Name: 캐비테이션 강화 치료 연구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: 학습하세요 캐비테이션 강화 치료의 실시간 측정 방법을 통해 약물 전달 및 세포 생물학적 효과를 연구하는 기술입니다. 이 방법은 암 및 뇌졸중 치료 연구에 활용됩니다.

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저자는 보조금 EP / L024012/1을 통해이 작업을 지원하는 공학 및 물리 과학 연구 위원회에 감사드립니다. VB는 또한 공학 및 물리 과학 연구 위원회 (EPSRC) 및 의학 연구 위원회 (MRC)에 의해 지원됩니다 (보조금 EP / L016052/1). VB와 AV는 졸업 장학금 클라렌던 재단에 감사드립니다. AV는 또한 산탄데르 장학금엑서터 대학에 감사드립니다. 저자는 제임스 피스크와 데이비드 솔즈베리가 장치 제조에 귀중한 도움을 주도록 빚지고 있습니다. 그들은 또한 다리오 카루고 박사와 조슈아 오웬 박사가 이전 프로토타입 SAT의 개발에 기여한 것에 대해 감사하게 인정합니다.

저자는 공개 할 것이 없습니다.

모든 음향 측정에 대한 중요한 단계는 1981 년76 에서 Apfel에 의해 캡슐화되었다 "당신의 액체를 알고, 당신의 사운드 필드를 알고, 무슨 일이 일어나는지 알고." 이 프로토콜의 맥락에서, 이들은 트랜스듀서 교정 및 정렬 및 물 준비 및 거품 처리 단계를 포함한다. 첫째, 주행 트랜스듀서 및/또는 PCD를 교정하는 데 사용되는 하이드로폰자체가 일반 외부 서비스 또는 사내 비교를 통해 참조 표준에 대한 자체 비교를 통해 정확하게 보정되는 것이 필수적입니다. 마찬가지로, 구동 트랜스듀서와 PCD의 응답은 정기적으로 출력 및 / 또는 감도의 손실을 확인하는 특성이 필요합니다. 운전 조건과 시스템의 감도가 알려지지 않은 경우 노출 조건, 생물 효과 및 음향 방출 사이의 의미있는 관계를 추론하는 것은 불가능합니다. 이와 직접적으로 관련이 있는 트랜스듀서와 샘플 챔버의 정렬은 챔버 내의 노출 조건이 예상대로 이루어지고 PCD의 샘플링 부피가 관심 영역에 해당하는지 확인하기 위해 신중하게 점검되어야 합니다. 지시된 바와 같이, 일시 중단 매체의 온도 및 가스 함량은 최종 결과에 크게 영향을 미칠 수 있으며, 이러한 점에서 일관성은 매우 중요하다77,78. 마찬가지로, 캐비테이션 제제 서스펜션의 준비, 특성화 및 처리는 샘플 내에 입자의 예상 크기 분포 및 농도가 존재하는지 확인하기 위해 매우 세심한 주의를 기울여야 한다. 예를 들어, 기포의 농도가 너무 높으면 미국 측으로부터 시료 부피를 효과적으로 차폐하게 된다. MB 요원은 특히 파괴와 결합에 취약하며, 그들의 처리에 대한 추가 지침은 Mulvana 등에서 찾을 수 있습니다. al. (2012)79.
캐비테이션 신호 감지와 관련하여 매우 일반적인 문제는 적절한 SNR을 달성하는 것입니다. 이는 설명된 바와 같이 신호 자체의 특성에 부분적으로 기인하지만 실험 설정 내의 전기 소음의 원천 때문일 수도 있다. 시스템 구성 요소, 특히 공동 축 케이블과 관련된 구성 요소 간의 연결을 확인하면 이러한 구성 요소 중 일부를 제거하는 데 도움이 될 수 있습니다. 공동 축 케이블을 교체하거나 수리해야 할 수 있습니다. 전기 소음을 일으킬 수 있는 펌프와 같은 실험실에서 다른 장비를 식별하고 제거하거나 비활성화하는 것도 도움이 될 수 있습니다. 시스템 구성 요소 간의 열악한 전기 임피던스 매칭은 신호 대 노이즈 비율의 추가 원인이 될 수 있으며 장비손상의 잠재적 인 원인이 될 수 있으며 신중하게 검사해야합니다. 신호 생성기 및 오실로스코프의 트리거링 설정도 마찬가지로 실험에 맞게 구성되고 제조업체 기본 설정으로 되돌리지 않은지 확인해야 합니다. 취급 하는 동안 거품의 상당한 파괴가 있는 경우, SAT2의 경우, 출구 포트에 제2 주사기를 부착 하 고 부드럽게 챔버에서 유체를 추출 하는 이사용 하는 것이 도움이 될 수 있습니다., 따라서 현탁액에 도면. 또한 원하는 경우 매크로 버블을 제거하거나 미국 노출 중에 흐름을 활성화하는 데 도움이 될 수 있습니다.
