Name: 신경 근육 장애에 대 한 치료를 조사 하기 위해 Myoblasts에 인간 섬유 아 세포의 직접 재프로그래밍 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: 배우세요 피부 섬유아세포를 마이오블래스트로 직접 재프로그래밍하여 근육세포로 분화시키는 방법을. 이 기술은 신경근육 장애의 병리 기전 연구와 환자유래 세포를 이용한 치료 전략 테스트에 활용됩니다.

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우리는 모델에 대한 과거에 자신의 지식을 공유 빈센트 Mouly 박사에게 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립 보건국국립신경장애및뇌졸중연구소(R01 NS043264(K01 NS043264,K.M.F.에 의해 지원되고 있다. 및 R.B.W.)), 미국 국립 국립 관절염 및 근골격계 및 피부 질환 연구소 (NIAMS) (P50 AR070604-01 (K.M.F., K.M.M, R.N.및 N.W.). N.W.는 오하이오 주립 대학 / 전국 아동 병원 근육 그룹과 필립 재단으로부터 펠로우십 지원을 받았습니다. 이 작품은 또한 내부 임의 기금에 의해 지원되었으며, exon 2 건너 뛰기 작업의 일부는 CureDuchenne (K.M.F.) 및 협회 Francaise Contre 레 Myopathies에 의해 지원되었습니다. IRB 번호: IRB #: IRB10-00358/ CR00005138 및 IBCSC#: IBS00000123.

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</ol>

전국 어린이 병원은 Audentes 치료에 여기에 설명 된 엑슨 2 건너 뛰기 프로그램을 허가했다. K.M.F.와 N.W.는 이 라이센스의 결과로 로열티 지급을 받았습니다.

좋은 품질의 FM 셀라인을 얻으려면 몇 가지 단계가 중요합니다. 피부 생검이 빨리 처리될수록 건강한 섬유아세포를 얻을 확률이 높아집니다. 섬유아세포 배양의 통과 수도 중요하다. 1 차 세포는 증식 능력이 제한되어 있으며 많은 구절 후에 복제 노화로 들어갑니다. 따라서, 낮은 통로 수에 섬유아세포의 재고를 가지고 가능한 한 초기 통로에서 세포를 변환하는 것이 좋습니다. 
또 다른 중요한 단계는 또한 최대 순도와 정확한 정량화가 있는 바이러스 성 생산을 하는 것입니다. 예를 들어, qPCR을 이용한 바이러스 게놈 정량화는 합리적인 측정을 제공하지만 ddPCR(디지털 물방울 PCR)에 의한 정량화가 더 정확합니다.
또한, myoblast 변환을 위한 섬유아세포의 적당한 합류는 중요합니다. 세포가 70% 이하인 경우 80% 이상이 수렴되면 근생 분화가 손상될 수 있습니다. 세포가 너무 혼잡한 경우에, 염색과 화상 진찰을 방해하는 근사의 ...

