힘 능력을 손상시키는 모든 섭동으로 정의됩니다. ER 내강 내에서 펼쳐진 단백질의 축적은 풀린 단백질 반응(UPR)이라고 하는 형질도입 캐스케이드 신호를 활성화합니다. 이 복잡한 신호 전달 경로는 PERK(단백질 키나아제 RNA[PKR]-유사 ER 키나아제), IRE1(이노시톨 요구 효소 1) 및 ATF6(활성화된 전사 인자 6)의 세 가지 스트레스 센서에 의해 조정됩니다. 모두 함께 항상성을 회복하려고 시도합니다. 그러나 스트레스가 지속되면 UPR은 결국 세포 사멸에 의한 세포 사멸을 유도합니다1.
ER 스트레스 시 ER 막횡단 단백질인 PERK는 진핵 개시 인자-2 알파(eIF2α)의 인산화를 유도하여 전체 단백질 합성을 감소시켜 ER2의 단백질 부하를 감소시킵니다. 우리는 이종이량체 Ca2+ 포스파타제인 칼시뉴린 A/B(CNA/B)가 PERK의 세포질 도메인에 직접 결합하여 자가 인산화를 증가시키고 단백질 번역 및 세포 생존율의 억제를 크게 향상시킨다는 것을 입증했습니다 3,4. 흥미롭게도 CNA/B는 포유류의 뇌에 풍부하여 CN의 서브유닛 A의 두 가지 동형인 α와 β를 구별합니다.
지속적인 ER 스트레스 하에서 PERK 신호 전달 경로는 활성화된 상태로 유지되는 유일한 UPR 분기이며, 따라서 생존 촉진 반응과 세포자멸사 반응을 모두 매개합니다. 만성 단계에서 한 가지 주요 다운스트림 사건은 전사 인자인 CHOP(CCAAT/인핸서 결합 단백질 상동 단백질)5의 유도입니다. 만성 ER 스트레스는 또한 신경퇴행성 질환을 포함한 광범위한 병리학적 장애의 일반적인 원인으로 점점 더 인식되고 있다6. UPR이 세포 사멸 대신 세포 보호 신호 전달을 촉진할 수 있는 방법을 이해하는 것이 중요하다 7. 그러나 현재로서는 이러한 두 UPR 단계 간의 전환을 제어하는 정확한 메커니즘에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다.
최근에 우리는 배양된 뉴런에서 강글리오사이드 GM2가 ER 막에 축적되어 내강 칼슘 고갈을 유도한다는 것을 발견했습니다. 이것은 차례로 신경돌기 위축과 세포자멸사를 매개하는 PERK 신호전달을 활성화시킨다 8. 이 연구에서 배양된 뉴런의 GM2 축적은 ER 스트레스 유발 신경돌기 위축의 세포 시스템 모델로 사용됩니다. 특히, CN-Aα 및 CHOP의 두 가지 PERK 인자 발현이 조작되어 초기/보호 이벤트와 만성/세포자멸사 단계 사이의 전환을 전환합니다. 이를 달성하기 위해 각 유전자는 침묵합니다. 따라서, 일차 피질 뉴런 배양은 렌티바이러스 전달 특이적 shRNA에 감염된다. 웨스턴 블롯 분석은 스크램블된 shRNA를 운반하는 렌티바이러스에 감염된 대조군 세포와 비교하여 CN-Aα 및 CHOP 발현 수준의 현저한 감소를 보여줍니다. 이 처리 후, 뉴런은 항미세소관 관련 단백질 2(MAP2) 항체9로 고정되고 면역염색된 외인성 GM2의 상이한 배양 시간을 받습니다. 이미지는 epifluorescence 현미경으로 얻을 수 있습니다. 총 신경돌기 성장은 총 세포 수를 기준으로 평가됩니다.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488 안티-마우스</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#R37120</td><td></td></tr><tr><td>안티-CHOP</td><td>Thermo Fisher</td><td># MA1 - 250</td><td></td></tr><tr><td>안티-CN-A&알파;</td><td>Millipore</td><td># 07-067</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GM2</td><td>Matreya</td><td>#1961</td><td></td></tr><tr><td>anti-MAP2</td><td>Sigma Aldrich</td><td># M2320</td><td></td></tr><tr><td>anti-&beta;-actin</td><td>Thermo Fisher</td><td># PA1 - 183</td><td></td></tr><tr><td>aprotinin</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>#3595</td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 200 epifluorescence microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27 보충</td><td>Life Technologies</td><td>#17504944</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>#11966025</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>Promega</td><td>#R6011</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum (FCS)</td><td>Life Technologies</td><td>#16000044</td><td></td></tr><tr><td>Fine-tippeds forceps&nbsp; 스타일 #5</td><td>Dumont</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forcep 스타일 #3</td><td>Dumont</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK 293</td><td>ATCC</td><td>#CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680 CW 2차 항체</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>#92632221</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680 2차 항체</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>#92632220</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800 CW 2차 항체</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>#92632210</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800 CW 2차 항체</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>#92632211</td><td></td></tr><tr><td>렌티바이러스 외피 플라스미드 pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>#12259</td><td></td></tr><tr><td>렌티바이러스 패킹 플라스미드 psPAX2</td><td>Addgene</td><td>#12260</td><td></td></tr><tr><td>렌티바이러스 벡터 pLKO.3G</td><td>Addgene</td><td>#14748</td><td></td></tr><tr><td>류펩틴 헤미설페이트</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>#295358</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine LTX & Plus 시약 (플라스미드 트랜스펙션 시약)</td><td>Life Technologies</td><td>#A12621</td><td></td></tr><tr><td>MISSION shRNA</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monosialoganglioside GM2</td><td>Matreya</td><td>#1502</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Life Technologies</td><td>#21103049</td><td></td></tr><tr><td>니트로셀룰로오스 막 0.45 & 마이크로; m</td><td>BIO-RAD</td><td>#1620115</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey 적외선 이미징 시스템</td><td>LI-COR Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OneShot Top 10</td><td>Life Technology</td><td>#C404010</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM (Reduced serum media)</td><td>Life Technologies</td><td>#105802</td><td></td></tr><tr><td>PacI</td><td>BioLabs</td><td>#R0547S</td><td></td></tr><tr><td>penicillin-streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>#15140122</td><td></td></tr><tr><td>펩스타틴 A</td><td>산타크루즈 생명공학</td><td>#45036</td><td></td></tr><tr><td>페닐메틸설포닐 플루오라이드</td><td>산타크루즈 생명공학</td><td>#329-98-6</td><td></td></tr><tr><td>폴리-L-라이신</td><td>시그마 알드리치</td><td>P#2636</td><td></td></tr><tr><td>스트레이트 샤프 작은 스프링 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>Promega</td><td>#M1801</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA 0.25 %</td><td>Life Technologies</td><td>#25200056</td><td></td></tr><tr><td>진동 세포 초음파 액체 프로세서(VCX 130)</td><td>Sonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wizard plus SV Minipreps DNA 정제 시스템</td><td>Promega</td><td>#A1330</td><td></td></tr></tbody></table>

