Name: 사카로미세스 세레비시아스 스플리케소터 서브콤플렉스의 과도성 행위자 검출을 위한 그라픽스의 활용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-09T15:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: 학습하세요 글리세롤 그라디언트 원심분리와 가교제를 이용한 그라디언트 고정법으로 사카로미세스 세레비시아스의 스플라이소솜 과도성 상호작용을 분석하는 방법을. 이 기술은 느슨한 단백질 결합을 안정화하여 특정 스플라이싱 인자 상호작용을 식별합니다.

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1. 효모 총 추출물 준비
<ol><li>TAP태그9에 융합된 접합인자 중 하나를 발현하는 효모 세포를 성장시키는 데 적합한 아미노산 또는 핵염기와 함께 L YNB-glu 미디어(효모 질소 기준 2%m/v 포도당으로 보충됨), 이 경우 아데닌(20 μg/mL), 류신(30 μg/mL), 트립토판(30 μg/mL), OD600 = 1.0까지.</li>
	<li>1L 배양으로부터 100mL 원심분리기 병 3개에서 17,000x g에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 수집하고 10mL 의 차가운 멸균물로 두 번 세척한다.</li>
	<li>수집된 효모 세포를 콜드 버퍼 A의 세포 부피 1/10에서 재연하여(10mmolL-1 HEPES pH = 7.9, 1.5mmol L-1 MgCl2,50mmolL-1 KCl, 5% v/v 글리세롤, 0.5mmolL-1 DTT, EDTA-프리 프로제스트 억제제).</li>
	<li>액체 질소에 셀 현탁액의 작은 방울을 동결. 작은 방울은 재중단 된 세포 용액을 파이프팅하고 50 μL을 액체 질소에 직접 떨어뜨려 얻을 수 있습니다. 주의: 액체 질소는 피부 또는 눈과 접촉하여 부상을 입을 수 있습니다. 적절한 안전 장비를 사용하여 처리하십시오. 참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 셀 서스펜션의 냉동 방울은 -80 °C에 저장 될 수있다.</li>
	<li>20Hz/s에서 6사이클을 통해 볼밀 장치에서 3분 동안 효모 세포용광을 준비합니다. 참고: 각 주기 후에, 녹지 않도록 액체 질소에 얼어붙은 세포를 품고 있는 용기를 담그세요. 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 냉동 추출물은 -80°C에 보관할 수 있습니다. 효모 접합 추출물은 균질화제를 사용하여 구엽세포10을용해하거나 박격포 및유봉(11,12)을사용하여 제조할 수 있다.</li>
	<li>실내 온도에서 물에 들어 있는 튜브를 물에 넣고 가끔 흔들어 서 추출물을 녹입니다.</li>
	<li>원심분리기는 4°C에서 1h에 45,000 x g에서 추출합니다.</li>
	<li>BCA방법(13)에의해 지워진 상체의 단백질 함량을 정량화한다.</li>
	<li>추출물의 알리쿼트를 준비하고 액체 질소에 빠르게 고정하고 -80 °C에 보관하십시오. 참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.</li>
</ol>2. 글리세롤 그라데이션 준비
<ol><li>버퍼 A에 두 개의 글리세롤 솔루션을 준비, 하나는 포함 10% v/v 와 다른 포함 30% v/v 글리세롤.</li>
	<li>30% v/v 글리세롤 용액에 교차 연결 제글루타랄데히드를 0.1% v/v에 넣고 혼합하여 균질화합니다. 주의: 적절한 안전 장비를 사용하여 연기 후드 내부의 글루타랄데히드를 처리하십시오.</li>
	<li>12mL 원심분리기 튜브(14 x 89mm) 하단에 차가운 10% v/v 글리세롤 용액 6mL를 추가합니다.</li>
	<li>튜브 하단에 그라데이션 마스터 장치가 제공된 긴 바늘에 부착된 주사기로 글루타랄데히드로 보충된 감기 30% v/v 글리세롤 용액6mL을 10% v/v 글리세롤 용액 아래에 추가합니다. 참고: 또는, 10% v/v 글리세롤 용액은 30% v/v 글리세롤/글루타랄데히드 용액의 상단에 조심스럽게 파이프화될 수 있다.</li>
	<li>그라데이션 마스터 장치를 사용하여 연속 밀도 그라데이션을 생성합니다. 참고: 그라데이션 마스터 장치에서 튜브는 매개 변수(시간/각도/속도)를 결정하기 위한 제조업체의 권장 사항에 따라 적절한 랙에 배치되고 잠시 회전됩니다. 이 작품에서 우리는 사용 : 2:25 분 / 81.5 ° / 11 rpm.</li>
	<li>셀 추출물을 첨가하기 직전에 7% v/v 글리세롤/버퍼 A 쿠션의 200 μL을 조심스럽게 상단에 넣습니다. 참고: 쿠션의 글리세롤 농도는 선형 그라데이션을 만드는 데 사용되는 농축 글리세롤 용액보다 낮어야 합니다.</li>
</ol>3. 원심분리추출
<ol><li>쿠션으로 12mL 선형 글리세롤 그라데이션 10%-30% 글루타랄데히드의 상단에 총 단백질 약 2 mg을 적재합니다.</li>
	<li>미리 냉각된 스윙 버킷 로터에 튜브를 놓습니다. 참고: 초원심분리 전에 혼합하지 않도록 튜브를 부드럽게 처리합니다.</li>
	<li>원심분리기는 4°C에서 16h의 194,000 x g에서 원심분리기.</li>
	<li>Aliquot각 12 mL 튜브24 500 μL 분획적응 된 EconoSystem을 사용 하거나 신중 하 게 파이펫팅에 의해 분수. 참고: 적응된 EconoSystem은 연동 펌프, UV 검출기 및 튜브 천포링 장치에 연결된 분수 수집기로 구성됩니다. 침전 프로파일은 280 nm에서 흡광도의 측정에 의해 모니터링될 수 있다.</li>
	<li>연동 펌프를 통해 40% v/v 글리세롤 용액을 사용하여 튜브에서 분획 수집기로 글리세롤10%-30%의 그라데이션을 밀어넣습니다. 참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 사용 전까지 분획을 -80°C에 보관합니다.</li>
	<li>점 얼룩 또는 슬롯 블롯 장치에 니트로 셀룰로오스 멤브레인에 직접 각 분획의 50 μL을 로드합니다. CBP에 대한 항체를 이용한 면역블롯(1:6,000, TAP 태그의 CBP 부분을 검출함) 및 호스레디시어 페록시다제(1:15,000)와 결합한 항래빗 IgG를 이차 항체로 검출한다.</li>
</ol>