샘플 챔버 내에서 음향 반사를 완전히 제거할 수 없으므로 입사 필드가 전체 샘플 볼륨에 완전히 균일하지 않습니다. 1.3.2 및 1.3.3 단계에서 언급했듯이 음향 창의 형질성은 주파수에 따라 달라지므로 음향 방출 측정을 위한 원하는 대역폭을 신중하게 고려해야 합니다. 특히, 더 높은 주파수 구성 요소의 상당한 다중 반사가있을 수 있습니다. 이는 완전히 조립된 시스템 내에서 필드를 보정하는 것이 사고 압력의 불확실성을 최소화하는 데 매우 중요한 또 다른 이유입니다. 기록된 신호의 적절한 게이팅은 여러 반사의 영향을 최소화하기 위해 고려해야 합니다. 편의성과 음향 투명성을 위해 상용 장치를 사용하면 일부 광학 투명성을 희생해야 합니다. 이것은 세포 생존성 또는 약 uptake를 평가하기 위하여 후속 화상 진찰, 예를 들어, 연속적인 화상 진찰의 질에 영향을 미칠 수 있습니다. 상용 장치에 사용되는 멤브레인 중 일부는 다공성이며, 따라서, 불완전한 격리는 샘플 챔버와 주변 수조 사이에 발생합니다. 위와 같이, 오염의 해당 위험을 완화할 수 있는 작은 서브 챔버를 사용 하 여, 내용물 정기적으로 교체될 수 있다. 재료의 표에 표시된 세포 배양 장치는 모든 미국 /캐비테이션 매개 생물 효과의 관점에서 조직을 대표하지 않을 수 있는 세포 단층에 주로 적합합니다. 고체 표면에 대한 세포의 근접성은 또한 도입에 설명된 바와 같이 마이크로 스트리밍 및 마이크로제트를 촉진하는 등 생체 내 의 조건을 반영하지 못할 수 있는 방식으로 MB 역학에 영향을 미칩니다. 이러한 제한은 대체 조직 모델의 간단한 대체를 통해, 그러나, 해결 될 수있다.
SAT를 제안하는 목적은 미국 중재 된 생물 효과의 연구 사이에 음향 노출 조건과 음향 방출의 재현성을 향상시키는 수단을 제공함으로써 기본 메커니즘에 대한 더 나은 이해와 안전성과 효능을 향상시키기 위한 치료 모니터링 기술의 개발을 용이하게하는 것입니다. 이 시스템은 시판되는 세포 배양 장치와 호환되도록 설계되어 관심의 적용에 따라 광범위한 생물학적 적 실험을 수행하고 높은 처리량 실험의 성능을 가능하게 하여 실행 간에 시간이 많이 소요되는 정렬 절차의 필요성을 제거합니다. 노출 조건의 특성화 및 음향 배출 포착을 위한 프로토콜을 표준화함으로써 시스템 의존적 변동성을 줄일 수 있습니다. 특정 실험을 위해 탐구해야 하는 파라미터의 범위는 응용(원하는 바이오 효과, 세포 유형, 생체 내의 경우 표적 조직의 깊이)과 사용되는 캐비테이션 제의 특성에 따라 달라집니다. 많은 변수(미국 주파수, 압력 진폭, 펄스 길이, 펄스 반복 주파수 등)를 감안할 때 전체 파라미터 공간을 완전히 탐색할 수 있는 것은 실행 가능하지 않을 것이다. 제안된 프로토콜의 장점은 이 매개 변수 공간의 일부 범위를 신속하게 설정할 수 있다는 것입니다. 예를 들어, 캐비테이션 신호가 생성되는 최소 압력, 세포 분리/사망 발생 전에 사용할 수 있는 최대 압력 또는 펄스 길이, 분수 고조파 또는 광대역 노이즈가 발생하는 압력을 측정할 수 있습니다. 이러한 범위 측정 세트는 모든 연구에서 첫 번째 단계로 수행되는 것이 좋습니다.
제시된 바와 같이, SAT는 음향 방출의 실시간 모니터링을 위해 설계되었으며, 실험 외부에서 생물학적 해석이 수행됩니다. 그러나 현미경 목표를 통해 샘플 챔버의 직접 광학 관찰을 가능하게 하기 위해 SAT를 수정하는 것은 비교적 간단할 것이다. 이것은 차례차례로 형광 및/또는 고속 현미경 계통에 결합될 수 있었습니다, 예를 들면 약 uptake 및 거품 역학의 관찰을 가능하게 하기 위하여. 전압 측면에서 현재 제시된 PCD 출력은 다음과 같이 나타냅니다: i) 캐비테이션 동작의 유형과 상대적 비율; ii) 이러한 캐비테이션 동작이 지속되는 기간; iii) 관찰된 시간 누적 노출 특성이 특정 생체 효과와 상관관계가 있는지 여부; 및 iv) 상대 수준 및 시간 종속 동작이 노출 시스템의 이전 실험과 일치하는지 여부. PCD의 수신 감도는 정량화될 수 있지만 절대 에너지 측면에서 음향 방출을 안정적으로 특성화하기 위해서는 추가 공간 정보가 필요합니다. 이는 PCD를 어레이 프로브로 교체하여 패시브 어쿠스틱 매핑(PAM)80을구현하여 달성할 수 있습니다. 그러나 신호 처리의 복잡성과 필요한 계산 시간과 전력이 증가합니다.
멤브레인 전기 저항 또는 물리적 표적화 방법의 적용을 위한 다른 계측물(예: 자기장)도 통합될 수 있다. 또한 종양 스페로이드, 오르가노이드, 또는 전 생체 조직 샘플과 같은 3차원 조직 구조를 세포 단층 대신 음향적으로 "부드러운" 젤 기판에 사용하여 보다 현실적인 조직 환경에서 미국과 캐비테이션 매개 효과를 연구할 수 있을 것이다.