소포체 스트레스 뉴런에서 렌티바이러스 전달 특정 shrna에 의한 분자 조절

Molecular Modulation by Lentivirus-Delivered Specific shRNAs in Endoplasmic Reticulum Stressed Neurons

스트레스 조건으로 인한 소포체(ER) 내에 펼쳐진 단백질의 축적은 특수 센서의 활성화를 통해 풀린 단백질 반응(UPR)을 유발합니다. UPR은 먼저 항상성 회복을 시도합니다. 그러나 손상이 지속되면 신호 전달이 세포 사멸을 유도합니다.
지속적이고 해결되지 않은 ER 스트레스가 신경퇴행성 질환을 포함한 많은 병리학적 상태에 기여한다는 증거가 증가하고 있습니다. UPR은 세포 보호 과정과 세포 사멸 과정 사이를 전환하여 세포 운명을 제어하기 때문에 이 전환을 정의하는 사건과 조절과 관련된 요소를 이해하는 것이 필수적입니다.
최근에, 우리는 비정상적인 GM2 강글리오사이드 축적이 ERCa2+ 함량의 고갈을 유발하고, 이는 차례로 UPR 센서 중 하나인 PERK(PKR-like-ER 키나아제)를 활성화한다는 것을 입증했습니다. 또한, PERK 신호전달은 GM2 축적에 의해 유도된 신경돌기 위축 및 세포자멸사에 참여한다. 이와 관련하여 우리는 다운스트림 PERK 구성 요소의 발현을 분자적으로 조절하여 신경성 위축을 겪는 뉴런의 취약성을 변화시킬 수 있는 실험 시스템을 구축했습니다.
우리는 쥐 피질 신경 배양에서 칼시뉴린(세포 보호) 및 CHOP(pro-apoptotic) 발현의 녹다운을 수행했습니다. 세포를 렌티바이러스 전달 특이적 shRNA로 감염시킨 후 GM2를 상이한 시간에 처리하고, 항-MAP2(마이크로튜브 관련 단백질 2) 항체로 고정 및 면역염색하였다. 나중에, 세포 이미지는 형광 현미경을 사용하여 기록되었고, 전체 신경돌기 성장은 공개 도메인 이미지 처리 소프트웨어 ImageJ를 사용하여 평가되었다. 이러한 PERK 신호 전달 성분의 발현 억제는 ER 스트레스에 의해 유발된 신경성 위축을 가속화하거나 지연시키는 것을 분명히 가능하게 했습니다.
이 접근법은 신경돌기 위축에 대한 뉴런의 취약성을 평가하기 위해 ER 스트레스의 세포 시스템 모델에서 사용될 수 있습니다.