<ol><li>Kastner, B., Will, C. L., Stark, H., Lührmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+nuclear+pre-mRNA+splicing+in+higher+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural insights into nuclear pre-mRNA splicing in higher eukaryotes.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (11), 032417(2019).</li>
<li>Yan, C., Wan, R., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+pre-mRNA+splicing+through+structural+biology+of+the+spliceosome%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of pre-mRNA splicing through structural biology of the spliceosome.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (1), 032409(2019).</li>
<li>Cordin, O., Hahn, D., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+function+and+regulation+of+spliceosomal+RNA+helicases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Structure, function and regulation of spliceosomal RNA helicases.</a> Current Opinion in Cell Biology. 24, 431-438 (2012).</li>
<li>Kastner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GraFix%3A+sample+preparation+for+single-particle+electron+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">GraFix: sample preparation for single-particle electron cryomicroscopy.</a> Nature Methods. 5 (1), 53-55 (2008).</li>
<li>Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grafix%3A+stabilization+of+fragile+macromolecular+complexes+for+single+particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Grafix: stabilization of fragile macromolecular complexes for single particle cryo-EM.</a> Methods in Enzymology. 481, 109-126 (2010).</li>
<li>Yan, C., Wan, R., Bai, R., Huang, G., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+yeast+activated+spliceosome+at+3.5+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of a yeast activated spliceosome at 3.5 Å resolution.</a> Science. 353 (6302), 895-904 (2016).</li>
<li>Ohi, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+analysis+revelas+stable+multiprotein+complexes+in+both+fission+and+budding+yeasts+containing+Myb-related+Cdc5p%2FCef1p%2C+novel+pre-mRNA+splicing+factors%2C+and+snRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Proteomics analysis revelas stable multiprotein complexes in both fission and budding yeasts containing Myb-related Cdc5p/Cef1p, novel pre-mRNA splicing factors, and snRNAs.</a> Molecular and Cellular Biology. 22 (7), 2011-2024 (2002).</li>
<li>Lourenco, R. F., Leme, A. F. P., Oliveira, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+yeast+mutant+RNA+exosome+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of yeast mutant RNA exosome complexes.</a> Journal of Proteome Research. 12 (12), 5912-5922 (2013).</li>
<li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterizatioin+and+proteome+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A generic protein purification method for protein complex characterizatioin and proteome exploration.</a> Nature Biotechnology. 17, 1030-1032 (1999).</li>
<li>Cheng, S. C., Newman, A., Lin, R. J., McFarland, G. D., Abelson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+fractionation+of+yeast+splicing+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation and fractionation of yeast splicing extract.</a> Methods in Enzymology. 181, 89-96 (1990).</li>
<li>Umen, J. G., Guthrie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+a+U5+snRNP+protein+in+3%27+splice+site+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">A novel role for a U5 snRNP protein in 3' splice site selection.</a> Genes & Development. 9, 855-868 (1995).</li>
<li>Dunn, E. A., Rader, S. D. Preparation of yeast whole cell splicing extract. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDunn%2C+EA+%22Spliceosomal+Pre-mRNA+Splicing%3A+Methods+and+Protocols.+Methods+in+Molecular+Biology%22">Spliceosomal Pre-mRNA Splicing: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology</a>. Hertel, K. J. 1126, 123-135 (2014).</li>
<li>Hill, H. D., Straka, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+determination+using+bicinchoninic+acid+in+the+presence+of+sulfhydryl+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Analalytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Protein determination using bicinchoninic acid in the presence of sulfhydryl reagents.</a> Analalytical Biochemistry. 170 (1), 203-208 (1988).</li>
<li>Cepeda, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+assembly+factor+Nop53+controls+association+of+the+RNA+exosome+with+pre-60S+particles+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The ribosome assembly factor Nop53 controls association of the RNA exosome with pre-60S particles in yeast.</a> The Journal of Biological Chemistry. 294 (50), 19365-19380 (2019).</li>
<li>Lin, R. J., Newman, A. J., Cheng, S. C., Abelson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+mRNA+splicing+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Yeast mRNA splicing in vitro.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260 (27), 14780-14792 (1985).</li>
</ol>