인간 조직에서 직접 얻은 세포 모델은 원래 게놈 컨텍스트를 갖는 이점과 환자에서 관찰 된 동일한 분자 및 세포 특징을 재현하는 이점으로 많은 인간 유전 질환을 모델링하는 데 유용합니다. 신경 근육 장애의 분야에서, 근육 생검은 인간의 myoblasts의 훌륭한 소스 되었습니다 및 병리학 적 메커니즘의 해명에 도움이 되었습니다. 추가적으로, 그(것)들은 약과 유전자 치료의 생체 내 시험을 위한 중요한 공구입니다. 한편으로는 근육 파편에서 근막의 파생은 비교적 쉽습니다. 한편, 1차 근막의 문화와 유지보수는 시험관 1에서의 제한된 증식율과 복제적 노화로 인해 도전적이다. 이러한 한계에 대한 대안은 인간 텔로머라아제(hTERT) 및/또는사이클린 의존키나아제 4(CDK4)유전자2,3의삽입으로 근막을 불멸시키는 것이며, 골격근의 보존과 함께4. 그럼에도 불구 하 고, 기본 myoblasts의 집착은 여전히 근육 생검에 의존, 환자에 게 단점과 외과 수술, 많은 경우에, 고급 변성에 그들의 근육을 가지고. 따라서, 이들 환자의 근육은 섬유성 및/또는 지방 조직의 상당한 비율로 구성되며, 더 적은 근육 세포를 산출하며, 이전에 세포의 정제를 불멸으로 요구한다.
근육 생검과는 달리 피부 생검은 더 접근가능하며 환자에게 덜 해롭습니다. 1 차적인 섬유아세포는 체외에서피부 단편에서 파생될 수 있습니다. 섬유아세포는 신경 근육 장애를 일으키는 돌연변이에 의해 1차적으로 영향을 받지 않더라도, 근막으로 분화될 수 있습니다. 이는 근생 조절인인 5의 Myod 유전자의 삽입에 의해 달성될수 있다. 본 원고에서, 우리는 섬유아세포 배양의 확립에서 차별화된 근로튜브의 고독에 이르기까지, 변형된 근사를 얻기 위한 프로토콜을 설명한다(방법의 대표적인 요약은 도 1에묘사된다).
치료 전략의 전 임상 테스트는 인간 환자에서 발견되는 돌연변이와 유사한 돌연변이를 운반하는 세포 및 동물 모델에 의존합니다. CRISPR/Cas96과같은 유전자 편집 기술의 발전과 함께 동물 모델의 개발이 더욱 실현 가능해졌지만 여전히 도전적이고 비용이 많이 듭니다. 따라서, 환자 유래 세포주들은 Duchenne 근 이영양증(DMD)과 같은 질병의 돌연변이의 큰 스펙트럼을 커버하는 모형을 갖기 위하여 접근할 수 있는 선택권입니다. 세포 모형의 obtention 그리고 창조는 그 같은 병리를 위한 개인화한 치료의 발달에 중요합니다.
조사 된 개인화 된 치료 중, exon 건너 뛰기 전략은 다른 근 이영양증에 대한 유망한 치료법 중 하나입니다7,8. 이 전략은 짧지만 기능적인 단백질을 생산하는 것으로 구성됩니다. 이것은 스플리케솜에 엑슨 정의를 숨기기 하여 수행되므로 최종 메신저에서 돌연변이된 엑온을 제외합니다. 이것은 DMD에 대 한 FDA에 의해 승인 된 매우 유망한 기술. 따라서, 우리는 또한 이 프로토콜에서 기술, 2개의 다른 엑슨 건너뛰기 관련 기술로 myoblasts를 transfect하는 방법: 안티센스 올리고뉴클레오티드 (AON) 및 U7snRNA-아데노 관련 바이러스 (AAV). AON 트랜스펙트(AON transfection)는 9를 건너뛰는 엑슨을 촉진하기 위해 고안된 여러 시퀀스의 초기 스크리닝을 위한 좋은도구이다. 그러나 AO의 활동은 일시적입니다. 안티센스 서열의 지속적인 발현을 얻기 위해, 우리는 또한 AAV와 결합된 작은 핵 RNA(snRNAs)를 탐구하여 접합 기계10에핵 국소화 및 포함을 허용했습니다. U7은 휘장모가반사시퀀스(11)로리디렉션하고 안티센스 서열을 전달하는 단백질을 결합하도록 설계될 수 있는 히스톤 mRNA의 처리에 관여하는 snRNA이다. AAV 벡터와 함께 수정된 U7 snRNA를 사용하면 AON의 한계를 극복하고 AON의 지속적인 발현과 관심 있는 조직의 더 나은트랜스듀션(12)을생성한다. 우리는 엑슨 건너뛰기 전략을 설명하기 위하여 이 프로토콜을 위해 DMD 환자에게서 파생된 세포를 이용합니다.