여기에서는 두 개의 PERK 다운스트림 구성 요소를 침묵시키는 것이 ER 스트레스 셀 모델에서 UPR의 전환 단계에 영향을 미치는지 여부에 대한 질문을 다룹니다. 이를 달성하기 위해, 1일 10일 동안 일차 뉴런 세포 배양액에서 CN-Aα 유전자 및 CHOP 유전자 각각에 대한 2개의 특이적 shRNA 서열(표 1)에 의해 침묵시켰다. 상기 발현은 웨스턴 블로팅(western blotting)에 의해 분석된다(도 1 및 도 2). 녹다운 세포에서 ER 스트레스 매개 CN-Aα 및 CHOP 증가에 대한 명확한 억제가 관찰되지만 대조군 세포에서는 관찰되지 않습니다(shRNA 스크램블). 기저 CN 발현 수준은 이 치료 조건에 영향을 받지 않는다는 점에 유의해야 합니다. 
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본 연구에서, 발현은 특정 shRNA를 사용하여 PERK 경로의 두 가지 다운스트림 신호 전달 성분인 세포보호 칼시뉴린 및 프로-아폽토시스 CHOP의 녹다운됩니다. 반대로, 이들은 소포체 스트레스 유도 후 신경돌기 위축에 대한 일차 피질 뉴런의 감수성을 조절합니다.

소포체 스트레스 뉴런에서 렌티바이러스 전달 특정 shRNA에 의한 분자 조절

The accumulation of unfolded proteins within the endoplasmic reticulum (ER), caused by any stress condition, triggers the unfolded protein response (UPR) ...