저자는 이해 상충이 없습니다.

단백질 단백질 및 리보핵산 단백질 상호 작용은 교차 연결제를 사용하여 안정화될 수 있다. 결과 복합체는 글리세롤 그라데이션에 대한 초원심분리를 견딜 수 있는 안정성이 있는 것이 중요합니다. 또한 버퍼 조건은 상호 작용을 허용해야하지만 비특정 바인딩을 피할 수 있을 만큼 엄격해야 합니다. 여기에 표시된 실험에서, 우리는 이미 시험관 내 접합 반응(15)에대해 확립 된 버퍼 솔루션을 사용했다.
원심분리의 속도와 시간은 분석되는 복합체에 최적화되어야 합니다. 우리는 다른 퇴적 조건, 원심 분리 샘플 94,000 x g및 194,000 x g에서 4 °C에서 16 시간 동안, 유사한 결과를 테스트했습니다. 이러한 컨트롤은 분석중인 복합체가 침전되지 않는 조건을 결정하는 데 중요합니다.
우리는 또한 다른 블롯 방법을 테스트, 멤브레인에 직접 파이펫, 슬롯 블롯 또는...

접합은 조정된 방식으로 다양한 요인의 바인딩 및 방출이 필요한 매우 역동적인 프로세스입니다. 이러한 접합 요인은 RNA 결합 단백질, ATPases, 헬리케이스, 단백질 키나아제 및 인산염, 유비퀴틴 리개세, 그 외1,2,3을포함한다. 그리고 분자 재배열이 일어날 수 있도록, 이러한 요인 중 일부는 매우 일시적인 이 RNP 중간 복합체의 격리 및 식별을 매우 어렵게 만듭니다.
여기서, 그라픽스 법4,5는 B액트 복합체 6과 효모 접합인자 Cwc24의 상호작용을 안정화하고, 유비퀴틴 리구아제 Prp19가 19(NTC)의 결합 또는 방출에 어떤 역할을 하는지 여부를 결정하기 위해B액트 복합체6을 사용하였다. 장소. 글리세롤 그라데이션을 따라 크로스링커의 농도가 증가하는 거시분자를 노출시키는 장점은 복합간 교차링크4,5,따라서 골재형성을 피한다는 것이다.
이 방법은 단백질 면역 침전 및 풀다운 분석에 대한 보완으로 사용되었으며, 이는 큰 복합체의 분리를 허용함에도 불구하고 큰 동적복합체7,8내에서 과도 상호 작용을 유지하는 데 신뢰할 수 없을 수 있다. 글리세롤 그라데이션에서 고정 시약을 사용하면 이러한 요인의 결합을 안정화시켜 접합 서브콤플렉스와 특정 단백질의 상호 작용을 확인할 수 있습니다. 선택된 크로스링커는 화학적으로 돌이킬 수 없기 때문에, 회수된 분획에 존재하는 단백질은 그라데이션 원심분리 후 점블롯에 의해 분석되었다.