<table><tbody><tr><td>100mm 접시</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA, 페놀 레드</td><td>Thermo Fisher</td><td>2500056</td><td></td></tr><tr><td>10X 인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3994</td><td></td></tr><tr><td>12웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>20X 전달 버퍼</td><td>Thermo Fisher</td><td>NP00061</td><td></td></tr><tr><td>20X Tris-acetate SDS 러닝 버퍼</td><td>Thermo Fisher</td><td>LA0041</td><td></td></tr><tr><td>3-8% Tris-Acetate gel</td><td>Thermo Fisher</td><td>EA0378BOX</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 flask</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimicotic 100X</td><td>Thermo Fisher</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Anti-myosin heavy chain, sarcomere antibody</td><td>Developmental Studies Hybridome Bank</td><td>MF20 superlabant</td><td>Dilution 1:50</td></tr><tr><td>항산화</td><td>Thermo Fisher</td><td>NP0005</td><td></td></tr><tr><td>BCA 단백질 분석</td><td>Thermo Fisher</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>시그마-알드리치</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>써모 피셔</td><td>D3571</td><td>희석 1:1000</td></tr><tr><td>디지토닌</td><td>밀리포어 시그마</td><td>300410250MG</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드</td><td>시그마-알드리치</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 고포도당, GlutaMAX 보충제, 피루브산</td><td>써모 피셔</td><td>10569044</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I 세트 (250U)</td><td>자이모 리서치 코퍼레이션</td><td>E1010</td><td></td></tr><tr><td>독시사이클린 하이드로클로</td><td>라이드 피셔 사이언티픽</td><td>BP2653-5</td><td></td></tr><tr><td>Dup2 인간 프라이머</td><td>Fw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG TTTCTC 3'Rv_5</td><td>' CTTTTGGCAGTTTTTGCC CTGT 3'</td><td></td></tr><tr><td>디스트로핀 항체</td><td>Abcam</td><td>ab15277</td><td>희석 1:200</td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Thermo Fisher</td><td>16000</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 마우스, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11001</td><td>희석 1:1000</td></tr><tr><td>중단 프로테아제 억제제 칵테일 100X</td><td>Thermo Fisher</td><td>78430</td><td></td></tr><tr><td>혈구계</td><td>Hausser Scientific</td><td>3100</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>Thermo Fisher</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680RD 염소 안티 토끼 IgG (H+L)</td><td>Li-Cor</td><td>926-68071</td><td>희석 1:5000</td></tr><tr><td>Lab-Tek II CC2 챔버 슬라이드 시스템</td><td>Thermo Fisher</td><td>15852</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli</td><td>Bioworld</td><td>105700201</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 Transfection 시약</td><td>Thermo Fisher</td><td>L3000008</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel GFR 멤브레인 매트릭스</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412P-4</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty 냉동 용기</td><td>Thermo Fisher</td><td>51000001</td><td></td></tr><tr><td>니트로셀룰로오스 멤브레인 0.45 &micro; m</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>10600002</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum Control</td><td>Thermo Fisher</td><td>10000C</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Blocking Buffer (PBS)</td><td>Li-Cor</td><td>927-40003</td><td>웨스턴 블롯</td></tr><tr><td>Opti-MEM I 저감 혈청 Medium</td><td>Thermo Fisher</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PCR 마스터 믹스</td><td>Thermo Fisher</td><td>K0172</td><td></td></tr><tr><td>포스파타제 억제제</td><td>Thermo Fisher</td><td>A32957</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Dual Color Standards</td><td>Bio Rad</td><td>1610374</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1113803</td><td></td></tr><tr><td>Revert 700 Western Blot Normalization</td><td>Li-Cor</td><td>926-11021</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid 키트</td><td>써모 피셔</td><td>K1691</td><td></td></tr><tr><td>RNA 클린 & Concentrator-25</td><td>Zymo Research Corporation</td><td>R1018</td><td></td></tr><tr><td>메스</td><td>아스펜 외과 372611</td><td></td><td></td></tr><tr><td>골격근 세포 분화 매체</td><td>Promocell</td><td>C23061</td><td></td></tr><tr><td>골격근 세포 성장 매체</td><td>Promocell</td><td>C23060</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Acros 유기물</td><td>215682500</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol 시약</td><td>Thermo Fisher</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337500</td><td></td></tr><tr><td>초저온 냉동고</td><td>Thermo Scientific</td><td>7402</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td><td>Thermo Fisher</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield 퇴색 방지 마운팅 매체</td><td>Vector Labs</td><td>H1000</td><td></td></tr></tbody></table>