초음파 (미국)는 안전하고 비 침습적 성격, 환자의 침대 옆에서의 구현 용이성 및 비용 효과1때문에진단 영상 기술로 널리 사용되어 왔다. 진단 및 모니터링 기능 옆에, 미국은 치료 응용 프로그램에 대한 상당한 잠재력을 가지고있다. 초기 연구는 혈전용, DNA 형질, 약물 전달2,3,4 및 치료 미국에서의 사용을 탐구하여 종양 치료5,6,7,면역 요법8,9,혈액 뇌 장벽 (BBB) 중단10,11,12,혈전리13,14,15, 15세균 성,16감염 및 16 세균 성 감염 및 16 세균 성 감염 및 16 감염및 16 세균 성 감염 및 16 .17의 약물 치료 및 치료 학적 영역을 나타냅니다. 이러한 응용 분야의 핵심 현상은 캐비테이션입니다: 유체압력(18,19)의변화로 인한 기체 충치의핵형성,성장 및 진동.
캐비테이션이 생물학적 효과를 생성하는 메커니즘의 범위가 있습니다. 예를 들어, 적용된 미국 필드의 영향으로 버블 진동의 고도로 비선형적 특성은 약물대류(20)를 강화하고 기포 부근의 조직에 전단 응력을 발휘할 수 있는 주변 액체에서 마이크로스트리밍을 생성할 수 있다. 이는 특히 기포가 경계 부근에 있을 때 널리 퍼져 있어 비구체를 진동시키는 거품을 일으키고, 전단 유도 투과화를 통해 잠재적으로 약물 섭취를 촉진할 수있다(21,22,23,24). 고압에서는, 더 큰 진폭 진동 및 급속한 기포 붕괴가 관찰되고, 직접 기계적응력(25)을 부여하고 자주 충격파를 생성하고, 결과적으로 조직을 방해하고 투과할 수 있는 큰 압력그라데이션(26,27)이관찰된다. 표면 근처의 기포가 붕괴되면 고속 액체 마이크로제트28,29,30이형성될 수도 있다. 이 마이크로제트는 조직을 관통할 수 있으며, 잠재적으로 모공을 만들거나 이차 스트레스 파31,32를유도할 수 있다. 조직 및 세포 수준에서 생물학적 막의 투과화는 다양하게 소노포레시스라고 하며, 주로 피부 투과성33,34,및 sonoporation의 미국 유도 향상의 맥락에서 주로 사용되는 소노포레시스로 불리며, 주로 막 기공35,36의형성으로 인한 세포막의 가역적 투과화를 설명하기 위해 주로 사용된다.
진동 거품을 둘러싼 액체의 점성 흡수는 상당한 가열 효과를 생성 할 수있습니다 (37). 또한, 고도로 비선형 진동은 구동 미국 필드보다 높은 주파수에서 음향 방사선을 생성합니다. 이것은 주변 조직에서 증가한 흡수와 추가 가열38로이끌어 냅니다. 버블 붕괴는 또한 고도반응성 종 및 전자기 방사선의 생성과 같은 버블 코어의 일시적인 고온 및 압력으로 인한 화학적효과(32)를수반할 수 있다. 이러한 효과는전달을 위한 관련 세포 경로의 잠재적 손상 및/또는 활성화를 평가하기 위해 조사되었으며, sonodynamic 치료40,41,42,43로알려진 접근 방식으로 빛에 민감한 약물의 국소 활성화에 악용되었다.
많은 미국 매개 생체 효과는 미국 필드 파라미터(압력 진폭, 주파수, 펄스 길이 및 반복 주파수 및 노출 기간)의 제어를 통해서만 개시될 수 있지만 생물학적 조직에서 캐비테이션을 안정적으로 생성하려면 종종 높은 입력 에너지가 필요하므로 손상 위험이 높아집니다. 외인성 또는 인공 캐비테이션 핵의 도입은 위에서 논의한 광범위한 효과를 생성하는 데 필요한 입력 에너지를 실질적으로 감소시킬 수 있으며, 미국과단독으로는 불가능할 수 있는 추가 효과를 추가로 소개한다. 캐비테이션 핵은 가스기포(26,44,액체 물방울45,46,47, 고체 입자48,49,50)및 나노스케일 캐비테이션 핵을 장기간 순환 시간, 개선된 사치화 및 장기간 캐비테이션 활동49,51,52,53을포함한다.
가장 일반적으로 사용되는 핵은 원래 진단 이미징에서 조영제로 사용되는 가스 마이크로 버블 (MBs)입니다. 그(것)들은 전형적으로 직경에 있는 1-2 마이크로미터이고 주변 매체에 있는 낮은 수성 용해도를 가진 고분자 중량 가스의 심을 포함합니다. 코어는 가장 일반적으로인지질(54)으로구성된 보호 지질, 단백질 또는 폴리머 쉘에 둘러싸여 있다. 미국 분야에 노출되면 MB의 압축성은 체적 진동을 겪게 하여 강력한 음향 산란을 일으키며, 이는 대조제인 MB의 성공을 책임집니다. 언급했듯이, 이러한 진동은 또한 치료 응용 분야에서 활용할 수 있는 전술한 기계적, 열 및 화학적 효과로 이어진다. MB 코팅 공정은 또한 MB 구조 내에서 약물을 캡슐화하고 약물을 MB 표면에 부착 및/또는 표적화하는 메커니즘을 제공합니다. 이 기술은 전신 독성을 줄이기 위해 약물의 트리거 방출을 용이하게55. 또한 최근에는 MB 표면의 물질이 생물학적 구조로 옮겨져 소위 "sonoprinting"56,57,58을통해 약물 전달을 강화하는 것으로 나타났다.
미국 중재 된 캐비테이션 활성의 모니터링은 시험관 내 및 생체 내 의 결과 생물학적 효과에 대한 통찰력을 제공하고 잠재적으로 이러한 효과의 튜닝 및 최적화를 허용합니다. 캐비테이션 활성을 모니터링하기 위한 가장 널리 적용되는 두 가지 방법은 i) 광학으로, 초고속 비디오 현미경을 사용하고 일반적으로 생체 내에서는 실현 가능하지 않으며, ii) 음향은 진동 및/또는 붕괴기로 생성된 재방사음 필드를 기록한다. 음향 신호의 진폭 및 주파수 구성 요소 모두 버블 거동에 대한 정보를 포함합니다. 낮은 시중 미국 진폭에서 낮은 농도의 거품은 주로 고조파 배출 (운전 주파수의 정수 배수)을 생산하는 것으로 나타났다59. 운전 압력이 증가함에 따라, 거품 방출 스펙트럼은 또한 관성 캐비테이션을 나타내는 광대역 소음뿐만 아니라 더 강한 비선형 동작을 나타내는 서브 하모닉 및 초하모닉(60)으로 알려진 분수 구성 요소를 포함 할 수 있습니다. 정수 고조파는 거품 진동의 주요 지표이지만 비선형 전파로 인해 실험 시스템의 어느 곳에서나 비선형으로 인해 발생할 수도 있습니다. 대조적으로, 분수 고조파 및 광대역 잡음은 매우 강하게 거품 역학과 상관 관계가 있습니다.
발포거동과 검출된 음향 방출 사이의 관계는 미국 의 발병 현장, 핵형성 환경 및 검출경로(60)의특성을 포함하는 요인에 의해 복잡해질 수 있다. 그럼에도 불구하고, 음향 스펙트럼에서 주파수와 에너지의 분별 동향에 의해 거품 행동과 세포와의 상호 작용에 대한 중요한 정보를 얻을 수 있습니다. 이러한 데이터는 또한 임상 치료 모니터링 기술의 기초를 형성하는 데 사용할 수있는 귀중한 정보를 제공 할 수 있습니다. 이 정보를 완전히 활용하려면 강력하고 번역 가능하며 재현 가능한 실험 방법을 개발해야 합니다.
현재 시스템을 설계하고 캐비테이션 지원 요법의 개발을 지원하기 위한 연구를 수행하기 위한 보고된 프로토콜에 상당한 변화가 있습니다. 장치의 관점에서, 디자인 접근의 범위는 착수되었습니다. 여러 그룹은 병렬 플레이트챔버56,61,62,63,사용자 정의 내장 또는 시판 용 (예 : 옵티셀, ThermoFisher 과학)을 사용했습니다. Hu et al. (2013)는 미국 초음파 모듈 및 실시간 공초점 이미징64,카루고 외와 결합된 세포 챔버를 개발했다. (2015) 미국 노출65동안 수조에 침을 수있도록 맞춤형 PDMS 뚜껑이 있는 시판가능한 세포 배양 접시를 포함하는 시스템을 사용했으며, 페레노 외(2018)는 다이나믹 버블및 버블셀상호작용의동시 광학 및 음향 특성화를 허용하는 층층형 공진기로 구성된 장치를 사용했다. 맞춤형 제작 및 응용 분야별 설계를 사용하면 미국 분야 및 기타 환경 노출 조건의 특성화가 복잡해교차 학습 비교가 어려워지므로 더욱 복잡해지고 있습니다. 예를 들어,0.02~15MHz의 중심 주파수, 1%에서 연속파까지의 중부하, 0.1~20MPa23,64,67,68,69,70(표 1)에이르는 희귀압력 등 성공적인 음포화를 달성하기 위해 확인된 미국 파라미터의 상당한 변동이 있다. 특정 생체 효과와 연관된 것으로 확인된 스펙트럼 성분(고조파, 하위 고조파 등)도 유사하게 상당한 변동이 있다.
따라서 이 작업의 목적은 캐비테이션 모니터링 기능의 특정 포함과 함께 캐비테이션 유도 세포 생물제의 체외 연구를 위한 쉽게 재현 가능한 시스템 설계 및 구현 프레임워크를 제공하는 것이다.