<table><tbody><tr><td>Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope</td><td>Millipore</td><td>07-482</td><td></td></tr><tr><td>ECL anti-Rabbit IgG GE</td><td>Healthcare</td><td>NA934</td><td></td></tr><tr><td>EconoSystem</td><td>Bio-Rad</td><td>1-800-424-6723</td><td>EconoSystem의 일부 : 연동 펌프, UV 검출기 및 분획 수집기</td></tr><tr><td>EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>분획 회수 시스템</td><td>Beckman Coulter</td><td>270-331580</td> EconoSystem Gradient Master Model 107ip Biocomp <td></td></tr><tr><td></td><td>107-201M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>믹서 밀 MM 200</td><td>Retsch</td><td>207460001</td><td>Ball Mill 장치</td></tr><tr><td>Rotor F12-6x500Lex</td><td>Thermo Scientific</td><td>096-062375</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall RC 6 Plus Centrifuge</td><td>의 부품에 연결된 튜브 천공 장치Thermo Scientific</td><td>36-101-0816</td><td></td></tr><tr><td>스윙 버킷 로터 P40ST</td><td>Hitachi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기 CP 80 NX</td><td>Hitachi</td><td>901069</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Clear 원심분리기 튜브(14 x 89mm)</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr></tbody></table>

사카로미세스 세레비시아스 스플리케소터 서브콤플렉스의 과도성 행위자 검출을 위한 그라픽스의 활용

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

pre-mRNA 접합은 복잡한 성분의 조립, RNA 처리 및 방출 중에 화려한 하위 복합체의 많은 분자 재배열을 포함하는 매우 역동적인 과정입니다. 글리세롤 그라데이션 원심분리는 기능적 및 구조적 연구를 위해 단백질 또는 RNP(RiboNucleoProtein) 복합체의 분리를 위해 사용되어 왔다. 여기서는 단일 입자 저온 전자 현미경 검사법을 위한 거대 분자 복합체를 정화하고 안정화하기 위해 처음 개발된 Grafix(그라픽스(Gradient Fixation)의 활용을 설명하며, 이는 스플렉션 컴플렉스에 일시적으로 결합되는 접합 인자 간의 상호 작용을 식별합니다. 이 방법은 시료의 원심분리를 복합체안정화를 위한 고정 시약의 농도증가로 기초한다. 글리세롤 그라데이션에 적재된 효모 총 추출물의 원심분리 후, 회수된 분획은 점블롯에 의해 분석되어 개별 접합 인자의 존재의 현물 및 의결을 위해.

Cwc24-TAP의 퇴적 프로파일을 분석하고 Grafix 방법이 서브콤플렉스를 접합하는 데 결합을 안정화시키는 데 효과적인지 여부를 결정하기 위해, 우리는 글리세롤 그라데이션에 원심분리를 통해 Cwc24-TAP를 표현하는 세포의 총 효모 추출물을 분리하여 교차 연결제로 글루타랄데히드의 존재 또는 부재에 있다. 24μL 분획의 샘플은 TAP 태그의 CBP 부분에 대한 항체를 가진 슬롯 블롯에 의해 분석되었다. 결과는 크로스링커가 없는 경우 Cwc24가 분획 5와 13(도1B)사이에 집중되어 있으며, 약 80~200MDa14의복합체에 해당한다. 그러나, 크로스링커의 존재에서, 그라데이션에 Cwc24의 위치는 더 큰 복합체에 대응하는 그라데이션의 하단에 분수로 이동된다(도1). 이러한 결과는 글루타랄데히드가 접합 복합체와 Cwc24의 협회를 안정화한다는 것을 나타냅니다.
<p c...

여기서는 크로스링커가 있는 글리세롤 그라데이션 원심분리인 그라픽스(Gradient Fixation)의 활용을 설명하여 쌍향적인 복합체에 일시적으로 결합하는 접합 요인 간의 상호 작용을 식별합니다.