신경 근육 장애에 대 한 치료를 조사 하기 위해 myoblasts에 인간 섬유 아 세포의 직접 재프로그래밍

Direct Reprogramming of Human Fibroblasts into Myoblasts to Investigate Therapies for Neuromuscular Disorders

근 이영양증에 있는 병리생리학 그리고 치료 표적 둘 다에 대한 조사는 인간 myoblasts의 제한된 증식 능력에 의해 방해되었습니다. 몇몇 마우스 모형은 만들어졌습니다 그러나 그(것)들은 질병의 인간적인 생리병을 진정으로 대표하지 않거나 인간에서 찾아낸 돌연변이의 넓은 스펙트럼의 대표적이지 않습니다. 인간의 기본 근간이 불멸하는 것은 이 한계에 대한 대안이다. 그러나, 그것은 여전히 근육 생검에 의존, 침략 적이 고 쉽게 사용할 수. 대조적으로, 피부 생검은 환자에게 쉽게 얻고 더 적게 침략적입니다. 피부 생검에서 파생된 섬유아세포는 심근세포로 불멸하고 분화될 수 있으며, 우수한 근생잠재력을 가진 세포의 원천을 제공합니다. 여기서는 섬유아세포의 빠르고 직접적인 리프로그래밍 방법을 근생 계보로 설명합니다. 섬유아세포는 두 개의 렌즈피바이러스로 변환됩니다: hTERT는 1차 문화와 테트 유도할 수 없는 MYOD로,독시사이클린을 첨가하면 섬유아세포를 근막세포로 전환한 다음 후기 분화 마커를 표현하는 성숙근투로 변환합니다. 이 빠른 이차 성전환 프로토콜은 병리학 적 메커니즘을 조사하고 신경 근육 장애에 대한 혁신적인 유전자 기반 또는 약리학적 생물 요법을 조사하는 강력한 도구를 나타냅니다.

이 프로토콜은 인간의 피부 유래 섬유아세포 배양을 확립하고 근막세포로 변환한 다음 차별화된 근문으로 변환하는 방법을 보여줍니다. 세포주의이 유형은 신경 근육 장애의 연구 와 잠재적인 치료의 체외 테스트에 매우 유용합니다.
섬유아세포 변환의 회로도 표현은 도 1에도시된다. 도 2A는 피부의 파편과 섬유아세포가 그것에서 나오는 것을 보여줍니다. 섬유아세포는 합류에 도달하면 새로운 접시에 전달되어야한다(그림 2B). 도 3A는 독시사이클린으로 보충된 근아세포 성장 매체로 변경하기 전에 섬유아세포의 이상적인 합류를 나타낸다. 세포는 변환 과정에서 여전히 증식하기 때문에 약 70 % 컨실수있어야합니다. 세포가 80% 이상인 경우 분화가 손상될 수 있습니다. 근세...

이 프로토콜은 근막세포로 피부 섬유아세포의 변환과 근투로의 분화를 설명합니다. 세포주 신경 근육 장애를 가진 환자에서 파생 되 고 병리학 적 메커니즘을 조사 하 고 치료 전략을 테스트 하는 데 사용할 수 있습니다.

신경 근육 장애에 대 한 치료를 조사 하기 위해 Myoblasts에 인간 섬유 아 세포의 직접 재프로그래밍

Investigations into both the pathophysiology and therapeutic targets in muscular dystrophies have been hampered by the limited proliferative capacity of ...