<table><tbody><tr><td>Absorber</td><td>Precision Acoustics</td><td>APTFlex F28 패널</td><td>1.0 cm 표준 두께</td></tr><tr><td>증폭기 (전원)</td><td>E& 주식회사 I</td>초음파 소스를 구동하는 <td>1040L</td><td>400W 전력 증폭기</td></tr><tr><td>증폭기 (pre)</td><td>Stanford Research Systems</td><td>SR445A</td><td>PCD 신호용 고정 이득 다단계 전치 증폭기</td></tr><tr><td>수족관 히터</td><td>Aquael</td><td>Ultra 50W</td><td>다양한 탱크 크기에 대한 다양한 모델.</td></tr><tr><td>디지타이저</td><td>TiePie Engineering</td><td>HS5-110-XM</td><td>확장 메모리 옵션: 채널당 32M 포인트</td></tr><tr><td>수중청음기</td><td>정밀 음향</td><td>FOH</td><td>0.01mm 직경의 민감한 영역은 지향성 효과를 최소화합니다</td></tr><tr><td>. 마이크로버블</td><td>Bracco</td><td>SonoVue</td><td>FDA 승인 마이크로버블</td></tr><tr><td>PCD 미러(SAT3)</td><td>Olympus NDT</td><td>F-102</td><td>90도 빔 반사</td></tr><tr><td>PCD 변환기</td><td>Olympus NDT</td><td>V320-SU</td><td>침수 변환기, 7.5MHz</td></tr><tr><td>PCD 방수 케이블</td><td>Olympus NDT</td><td>BCU-58-1 W</td><td></td></tr><tr><td>PDMS(SAT2 구획 뚜껑)</td><td>Corning</td><td>Sylgard 184</td><td>준비 지침은 Carugo et al. (2015) 참조</td></tr><tr><td>폴리머 로드(SAT2 씰)</td><td>Zeus</td><td>PTFE 모노필라멘트</td><td></td></tr><tr><td>고무 플러그(SAT3 뚜껑/씰)</td><td>VWR</td><td>391-2101</td><td>6mm 하단 직경, 8mm 상단 직경, 빨간색</td></tr><tr><td>신호 발생기</td><td>Agilent</td><td>33250</td><td>초음파 소스 용 파형 발생기</td></tr><tr><td>세포 노출 구획 용 기판, SAT2</td><td>Ibidi</td> <td>&micro; - 세포 노출 구획 용 접시 35mm</td><td></td></tr><tr><td>기판, SAT3</td><td>Corning</td><td>Transwell 6.5mm</td><td></td></tr><tr><td>초음파 소스 (SAT3)</td> <td>Sonic Concepts</td><td>H107 중앙 구멍</td><td>HIFU 가능 소스를 사용하면 >1MPa의 압력을 초점과 사전 초점 모두에서 생성하여 공간 범위를 확장할 수</td></tr></tbody></table> 있습니다.

