질량 분광법에 의한 단백질 고차 구조를 연구하기 위한 디틸피로카보네이트와 공유 라벨링

단백질 구조를 특성화하는 것은 그 기능을 이해하는 데 필수적입니다. 질량 분석법은 특히 전통적인 방법으로 연구하기 어려운 단백질 시스템을 위해 이 목적을 위한 강력한 도구로 부상했습니다. 질량 사양에 의한 단백질 구조를 연구하기 위해 단백질 구조 정보를 질량에 인코딩하는 용액에서 특정 화학 반응이 수행됩니다.

특히 효과적인 한 가지 방법은 접근 가능한 아미노산 사이드 체인을 해결하는 데 크게 수정하는 시약을 사용하는 것입니다. 이러한 반응은 촉매 소화 및 탠덤 질량 분광과 결합될 때 잔류물 수준 해상도로 국소화될 수 있는 질량 증가로 이어집니다. 여기서, 우리는 질량 사양 검출과 함께 공유 라벨 시약으로 diethyl 파이로카보네이트 또는 DEPC의 사용과 관련된 프로토콜을 설명했다.

DEPC는 평균 단백질에 잔류물의 최대 30%까지 라벨링할 수 있는 고전기분자로, 우수한 구조적 분해능을 제공한다. DEPC는 대량 사양과 함께 성공적으로 사용되어 다양한 단백질에 대한 구조적 정보를 얻고 있습니다. 먼저 수십 개의 마이크로몰라 범위의 농도에서 관심 있는 단백질의 완충된 용액을 준비하십시오.

우리는 일반적으로 10 밀리모어 pH 7.4 MOPS 버퍼를 사용합니다. 대안적으로, 기존 단백질 용액은 원래 시료가 뉴클레오필성 작용기가 있는 완충액을 포함하는 경우 MOPS 또는 다른 완충제로 완충교환될 수 있다. 그들은 DEPC 단백질 반응을 방해하기 때문에 버퍼는 뉴클레오필성 기능 성 단이 없는 것이 필요하다.

다른 마이크로튜브에서는 건조 아세토닐릴에 100 밀리머 DEPC의 스톡 솔루션을 준비합니다. DEPC의 가수 분해를 방지하기 위해 건조 아세토닐릴로 재고 용액을 준비하는 것이 필요합니다. 새로운 마이크로튜브에서 HPLC 급수에서 하나의 어금니 이미다졸의 솔루션을 준비하십시오.

새로운 마이크로튜브에서 MOPS 버퍼와 단백질 용액을 혼합합니다. 단백질과 버퍼에 1분 동안 37°C의 수조에 반응 혼합물을 넣기 전에 제대로 혼합되도록 DEPC 스톡 용액의 알리쿼트를 첨가합니다. 사용되는 DEPC 스톡 용액의 부피는 원하는 최종 DEPC 단백질 농도 비율을 기준으로 선택되어야 한다.

모든 단백질과 함께 작동하는 DEPC 및 단백질 농도의 한 세트는 없습니다, 최적의 DEPC 농도는 단백질에 존재하는 용매 접근 히스티딘과 리신 잔류물의 수에 따라 추정 될 수 있지만. 아세토나이트의 부피는 첨가되어, 이는 효과적으로 첨가된 DEPC 용액의 부피가 반응 중에 단백질 구조의 교란을 피하기 위해 전체 반응량의 1%를 초과해서는 안 된다는 점에 유의해야 한다. 반응 시간은 궁극적으로 사용자에게 달려 있지만, 예조건 하에서 1분 반응은 DEPC의 단백질 및 가수분해의 라벨링을 최소화한다.

1분이 지나간 후, 이미다졸을 추가하여 반응한 DEPC에 남은 것을 청소하여 반응을 해소한다. 이미다졸의 최종 농도가 DEPC 농도의 50배인지 확인합니다. DEPC에 의해 수정된 잔류물을 확인하기 위해 단백질은 펩티드 단편으로 프로테오리티로 소화되어야 합니다.

소화를 위해 관심 있는 단백질에 적합한 조건을 선택하십시오. 여기에 설명되는 일반적인 단계는 단백질을 전개한 다음 소화 효율을 개선할 수 있도록 이황화 결합을 감소시키고 알킬 수 있습니다. 우리의 경험에서, 소화 전에 데나탈과 열로 단백질을 펼치면 소화의 효율이 향상됩니다.

단백질이 전개되는 동안 적절한 소화 완충제에서 TCEP및 요오도아세타미드의 솔루션을 비교하십시오. DTT가 DEPC 변형 잔류물과 반응할 수 있으므로 TCEP는 디티오스레이톨 또는 DTT 대신 환원제로 사용해야 합니다. 감소 후 결과 파일의 알킬레이션은 무료 파일과 단백질이 수정된 아미노산과 반응하는 라벨 스크램블링을 피하기 위해 필수적입니다.

전개 단계가 완료되면 반응 혼합물에 TCEP를 추가하여 이황화물 결합을 줄이고 실온에서 3 분 동안 반응하게하십시오. 감소 후, 반응 혼합물에 요오도아세타미드를 첨가하고, 어둠 속에서 실온에서 30분 동안 반응하게 한다. 반응 혼합물을 상자에 배치하여 여기에서 달성했습니다.

요오도아세타미드의 최종 농도는 TCEP에 사용되는 농도의 두 배 또는 단백질 농도 또는 이황화물 결합의 80배이어야 한다. 관심있는 효소, 일반적으로 제조업체의 사양에 따라 트립신 또는 chymotrypsin을 준비하십시오. 선택한 효소를 준비한 후 소화를 시작하고 반응 혼합물을 섭씨 37도에서 배양합니다.