안녕하세요 여러분. 제 이름은 니콜라스 인입니다. 저는 오하이오 주 콜럼버스에 있는 전국 아동 병원의 수석 연구원입니다.그리고 오늘 우리는 당신에게 피부 생검을 복용하고 myoblasts및 myotube로 변환하는 방법에 대한 비디오를 보여 줄 거야. 이것은 신경 근육 장애를 공부 하는 매우 유용한 도구. 또한 이러한 유형의 셀에 직접 대처하기 위해 두 가지 유형의 바이러스를 사용하고 있기 때문에 IPSC에 비해 기술이 더 빠른 방법입니다.이 비디오는 인간 피부 유래 섬유아세포 배양을 확립하고, myoblasts로의 전환, 그리고 근관을 차별화하기 위한 프로토콜을 보여줍니다. 피부 생검은 진피 섬유아세포를 도출하기 위하여 세포 배양으로 옮겨질 것입니다. hTERT 및 MYOD 유전자를 운반하는 렌즈 바이러스는 이 섬유아세포를 변환하기 위하여 이용됩니다.독시사이클린으로 보충된 myoblast 성장 배지를 첨가하면 MYOD 유전자가 발현되어 섬유아세포가 myoblasts로 전환됩니다. 다음으로, 매체는 분화 매체로 전환되고, 또한 독시사이클린으로 보충된다. 그런 다음 근막세포가 서로 융합되어 다중 핵처리된 근사튜브를 형성합니다.튜브에서 미디어를 흡습하고 10 밀리리터로 생검을 헹구고 실온에서 1 개의 x PBS를 세 번 헹구십시오. 세 번째 세척 후, 튜브에 PBS를 둡니다. PBS와 피부 생검을 10센티미터 제곱 접시에 붓습니다.멸균 메스를 사용하여 생검을 가능한 한 작은 조각으로 자른다. 파이펫을 사용하여 개별 스킨 피스를 멸균 10센티미터 제곱 접시에 전달합니다. 각 조각 주위에서 PBS의 초과를 흡인.조각 자체를 흡인하지 않도록주의하십시오. 뚜껑으로 접시를 부분적으로 덮고 피부 생검 조각이 5~20분 동안 건조되도록 합니다. 조각이 너무 오래 건조하지 마십시오.조각이 건조되면, 45도 각도로 접시를 기울이고 천천히 접시의 모서리에 섬유 아세포 매체의 12 밀리리터를 추가합니다. 접시를 낮추고 미디어를 조심스럽게 배포하여 조각이 언론에 의해 들어 올리지 않도록합니다. 요리를 인큐베이터에 넣습니다.5~7일, 그 후 일주일에 한 번 으로 미디어를 교체하십시오. 1차 섬유아세포는 다음 날 약 50%의 인플루엔티지를 갖기 위해 12개의 웰 플레이트, 약 20, 000개의 세포, 12개의 우물의 2개의 우물에서 1차 섬유아세포에 있다. 렌티바이러스 트랜스듀션의 경우, hTERP Puromycin Lentivirus의 2~50억 개의 바이러스 게놈과 400마이크로리터의 섬유아세포 배지를 추가합니다.렌티바이러스 믹스를 한 가지 우물에 추가합니다. 두 번째 우물에 섬유 아세포 배지의 단지 400 마이크로 리터를 추가합니다. 다음 날, 미디어의 1 밀리리터를 추가합니다.1~2일 후, 세포를 6개의 우물 판으로 옮기고 60~70%의 합류에 도달할 때까지 성장합니다. 푸로마이신의 밀리리터 당 1 마이크로그램으로 섬유아세포 배지를 보충하고 각 웰에 2밀리리터를 추가합니다. 제어의 모든 세포가 적어도 12 일 동안 죽을 때까지 셀을 선택하여 2 ~ 3 일마다 미디어를 변경하십시오.종자 H 차트는 다음 날 약 50 %의 합류를 가지고 12 웰 플레이트의 세 우물에서 30 %의 합류에서 섬유 아세포를 표현한다. 렌티바이러스 트랜스듀션의 경우 MYOD Hygromycin B 렌즈티바이러스의 2~50억 바이러스 게놈과 400마이크로리터의 섬유아세포 배지를 혼합하여 2개의 우물에 추가합니다. 다음 날 1 밀리리터의 배지를 추가합니다.1~2일 후에 세포를 6개의 우물 판으로 옮기고 60~70%까지 성장합니다. Hygromycin B.의 밀리 리터 당 400 마이크로 그램으로 성장 미디어를 보충 합니다 각 잘 에 두 밀리 리터를 추가. 제어 우물의 모든 세포가 죽을 때까지 셀을 선택하던 상태로 유지하여, 일반적으로 적어도 12일을 복용하여 2~3일마다 미디어를 변경합니다.myoblasts의 유도를 위해, 그(것)들이 70%의 confluent 때까지 섬유아세포를 성장합니다. 독시사이클린밀리리터당 8마이크로그램을 근막세포 성장 배지에 넣습니다. 항상 독시사이클린과 매체의 신선한 알리쿼시를 사용하십시오.