캐비테이션 강화 치료 연구

Studying Cavitation Enhanced Therapy

초음파의 치료 응용에 대한 관심은 암에서 알츠하이머 병에 이르기까지 잠재적 인 임상 목표와 함께 중요하고 성장하고 있습니다. 초음파 분야 내의 기포의 형성과 후속 운동인 캐비테이션은 이러한 치료법의 대부분을 뒷받침하는 중요한 현상을 나타냅니다. 그러나 캐비테이션이 치료 효과를 촉진하고 임상적으로 구현될 수 있는 신뢰할 수 있는 모니터링 기술을 개발할 필요가 있는 행동의 상세한 메커니즘에 관한 상당한 불확실성이 남아 있습니다. 특히, 치료 효과와 그에 상응하는 음향 방출을 성공적으로 전달하는 것으로 보고된 노출 파라미터의 연구 사이에는 상당한 차이가 있다. 이 논문의 목적은 캐비테이션 매개 생체 효과에 대한 연구를 수행하기 위해 널리 사용되는 구성 요소를 사용하여 설계 지침과 실험 프로토콜을 제공하고 실시간 음향 모니터링을 포함하는 것입니다. 이 프로토콜은 음향 모니터링을 치료 초음파 실험에 보다 광범위하게 통합할 수 있게 되어 노출 조건 및 관련 바이오 효과의 상관 관계에 대한 연구를 통해 쉽게 비교할 수 있기를 바랍니다.