10:1 단백질 대 효소 비3 시간 소화를 사용 하 여 고정 된 효소를 사용 하 여 일반적으로 DEPC 라벨 단백질에 대 한 좋은 선택. 소화 후, 샘플은 LC-MS/MS에 의해 즉시 분석되거나 액체 질소로 동결된 플래시를 샘플링하고 라벨 손실을 최소화해야 한다. 상향식 프로테오믹스를 위한 표준 LC-MS/MS 파라미터를 사용하여 프로테오리틱 펩티드 단편상 표지된 부위를 식별할 수 있다.

역상 C18 고정 상펩티드의 최상의 분리를 달성하기 위해 사용되어야 한다. 우리의 경험에서, 모세관 LC는 사용되는 높은 샘플 양 때문에 나노 LC보다 수정 수준에 대한 보다 더 신뢰할 수있는 정량 정보를 제공합니다. DEPC 표지 펩티드를 분리하는 데 사용되는 전형적인 LC 이동상은 두 개의 용매로 구성된다.

용매 A는 0.1%의 포믹산과 용매 B를 가진 물은 0.1%의 포믹산을 가진 아세토닐릴이다. 그라데이션 용출이 사용되고 분리 시간은 샘플 복잡성에 따라 최적화될 수 있습니다. 펩티드에서 DEPC 수정 부위를 식별하려면 온라인 LC-MS 및 MS/MS를 수행할 수 있는 질량 분광계가 필요합니다.

실험에서 우리는 여러 유형의 질량 분광계를 성공적으로 사용했습니다. 우리는 열 궤도 랩 퓨전이 우수한 결과를 제공한다는 것을 것을을 발견했습니다, LC-MS 분석의 과정에서 많은 펩티드의 MS/MS를 자동으로 능력을 발휘할 수 있는 질량 분광계는 적당해야 하지만. HPLC 조건 및 질량 분광 파라미터는 측정 전에 올바르게 설정해야 합니다.

샘플이 플래시가 고정된 경우 분석 직전에 해동해야 합니다. 샘플 준비와 HPLC 주입 사이의 시간을 최소화하기 위해 최선을 다하십시오. LC 시스템에 소화된 라벨단백질 샘플을 적재하고 주입하고 LC-MS/MS 획득 또는 DEPC 라벨 사이트 식별 및 피크 영역 정량화를 시작하여 여러 가지 방법이 존재한다.

열 피셔 악기에, 엑스 칼리버 또는 proteome 발견자는 어쩌면 사용. 프로그램에서 펩티드 식별에 적합한 매개 변수를 설정합니다. DEPC 첨가 및 카르바미도메틸화는 잔류물을 지원하거나 할당하는 가변 수정으로 포함됩니다.

펩타이드의 수정 및 수정되지 않은 버전의 크로마토그래피 피크 영역은 잔류물 수준 수정 비율을 결정하는 데 사용됩니다. MS 검출을 갖춘 DEPC 라벨링은 단백질에 대한 더 높은 수주 구조 적 변화를 특성화하는 데 중요한 도구이기도 합니다. 우리의 연구에서, DEPC 공유 라벨열 및 산화 스트레스에 구조적 변화를 겪고 특정 단백질 영역을 식별할 수 있습니다.

그림에서, 변형 비율의 중요한 변화는 라벨링의 증가에 대한 라벨링과 빨간색의 감소에 대한 파란색으로 표시되며, 중요한 라벨 변경사항이없는 잔류물은 옅은 녹색으로 표시됩니다. 예를 들어, 베타-2 마이크로글로불린이 열 스트레스에 노출된 후, 라벨링 정도, N-terminus, 세린 28, 히스티딘 31, 세린 33, 세린 55, 세린 57, 라이신 58이 단백질의 한 쪽보다 더 가깝거나 리신 58이 단백질의 변화 또는 이 부위의 골망을 가지는 단백질의 한 쪽보다 가깝습니다. 단백질이 산화 스트레스에 노출된 후, 라벨링의 감소와 다른 잔류물, 세린 11, 히스티딘 13, 리신 19, 라이신 41, 리신 94 등의 다른 단계의 군집으로부터 산화 유도 확인 변화가 다른 곳에서 발생함을 나타낸다.

이 연구는 단백질 치료에 대 한 중요 한 의미를 가지고, 현재, 제약 시장의 가장 빠르게 성장 세그먼트. 우리 그룹의 다른 연구는 또한 DEPC 공유 라벨 질량 사양 감지 하 고 스트레스 단일 클 론 항체 치료에 확인 변화의 사이트를 식별할 수 있습니다 나타났습니다. 보시다시피 DEPC를 사용하여 공유 라벨링은 실험적으로 구현하기가 간단하지만 단백질에 대한 귀중한 구조 정보를 제공할 수 있습니다.

DEPC 라벨링 질량 사양에 의해 제공되는 구조적 해상도는 X 선 결정학 및 NMR과 같은 기술과 비교할 때 겸손하지만 크기 나 결정화 능력에 관계없이 거의 모든 단백질에 대한 준수입니다. DEPC 공유 라벨링 질량 사양은 단백질 혼합물과 함께 작동하며 세포 리세이트와 같은 매우 복잡한 샘플 유형과 haCat 세포로 작동 할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후, 우리는 당신이 단백질 구조를 특성화하기위한 유용한 도구를 라벨 DEPC를 찾을 수 있다고 확신합니다.