매체는 미디어가 변경되기 직전에 준비해야 합니다. 또한 독시사이클린은 재고정해서는 안 됩니다. 섬유아세포 배지를 흡인하고 PBS로 세포를 헹구십시오.보충 된 myoblast 미디어의 10 밀리리터를 추가합니다. 2 ~3 일 후, 세포는 90 ~ 95 %의 컨실레이며 형태가 변경됩니다. myoblast 성장 매체를 흡인하고 PBS로 세포 표면을 헹구는.신선한 독시사이클린의 밀리리터 당 8 마이크로그램으로 보충된 분화 매체의 10 밀리리터를 추가하십시오. myotube가 형성될 때까지 2~3일마다 미디어를 계속 변경합니다. 근전분분이 개시된 지 7~10일 후에 세포는 완전히 분화되어야 하지만, 이는 한 세포주에서 다른 세포주에서 다릅니다.첫 번째 섬유아세포는 피부 조각이 배양된 지 5일 후에 나타날 수 있다. 사진 B에서 섬유아세포는 컨실카로되어 75센티미터 의 사각형 플라스크로 옮겨져 추가 확산을 위해 준비됩니다. 1 차 세포가 복제 노화를 입력할 때 낮은 통로 수에 섬유 아세포의 몇몇 유리병을 동결하는 것이 중요합니다.일단 FM 세포주가 근사로 섬유아세포의 변환을 위해 설치되면, 섬유아세포는 그림A.에 도시된 바와 같이 70%의 컨플루천까지 증식해야 하며, 고밀도가 분화를 저해할 수 있기 때문에 80%의 수렴을 초과하지 않는 것이 중요합니다. 덩어리세포선을 배지에 첨가한 후, 2~4일 이내에 세포가 근막세포가 되고, B.분화된 심투포가 그림C.분화된 myotubes에 나타난 것과 같이 길쭉한 형태와 병렬 방향을 특징으로 하는 것은 셀 게노타입에 따라 7일에서 21일까지 다양할 수 있다. 세포가 분리되기 전에 수집하거나 고정해야 합니다.분리의 시작은 이 그림의 화살표에 의해 지적된 바와 같이, myotube 가장자리의 색상과 밝기에 의해 관찰될 수 있다. 면역 형광에 의해, 성숙한 근육 특정 단백질의 발현은 근사로 섬유 아세포의 성공적인 변환을 확인합니다. 이 사진에서는 세 가지 다른 세포가 표시됩니다.분화의 정도는 세포마다 다르며, 모델의 C.추가 검증이 RNAeq에 의해 확인되었다. 이 플롯에 나타난 바와 같이 12개 이상의 분현유전자가 있으며, 000개의 분화 유전자는 해골 근육에 비해 FM 심포튜브에서 검출된다. 두 전사 사이의 중요한 상관 관계는 FM 세포가 근육 유래 세포주를 위한 유용하고 신뢰할 수 있는 대리임을 보여주는 근육 특정 발현 프로파일을 가지고 있음을 뒷받침합니다.이 시험관 내 모델의 유용성을 설명하기 위해 DMD 유전자에서 가장 흔한 외장 복제 중 하나를 사용했습니다. Exon 2의 복제는 DMD 판독 프레임의 중단으로 이어지며, 건너뛰기는 해당 판독 프레임의 복원 또는 내부 리보솜 진입 사이트의 활용으로 이어질 수 있습니다. 이 치료법은 이미 생체 내 연구 그림 A로 검증되었으며, 우리는 엑슨 건너뛰기에 의한 치료 유무에 관계없이 이 특정 돌연변이 세포주의 RTPCR 분석에 의한 개념 증명을 입증했습니다.도 B의 서쪽 얼룩은 기능성 Dystrophin 단백질이 처리된 세포에서 발현된다는 것을 보여줍니다. 이 치료법의 효율을 생체 내 모델과 비교할 때, 결과는 세포 분화 기술의 신뢰성을 지원하고 다양한 돌연변이 특이적 유전자 치료를 테스트하기 위한 사용을 지원합니다. 신경 근육 장애에 대한 공식 치료 지원의 효능을 테스트하는 데 필요한 임상 연구 전에, 동물 및 세포 모델의 능력에 따라.동물 모델의 개발, 비록 요즘 쉽게 되 고, 각 특정 돌연변이에 대 한 그것의 실현 가능한 옵션. 진피 섬유아세포에서 유래된 IPS 세포를 통한 근막세포의 생성은 대안이지만 시간이 많이 걸리는 기술입니다. 따라서, 이 절차는 자궁 근막으로 섬유 아세포의 직접 변환을 허용하는 IPS 생성에 대한 간단한 대안이다.그것은 근육 생검의 더 침략적인 응용을 피함으로써 인간 세포 모형에 접근을 용이하게 합니다 결론에서, myoblasts로 섬유아세포의 이 직접적인 변환은 특정 맥락을 제한하는 신경 근육 무질서를 위한 치료를 시험하기 위한 강력한 공구입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