이 접근법은 다운스트림 쌍 성분의 분자 발현을 조작하여 소포체 스트레스의 세포 시스템 모델에 사용될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 신경 경로의 시각화 및 측정을 통해 쌍을 이루는 신호의 영향을 제거하는 것입니다. 이 방법은 GM2 강글리오시드증 외에 다양한 신경퇴행성 질환 모델에서 ER 스트레스의 급성 단계와 만성 단계 사이의 전환에 대한 분자적 기초를 이해하는 데 기여할 수 있습니다. 시작하려면 2개의 미세 팁 5번 집게를 사용하여 20X 돋보기 아래에서 조직을 해부하여 전두엽 피질과 수막을 분리합니다.전두엽 피질을 15 밀리리터의 원추형 튜브로 옮기고 화학적 소화를 위해 섭씨 37도에서 15 분 동안 3-4 밀리리터의 트립신 EDTA로 조직을 배양합니다. 그 후 칼슘, 마그네슘, 이온이 없는 행크의 균형 잡힌 소금 용액과 0.1% 포도당으로 세 번 씻습니다. DMEM에 10% FCS를 더한 1, 000 마이크로리터 팁을 사용하여 위아래로 피펫팅하여 조직을 기계적으로 10회 해리합니다.균질액을 100 G에서 1 분 동안 원심 분리하고, 상청액을 수집하고, 1, 000 마이크로 리터의 나머지 부피를 완성한다. 10% FCS, 1% 페니실린 스트렙토마이신 및 1%의 필수 아미노산 첨가제를 함유한 DMEM 2밀리리터를 사용하여 제곱밀리미터당 520개 세포 밀도로 세포 배양 접시에 세포 현탁액을 플레이트합니다. 섭씨 37도에서 5%이산화탄소가 함유된 가습 환경에서 2시간 동안 배양합니다.신경 세포 분화를 허용하려면 무혈청 보충제를 사용하여 배지를 무혈청 neurobasal 배지로 변경하십시오. 처리 될 때까지 5 % 이산화탄소로 섭씨 37도에서 배양 물을 유지하십시오. 어닐링을 위해, 두 개의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 동일한 몰량의 상보적 서열과 혼합합니다.섭씨 95도에서 2 분 동안 가열합니다. 열 블록에서 샘플을 옮기고 생성 된 생성물을 0.5- 마이크로 몰의 최종 농도로 희석한다. shRNA 삽입물을 렌티바이러스 벡터 pLKO에 클로닝한다.3G, EcoR1 및 PAC1 제한 효소로 벡터의 1마이크로그램을 분해합니다. 피펫팅으로 부드럽게 혼합하고 섭씨 37도에서 3-4시간 동안 반응을 배양합니다. 결찰을 위해 분해된 벡터를 혼합하고 3:1의 몰비로 삽입합니다.섭씨 16도에서 밤새 T4 리가아제 및 리가아제 완충액과 함께 배양합니다. 다음으로, 성분 E.coli를 결찰 반응의 총량과 혼합하고 15 분 동안 얼음에서 식힌다. 섭씨 42도의 욕조에 2분 동안 담갔다가 다시 얼음에 15분 동안 식힙니다.열 충격을받는 총 부피를 15 밀리리터 튜브로 옮기고 Luria-Bertani 또는 L-B 액체 배지로 부피를 1, 000 마이크로 리터로 완성하십시오. 약 330RPM의 궤도 셰이커에서 섭씨 37도의 90분 동안 박테리아를 흔들어 줍니다. 섭씨 4도에서 5 분 동안 5, 000 G을 만난 원심 분리기.900 마이크로 리터의 상청액을 버리고 나머지 상청액을 사용하여 펠릿을 재현탁하십시오. 박테리아 현탁액을 고체 암피실린 LB 플레이트에 골고루 펴고 밤새 섭씨 37도 동안 배양합니다. 단일 콜로니를 선택하여 10 밀리리터의 L-B 액체 배지와 암피실린이 들어있는 15 밀리리터 튜브로 옮깁니다.박테리아를 섭씨 37도에서 약 330RPM으로 흔들고 배양액을 원심분리하여 섭씨 4도에서 5분 동안 5, 000G에서 박테리아를 펠렛화합니다. 상층액을 버린 후 박테리아 펠릿을 섭씨 영하 20도에서 보존하십시오. 형질감염 24시간 전에, 1 내지 500만 HEK-293 세포를 100 밀리미터 배양 접시에 시딩한다.14마이크로그램의 pKLO를 섞는다. 특정 삽입물, 10.5마이크로그램의 패킹 플라스미드 psPAX 및 3.5마이크로그램의 외피 플라스미드 pMD2가 있는 3G 벡터. G. 45 마이크로리터의 플라스미드 형질주입 시약을 700 마이크로리터의 환원 혈청 배지에 희석하고 실온에서 5분 동안 배양한다.그런 다음 DNA 혼합물을 희석된 플라스미드 형질주입 시약과 결합하고 부드럽게 혼합한 다음 실온에서 20분 동안 배양합니다. 형질전환 후 HEK-293 세포의 배양 접시의 배지를 새로운 배지로 교체하고 DNA 용액의 전체 부피를 한 방울씩 추가합니다. 접시를 부드럽게 흔들고 섭씨 37도, 5% 이산화탄소에서 48-72시간 동안 세포를 배양하여 shRNA가 최적의 형질도입에 도달할 수 있도록 합니다.렌티 바이러스로 배지를 수집하고 섭씨 4도에서 보관하십시오. 바이러스 상청액을 0.45마이크로미터 나일론 멤브레인으로 여과하고 1mm의 분취액을 통과합니다. 17, 000 G에서 4 시간 동안 원심 분리기.상청액을 버리고 펠릿을 보존하십시오. 