그림 4는 세 가지 뚜렷한 캐비테이션 동작을 보여 주며 시간 및 주파수 도메인 PCD 응답의 예를 보여줍니다. 모든 데이터는 PBS에서 5배 희석된 SonoVue MB를 사용하여 SAT3에서 수집되었으며, 최종 농도는 ~2*107 MB/ml입니다. 이 단면도의 모든 예에 대한 온도는 19± 1°C였다. 미국 공급원은 0.20(그림 4A 및 4B),0.30(도4C 및 4D),0.70MPa(도4E 및 4F)의발생 피크 음압을 달성하기 위해 0.5MHz에서 2.0 ms 펄스로 구동되었다. 신호 기록은 미국 펄스의 t = 0 시작 전에 1.4 ms시작되었습니다. 인셋 추적은 기록된(빨간색)과 2MHz 하이패스 필터(blue)로, 소스에서 셀 노출 구획에서 PCD로 비행시 중심의 시간 창에 대해 표시합니다. 이 시간 이전의 낮은 수준의 응답은 PCD가 미국 소스 뒤에 있는 구성에서 흔히 볼 수 있는 소스에서 직접 수신된 방사선 때문입니다.
가장 낮은 인시던트 압력에서 PCD 응답은 전적으로 0.5MHz 기본 미국 주파수의 정수 고조파로 구성됩니다. 0.20에서 0.30 MPa로 증가하면 추가로 높은 정수 고조파 외에도 스펙트럼에서 뚜렷한 초하모닉이 발생합니다. 0.30 MPa 결과가 펄스 지속 시간 동안 더 많은 가변성을 보여 주지만 이 두 압력에서 도메인 파형이 비슷해 보입니다. 가장 높은 압력에서 도메인 파형 진폭은 스펙트럼에서 보이는 광대역 노이즈가 명확하게 상승하여 낮은 압력에 비해 비선형적으로 증가했습니다. 이 노이즈는 일반적으로 관성 캐비테이션의 결과로 간주되며이 예에서는 MB의 파괴에 해당합니다.
이를 보다 명확하게 보려면 시간의 함수로 PCD 응답이 그림 5에표시됩니다. 왼쪽패널(그림 5A)에서전체 스펙트럼은 50초 동안 표시되며, 이 동안 소스는 0.20초마다 2.0ms 펄스를 방출한다. 해당 총, 고조파 및 광대역 전력은 오른쪽패널(도 5B)에표시됩니다. 미국은 t =3 .0 s에서 켜져 있었고, 이 때 큰 진폭 광대역 응답이 보였습니다. 초기 스파이크는 현탁액에서 가장 큰 기포의 파괴에 대응하는 것으로 생각되며 (SonoVue는 폴리 분산) 쉘 버블과 비 변형 된 미디어 (예를 들어, PBS)와 캐비테이션 실험에서 일반적인 관찰이다.
몇 초 후, 광대역 응답은 거품 파괴로 인해 빠르게 감소했으며 신호는 주로 고조파로 구성됩니다. 이는 해방된 가스와 남은 MB가 안정적으로 비불활성으로 진동하고 있음을 시사한다. t~50대에서 광대역 구성 요소는 원래 배경 잡음 수준으로 떨어졌습니다. 이와 같은 노출 테스트는 따라서 다른 거품 효과 챔버의 세포에 작용 할 수있는 기간 척도를 이해하려고 할 때 중요합니다.
기포는 특히 희석 현탁액을 처리할 때 모니터링된 캐비테이션 신호의 가변성을 증가시킬 수 있는 PCD 시야 안팎에서 미국 의 노출 및 외측 의 MB의 이동 중에 생성된 방사선 력에 반응하여 변환될 가능성이 높습니다. 따라서 PCD의 민감한 영역은 가능한 한 많은 세포 노출 표면에 걸쳐 있어야 합니다. 동일한 중심 주파수를 가진 집중및 초점이 맞지 않는 PCD의 응답 비교(그림 2참조)는 도 6에나타내며, 정상 PBS에서 20:1 의 MB 희석을 사용하여 SAT2이다. 패널 그림 6A의 시간 및 샘플 평균 스펙트럼은 초점이 맞지 않는 PCD가 고조파(도 6B)와 초하모닉 파워(도6C)에서샘플 대 시료 가변성을 감소시키는 강력한 광대역 반응을 포함하고 있음을 보여준다.
체외 세포 작업에 사용되는 미디어는 탈가스가 없으며 거품 활동의 향상된 배경 수준을 제시 할 수 있음을 인식하는 것이 중요합니다. 도 7은 공급업체가 제공한 형태로 사용되는 PBS의 SAT2와 진공 상태에서 2시간 동안 탈유한 후, 광 센서(PreSens, 독일)로 결정된 공기 포화도를 92%에서 46%로 감소시킨 후 반응을 나타낸다. 그림 7A의 스펙트럼은 노출 시간 동안 평균화되었고 5개의 독립적인 샘플로 반복되었으며, 일반 PBS에서 명확하게 높은 초하모닉을 보여줍니다. 3개의 고조파(도7B)를합산한 힘은 각 실험 출력의 표준 편차 내에 잘 있습니다. 대조적으로, 그림 7C의 초하모닉 합계는 일반 PBS가 샘플 사이의 크기가 높고 실질적으로 더 높은 가변성을 거의 가지고 있음을 보여줍니다. 이러한 예는 일반적인 세포 호환 매체가 MB의 존재에 기인할 수 있는 (잘못) 동작을 나타낼 수 있음을 나타냅니다. 세포 및/또는 캐비테이션 제안정성에 대한 부정적인 영향으로 인해 배양 배지를 탈착하는 것은 일반적으로 실용적이지 않으므로, 모든 캐비테이션 관련 연구에서 적합한 제어를 수행하는 것이 중요합니다.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig1.jpg"> 그림 1: 캐비테이션 모니터링: SAT3(D-F)을 통합한 두 개의 미국 노출 시스템 설계에 대한 그림입니다. (A)SAT2 에 의해 송신된 어셈블리와 측면 벽이 제거되어 명확성을 위해. (B)사이드 월이 그대로 있는 SAT2. (C)SAT2 세포 노출 구획, 분해. (D)SAT3 에 의해 추가 된 어셈블리. (E)SAT3 은 정상(왼쪽)과 다른 주파수에서 일치하는 빔 폭에 대한 렌즈(오른쪽) 구성입니다. (F)SAT3 셀 노출 구획, 분해. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig02.jpg"> 그림 2: 12.7mm 직경 에 대한 반 진폭 압력 필드 윤곽의 계산 (왼쪽) 및 구형 집중 (오른쪽) 트랜스듀서. 2, 4 및 8MHz의 주파수는 좌표 원점(0,0)에서 PCD 요소에 대해 각각 빨간색, 파란색 및 녹색 윤곽으로 표시됩니다. 초점 장치의 가장 바깥쪽 윤곽은 주파수에 상대적으로 민감하지 않지만 내부 구조는 주파수에 따라 다릅니다. 주파수가 증가함에 따라 구형적으로 초점을 맞춘 필드 계약은 되지만 윤곽 내부는 필드가 원활하게 다릅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig03.jpg"> 그림 3: 캐비테이션 신호 컨디셔닝 및 기록(파란색 화살표), 미국 소스 여기(빨간색 선), 데이터 수집 트리거링을 위한 계측. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig04.jpg"> 그림 4: PBS에서 5배 희석된 MB로 기록된 시간(왼쪽) 및 주파수(오른쪽) 도메인 PCD 응답. 입사 피크 음압은 (A, B) 0.2 MPa, (C, D) 0.4 MPa, (E, F) 0.7 MPa, 모두 0.5 MHz에서 신호 기록이 2.0 ms 지속시간 초음파 펄스의 t=0 시작 전에 1.4ms를 시작했다. (A, C, E) 시간 도메인 신호(빨간색)는 고정 된 수직 축척으로 표시되어 인시던트 압력으로 응답 수준이 어떻게 변경되는지 나타냅니다. 인셋 추적은 기록된(빨간색)과 2MHz 하이패스 필터(blue)로, 소스에서 셀 노출 구획에서 PCD로 비행시 중심의 시간 창에 대해 표시합니다. (B, D, F) 노이즈 및 신호 전력 스펙트럼 밀도는 각각 t&lt;0 및 t&gt;0에 대해 계산됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig05.jpg"> 그림 5: PBS에서 5배 희석된 MB의 현탁액의 50초 이상 스펙트럼 이력. (A)전체 스펙트럼 및(B)총, 고조파 및 광대역 신호 전력, 모든 시간의 함수로. 드라이브 조건은 0.5 MHz, 0.7 MPa 피크 음압, 2.0 ms 펄스 지속 시간, 200 ms 펄스 반복 기간이었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig06.jpg"> 그림 6: 일반 PBS에서 마이크로 버블의 20:1 희석으로 기록된 PCD 초점 형상의 효과. 드라이브 조건은 1.0 MHz, 0.50 MPa 피크 음압, 3.0 ms 펄스 지속 시간, 10 ms 펄스 반복 기간이었다. (A)전체 스펙트럼은 노출 시간 및 세 개의 독립적 인 샘플 반복을 통해 평균. (B)3, 4, 5MHz 의 전력,(C)2.5, 3.5 및 4.5 MHz 초하모닉의 전력. 두꺼운 선은 샘플 수단이며, 그늘진 영역은 +/- 1 표준 편차를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig07.jpg"> 그림 7: PBS로 기록된 변형된 미디어의 효과. (A)전체 스펙트럼은 노출 시간 및 5 개의 독립적 인 샘플 반복을 통해 평균. (B)3, 4, 5MHz 의 전력,(C)2.5, 3.5 및 4.5 MHz 초하모닉의 전력. 두꺼운 선은 샘플 수단이며, 그늘진 영역은 +/- 1 표준 편차를 나타냅니다. 드라이브 조건은 1.0 MHz, 0.50 MPa 피크 음압, 1.0 ms 펄스 지속 시간, 200 ms 펄스 반복 기간이었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>매개 변수</td>
			<td>단위</td>
			<td>최소</td>
			<td>최대</td>
		</tr>
<tr>
<td>빈도</td>
			<td>MHz</td>
			<td>0.02</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>압력(피크 음수)</td>
			<td>MPa</td>
			<td>0.1</td>
			<td>20</td>
		</tr>
<tr>
<td>펄스 길이</td>
			<td>사이클</td>
			<td>1</td>
			<td>CW</td>
		</tr>
<tr>
<td>듀티 사이클</td>
			<td>%</td>
			<td>1</td>
			<td>CW</td>
		</tr>
<tr>
<td>노출 시간</td>
			<td>s</td>
			<td>10</td>
			<td>1000</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 시험관 내소포화를 용이하게 하는 보고된 매개변수의 범위 요약.