우리는 함께 retroviral Oct3 / 4, Sox2, Klf4과 c-myc (OSKM)를 인코딩 벡터, 라이브 염색법에 의해 정확하게 다시 프로그램 hiPSC의 신분을 이용하여 인간의 유도된 pluripotent 줄기 세포 (hiPSC) Tra-로 인간의 체세포의 효율적인 언어학 재활을위한 프로토콜을 제시 1-81 항체.

인간 유도 Pluripotent 줄기 세포의 선택 및 분리 식민지는 성인 섬유아 세포에서 다시 프로그램

myoblast 이식의 성공 여부를 평가하는 비 침습적 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 그의 표현 다른 이미징 modalities를 이미징 할 수 있습니다 유전자로 구성된 통합 된 퓨전 리포터 유전자의 장점을 걸립니다. 여기, 우리는...

이식 근육 전구 세포를 타겟팅 할 수 분자 이미징

이 프로토콜은 근이영양증 환자로부터 소변 유래 세포를 분리하기 위한 상세한 절차를 수반하며, 센다이 바이러스 형질전환(Sendai virus transduction)을 통한 효율적이고 신속한 재프로그래밍  을 수반합니다.

근육 영양 장애 환자에서 유도 만능 줄기 세포의 생성 : 소변 유래 세포의 효율적인 통합이없는 프로그램을 다시

이 프로토콜은 근육 또는 피부 조직에서 근육 및 섬유아세포 세포주의 살아있는 세포를 분리하고 1차 배양하는 기술을 설명합니다.  이러한 세포주를 불멸화하는 기술도 설명됩니다.  전체적으로 이러한 프로토콜은 다운스트림 애플리케이션을 위해 환자 유래 세포를 생성하고 보존할 수 있는 신뢰할 수 있는 도구를 제공합니다.