보이지 않는 펠릿을 건조시키고 건조되면 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 칼시뉴린 A-알파 또는 CHOP의 3프라임 UTR을 표적으로 하는 특정 shRNA 올리고뉴클레오티드로 일차 피질 뉴런 배양을 감염시키고 섭씨 37도에서 하루 동안 5% 이산화탄소로 배양합니다.그 후, GM2 원액을 2 마이크로 몰의 최종 농도로 배양 접시의 배지에 첨가하고 섭씨 37도에서 5 % 이산화탄소로 16, 24 및 48 시간 동안 배양합니다. 섭씨 37도에서 20분 동안 PBS에 4% 파라포름알데히드와 120밀리몰 자당으로 세포를 고정한 다음 PBS로 세척합니다. 5분 동안 투과화 용액을 첨가하고 PBS로 세척한다.블로킹을 허용하기 위해 PBS에 희석된 5% BSA를 45분 동안 사용하십시오. 그런 다음 섭씨 4도에서 항-MAP2 항체와 함께 하룻밤 동안 배양합니다. 배양 종료 시점에 PBS로 세포를 2회 세척한 후, 1시간 동안 2차 항체와 함께 배양한다.PBS로 세포를 세척한 후 안경을 장착합니다. 에피형광 도립 현미경으로 이미지를 얻은 후 사진을 로드하여 ImageJ를 얻고 프로세스를 클릭한 다음 배경 빼기를 클릭하여 배경을 뺍니다. Image(이미지), Adjust(조정), Threshold(임계값)를 클릭하여 최소값을 조정하여 경로와 일부 추적을 구별할 수 있습니다.자유형 선택을 사용하여 somas를 삭제합니다. Traces(추적)를 선택하고 Edit(편집), Selection(선택), Create Selection(선택 만들기)을 클릭합니다. 선택 항목의 컨트롤 및 T 키를 클릭하여 ROI를 얻고 보존하십시오.원본 이미지를 엽니다. ROI 관리자 패널을 클릭하고 시작 ROI를 선택합니다. 그런 다음 원본 이미지를 클릭합니다.ROI가 이미지를 추적하면 control 및 M 키를 눌러 통계 분석을 처리합니다. 여기에서 2pERK 다운스트림 구성 요소를 침묵시키는 것이 ER 스트레스 세포 모델에서 풀린 단백질 반응의 전이 단계에 영향을 미치는지 확인하려고 시도했습니다. 칼시뉴린 A-알파 유전자 및 CHOP 유전자는 1차 뉴런 세포 배양물에서 2개의 특이적 shRNA 서열에 의해 하루 동안 침묵시켰다.상기 발현은 웨스턴 블로팅에 의해 분석된다. 녹다운 세포에서 ER 스트레스 매개 칼시뉴린 A-알파 및 CHOP 수준 증가에 대한 명확한 억제가 관찰됩니다. GM2 축적 유도 ER 스트레스와 신경 변성의 가능한 연관성은 1차 신경 배양의 MAP2 면역염색을 수행하여 조사되었습니다.신경돌기 위축은 16 내지 48시간에 GM2의 배양에 의해 ER 스트레스를 유도한 후에 유의하게 증가한다. 칼시뉴린 A-알파 발현의 침묵은 특히 GM2 미처리 그룹에 비해 GM2 축적 16시간에서 신경돌기 위축을 크게 향상시킵니다. 따라서 칼시뉴린 A-알파 녹다운은 뉴런의 퇴화 과정을 가속화하여 풀린 단백질 반응의 초기 단계에서 칼시뉴린의 생존 촉진 효과를 확증했습니다.반대로, CHOP 녹다운은 정확히 16시간에서 24시간에 대조군에 비해 신경돌기 위축을 현저히 감소시켰습니다. 적절한 1차 세포 배양을 통한 세포 프로토콜 및 각각의 렌티바이러스로 감염된 세포의 90% 이상을 획득한다. 신경 말단 축삭의 손실은 우리가 공정에서 제시하는 첫 번째 단계이기 때문에 분석을 수행하여 이를 평가할 수도 있습니다.이 기술을 통해 우리 그룹과 다른 사람들은 일부 분자를 잠재적인 치료 도구로 평가할 수 있습니다.

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연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

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출처: Bender, HR, et.al. 양이온성 및 음이온성 리포솜을 사용하여 CNS에 치료용 siRNA를 전달합니다. J. Vis. 경험. (2016년)이 비디오는 리포솜 siRNA-펩티드 복합체(LSPC)를 사용하여 프리온 단백질(PrP) siRNA를 뉴런에 표적으로 전달하는 방법을 보여줍니다. 양이온성 리포좀은 PrP 표적 siRNA에 정전기적으로 결합하며, 이는 혈액-뇌 장벽을 가로지르는 수용체 매개 수송을 위해 RVG-9r 펩타이드에 의해 더욱 안정화됩니다. 일단 뇌 내부로 들어가면 LSPC는 뉴런에서 엔도사이토시스를 거쳐 siRNA를 방출하여 RNA 간섭을 시작하고 PrP 발현을 감소시키며 프리온 질병 진행을 방해합니다.

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소포체 스트레스 뉴런에서 렌티바이러스 전달 특정 shRNA에 의한 분자 조절

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