제시된 실험 프로토콜은 성공적인 약물 전달 및/또는 기타 생체 효과에 필요한 조건의 조사를 가능하게 하기 위한 목적으로 세포 배양 장치에서 캐비테이션 활성의 실시간 측정을 수행하는 데 사용될 수 있다.

Interest in the therapeutic applications of ultrasound is significant and growing, with potential clinical targets ranging from cancer to ...

이러한 벤치탑 시스템 설계, 데이터 수집 및 분석 원칙은 캐비테이션 강화 치료법에 대한 체외 연구를 위한 합리적인 기초로 사용될 수 있습니다. 당사의 기술은 간격 캐비테이션 모니터링, 반복 가능한 샘플 정렬 및 일반적인 셀룰러 분석 방법과의 호환성의 중요한 실험 특성을 유지하면서 높은 처리량 테스트를 가능하게 합니다. 캐비테이션 강화 치료는 암과 뇌졸중과 같은 질병의 치료를 포함하여 여러 가지 잠재적 인 응용 프로그램을 가지고 있습니다.기초 메커니즘을 더 잘 이해함으로써 더 나은 치료법을 개발할 수 있습니다. 이 작품은 쉽게 재현 할 수있는 시스템 설계 및 구현 프레임 워크를 제공하여 다양한 캐비테이션 유도 세포 바이오 효과에 대한 연구를 가능하게합니다. 약물 전달, 소공포화 및 소노프린팅을 포함합니다.의미 있는 결과를 얻으려면 실험의 모든 변수에 대한 재현성을 보장하고 제어해야 합니다. 모든 관련 컨트롤을 수행하고 전기 소음을 측정하는 것이 필수적입니다. 음향 형질 전환 시스템을 준비하기 위해, 전파 경로에서 캐비테이션의 가능성을 최소화하기 위해 적어도 2 시간 동안 100kPa의 압력하에서 충진 액체를 배출한다.산소의 부분 압력이 10kPa 이하라는 용존 산소 프로브를 확인하는 것이 좋습니다. 시험 챔버를 천천히 채우고 공기가 탈가스 액체로 재유입되는 것을 최소화하고 트랜스듀서 및 중간 용기 표면에서 잔류 기포를 즉시 지웁니다. 초음파 소스 전원 증폭기가 제조업체의 권고에 따라 예열하여 시간과 관련하여 게인 및 출력이 안정되도록 합니다.그리고 캐비테이션제를 부드럽게 지속적으로 교반하면서 도루를 희석하여 매크로 버블을 가두거나 에이전트를 파괴하지 않고 균일한 서스펜션을 만듭니다. 마이크로 버블로 작업할 때는 조심스럽게 처리하십시오. SAT2 제제의 경우 실험을 시작하기 전에 에탄올을 사용하여 PDM 뚜껑을 살균하십시오.멸균 뚜껑을 배양 접시에 맞추어 셀 컴파트먼트를 형성하고 충전액10밀리리터가 장착된 18게이지 무딘 바늘을 장착한 10밀리리터 주사기를 적재한다. DMC 중 하나를 통해 바늘을 삽입하고 천천히 챔버를 채우는 동안 매크로 거품이 열린 채우기 구멍을 통해 탈출 할 수 있도록 기울어. 챔버가 채워지면 4~5mm 폴리머 로드를 열린 구멍에 삽입하고 구멍이 수평되도록 어셈블리를 배치합니다.여분의 액체를 주입하는 동안 바늘을 제거하여 공기가 챔버에 그려지지 않도록하고 다른 폴리머 로드로 채우기 구멍을 닫습니다. 구획을 시각적으로 확인하여 갇힌 매크로 버블의 증거를 확인하고 셀 노출 구획을 구획 홀더에 고정시킵니다. 현탁액에 있는 입자의 부력 및 그들의 부력이 세포 노출 구획의 방향을 결정할 때 세포와의 접촉에 어떻게 영향을 미치는지 고려하십시오.그런 다음 챔버 뚜껑을 수평 각도로 낮추어 매크로 버블이 장치의 잠긴 부분에 놓는 것을 방지하고 챔버 의 상단에 뚜껑을 설치합니다. 실험 측정을 수행하기 전에 서스펜션이 챔버 온도와 열적으로 평형화되도록 합니다. 미세 한 바늘 열전대를 사용하여 챔버의 온도가 안정되었는지 확인합니다.실험을 실시간으로 모니터링하려면 시간 및 주파수 도메인 모두에서 데이터 수집 프로세스를 시작하고 초음파 소스 드라이브 신호를 켭니다. 고전압 프로브를 사용하여 실험 전반에 걸쳐 초음파 소스를 구동하는 증폭기 출력 신호를 모니터링하여 노출이 예상대로 진행되고 있는지 확인합니다. 그리고 오실로스코프가 프로브 감쇠를 보상하도록 설정되어 있는지 확인하십시오.수동 캐비테이션 검출기의 시간 도메인 모니터링은 신호의 현재 계측 설정에 적합한 크기인지 여부와 캐비테이션 신호가 예상보다 일찍 보이는지 여부를 보여줍니다. 주파수 도메인 모니터링을 통해 버블 거동 유형을 분석할 수 있으며 원하는 세포 자극을 달성하기 위해 필요에 따라 드라이브 수준을 조정하는 데 사용할 수 있습니다. 이 분석에서, 가장 낮은 사고 압력에서, 수동 캐비테이션 검출기 반응은 전적으로 0.5MHz의 기본 초음파 주파수의 정수 고조파로 구성되었다.0.2에서 0.3MPa로 증가하면 추가로 높은 정수 고조파 외에도 스펙트럼에서 뚜렷한 초고조파가 나타났습니다. 0.3MPa 결과가 펄스 지속 시간 동안 더 많은 가변성을 보였지만 이 두 압력에서 도메인 웨이브 형성시간이 비슷해 보였습니다. 최고 압력에서, 시간 도메인 파 형 진폭은 마이크로 버블 파괴로 인한 관성 캐비테이션으로 인해 광대역 소음이 명확하게 상승하여 낮은 압력에 비해 비선형으로 증가했습니다.여기서 전체 스펙트럼은 소스가 0.2초마다 2밀리초 펄스를 방출하는 50초 의 노출 시간에 걸쳐 표시됩니다. 이 그래프에서 관찰된 바와 같이, 상응하는 총 고조파 및 광대역 전력을 설명하듯이, 큰 진폭 광대역 응답은 가장 큰 기포의 파괴와 상관관계가 있는 것으로 간주되는 초기 스파이크와 함께 생성되었다. 몇 초 후, 광대역 응답은 거품 파괴로 인해 빠르게 감소합니다.이 분석에서는 마이크로 버블과 일반 PBS의 20 대 1 희석을 사용하여, 시간 및 샘플 평균 스펙트럼은 초점 검출기보다 더 강한 광대역 반응을 포함하는 것으로 나타났다. 고조파 및 초고조파 전력 모두에서 시료 가변성을 샘플링하는 감소된 샘플을 동반한다. 캐비테이션 유도 된 생체 효과는 형광 현미경 검사, 유동 세포분석 또는 생물학적 분석과 같은 기술을 사용하여 평가될 수 있습니다.이것은 캐비테이션 활동과 생물학적 효과 사이의 강력한 관계의 설립을 가능하게합니다. 이 기술은 우리가 더 나은 cavitation 중재 약물 전달을 뒷받침하는 몇 가지 잠재적 인 새로운 메커니즘을 밝혀 거품 행동과 생물학적 효과 사이의 관계를 식별 할 수 있습니다.

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

microbubbles의 Insonation는 유망 감소 시간 평균 음향 파워에서 종양 절제의 전략뿐만 아니라 치료제의 타겟으로 전달됩니다. 현재 연구의 목적은 피하 C6 gliomas가 아닌 열 microvascular 박리 및 페이로드 전송을 극대화하기 위해 낮은 듀티 사이클 초음파 pulsing 전략과 nanocarriers을 개발하는 것입니다.

명암 초음파 마약 베어링 Nanoparticle 배달 및 Microvascular 절제를 통해 마우스에서 Gliomas의 치료 타겟

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단일 세포 수준에서 캐비테이션 버블 (들) -cell 상호 작용 및 결과 Bioeffects을 조사하기위한 표면 패터닝와 마이크로 유체 시스템

이 프로토콜에서는 젤 유령, 근처-적외선 펄스 레이저 빛을 고 강도 집중 초음파 (장내) 동시 노출을 통해 공동 현상의 제어 nucleation 보여 줍니다. 현상 작업 장내의 이미징 및/또는 치료 사용을 강화 하기 위한 다음 사용할 수 있습니다.

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혈액-뇌 장벽 (BBB) 일시적으로 마이크로 버블 매개 집중 초음파로 중단 될 수 있습니다 (FUS). 여기서는 비초음파 전문가가 액세스할 수 있는 모듈식 FUS 시스템을 사용하여 생체 내 고처리량 BBB 개방을 위한 단계별 프로토콜을 설명합니다.

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학습하세요 캐비테이션 강화 치료의 실시간 측정 방법을 통해 약물 전달 및 세포 생물학적 효과를 연구하는 기술입니다. 이 방법은 암 및 뇌졸중 치료 연구에 활용됩니다.

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