질병 모델링을위한 근육 조직 검사에서 환자 유래 세포주의 분리 및 멸화

유도 만능 줄기 세포의 생성은자가 이식의 유도에 대한 매혹적인 전망을 제공합니다. 그러나, 만능 상태와 힘든 다시 차별화를 통해 진행은 여전히​​ 임상 번역을 방해한다. 여기에서 우리는 성인 인간 섬유 아세포의 유도와 유도 된 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환과 신경 계통에 후속 차별화를 설명합니다.

성인 인간 섬유 아세포의 유도 및 확장 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환

직접 신경 프로그래밍 시작 체세포의 나이 유지 하는 신경 세포 생성 합니다. 여기, 우리는 성인 인간 기증자 로부터 얻은 피부 섬유 아 세포에서 유도 된 신경 세포를 생성 하는 단일 벡터 기반 방법을 설명 합니다.

성인 인간 피부 섬유 아 세포에서 유도 된 신경의 고수익 문화의 간단한 세대

여기 선물이 overexpression Mef2c, GATA4, Hand2, Tbx5, 미르-1, 그리고 미르-133 (GHMT2m) TGF-β 신호 전달의 억제와 함께 통해 기능 cardiomyocytes에 기본 미 발달 섬유 아 세포를 재 설 정할 하는 강력한 방법. 우리의 프로토콜 생성 박동 cardiomyocytes 일찍 최대 60 %7 일 후 변환 효율.

프로 거리 신호 억제 유도 Cardiomyocytes에 마우스 미 발달 섬유 아 세포의 프로그래밍 요소 중재 Potentiates

여기 우리 재활 요인 인코딩 수정된 mRNAs를 사용 하 여 유도 만능 줄기 세포로 인간의 기본 섬유 아 세포를 재 설 정할 임상 관련, 높은 효율, 피더 무료 메서드를 설명 하 고 성숙한 예측에 관한-367/302 모방. 또한는 재활 효율성을 평가 하는 방법 클론 iPSC 식민지 확장 및 pluripotency 마커 TRA-1-60의 식을 확인 있습니다.

인간의 기본 섬유 아 세포의 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍 RNA 기반

세포 재프로그래밍은 다능성 세포 상태를 조절하고 유지하는 주요 유전자의 도입을 요구합니다. 기술된 프로토콜은 바이러스/통합 방법 없이 인간 진피 섬유아세포로부터 유도된 만능 줄기 세포(iPSCs) 콜로니의 형성을 가능하게 하지만, 세포 방어 메커니즘을 감소시키는 면역 회피 인자와 결합된 비변형 RNA(NM-RNAs)를 사용한다.

비통합 방법을 사용하여 복부 피부에서 성인 인간 진피 섬유 아세포의 분리 및 유도 만능 줄기 세포의 생성

우리는 유도 된 신경 전구 세포 (iNPC)로 인간의 피부 유래 섬유 아세포와 유도 된 천체 세포 (iA)로 후속 분화를 재프로그래밍하는 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 대량으로 iNPC 및 iA의 빠르고 재현 가능한 생성으로 이어집니다.

섬유아세포에서 신경 전구세포로의 직접 변환을 이용한 신경질환 시험관 모델링 및 성상세포로의 분화

여기에서는 멜라노사이트를위한 최적화 된 직접 재 프로그래밍 시스템과 원활한 직접 재 프로그래밍을 보장하는 고효율, 집중 바이러스 포장 시스템에 대해 설명합니다.

마우스 섬유아세포를 멜라노세포로 직접 재프로그래밍

배우세요 피부 섬유아세포를 마이오블래스트로 직접 재프로그래밍하여 근육세포로 분화시키는 방법을. 이 기술은 신경근육 장애의 병리 기전 연구와 환자유래 세포를 이용한 치료 전략 테스트에 활용됩니다.

신경 근육 장애에 대 한 치료를 조사 하기 위해 Myoblasts에 인간 섬유 아 세포의 직접 재프로그래밍

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