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...

가교제(cross-linker)가 있는 상태에서 글리세롤 구배 원심분리(glycerol gradient centrifugation)를 수행하는 그래디언트 고정법(gradient fixation method)은 다중 소단위체 복합체에 일시적으로 결합하는 단백질 간의 상호작용을 식별하는 데 도움이 됩니다. 글리세롤 구배에서 고정 시약을 사용하면 침전물이 형성되지 않고 느슨한 인자의 결합을 안정화하여 특정 단백질과 접합된 반복합체의 상호 작용을 식별할 수 있습니다. 엔드 프로토콜의 데모는 처음 사용하는 사용자가 서면 텍스트만으로는 이해하기 어려울 수 있는 정보를 학습하는 데 도움이 됩니다.효모 총 추출물 준비의 경우, 탭 태그에 융합된 접합 인자 중 하나를 발현하는 효모 세포와 적절한 아미노산 또는 핵염기가 보충된 1리터의 Y 및 B 포도당 배지를 성장시킵니다. 배양액이 600나노미터의 광학 밀도에 도달하면 500밀리리터 원심분리기 병 3개에 원심분리하여 효모 세포를 수집하고 세척당 10ml의 차가운 멸균수로 세포를 두 번 세척합니다. 두 번째 세척 후, 저온 완충액 A의 세포 부피의 1/10에 세포를 재현탁시키고 효모 세포 현탁액의 50마이크로리터 방울을 액체 질소에 동결합니다.동결 후, 볼 밀 장치에서 3 분 동안 20 헤르츠에서 6 사이클을 통해 냉동 세포 펠릿을 분쇄하고 각 사이클이 끝날 때 냉동 세포 용기를 액체 질소에 담그십시오. 마지막 사이클 후, 추출물이 들어있는 튜브를 실온의 물에 넣고 가끔 흔듭니다. 일단 녹으면 추출물을 수집하기 위해 원심 분리기를 사용합니다.그리고 BCA 법에 의해 상층액이 제거된 단백질을 정량화합니다. 그런 다음 섭씨 영하 80도 보관을 위해 액체 질소에서 추출물의 부분 표본을 급속 동결합니다. 글리세롤 구배를 준비하려면 30% 글리세롤 및 완충액 A 용액에 가교제 글루타르알데히드의 0.1% 최종 농도를 추가하고 혼합하여 균질화합니다.12ml 원심분리 튜브에 6ml의 차가운 10%글리세롤과 완충액 A 용액을 넣고 긴 바늘이 장착된 그래디언트 마스터 디바이스 주사기를 사용하여 튜브 바닥에 30%글리세롤 글루타르알데히드 용액을 겹겹이 쌓습니다. 그래디언트 마스터 장치를 사용하여 제조업체의 사양에 따라 선형 글리세롤 그래디언트를 생성합니다. 200마이크로리터의 7%글리세롤을 조심스럽게 겹겹이 쌓고 쿠션을 그래디언트 상단에 완충재로 만든 후 튜브 상단에 약 2mg의 세포 추출물을 추가합니다.글리세롤 그래디언트 생성 후, 시료를 사전 냉각된 스윙 버킷 로터에 넣고 원심분리를 통해 추출물을 수집합니다. 각 12 millilit 시료 튜브의 시료를 24,500 microliter fractions로 분취하고, 연동 펌프를 사용하여 40% 글리세롤 용액을 10-30% gradient를 통해 튜브에서 분획 분취까지 밀어 넣습니다. 그런 다음 각 분획 50마이크로리터를 점 블롯의 니트로셀룰로오스 멤브레인에 직접 로드한 다음 차단 버퍼를 추가하고 CBP에 대한 1차 항체를 사용하여 면역 블롯의 단백질을 검출하고 필요에 따라 적절한 2차 항체를 사용합니다.가교결합체가 없는 경우 CWC 24는 약 80 내지 200 메가달톤의 복합체에 해당하는 분획 5와 13 사이에 집중됩니다. 그러나 가교결합체(cross-linker)가 있는 경우, 구배에서 CWC 24의 위치는 더 큰 복합체에 해당하는 구배의 맨 아래에 있는 분수로 이동한다. CWC 24 침강을 U5 snRNP 소단위체 Prp8 및 NTC 소단위체와 비교하면 Prp19는 CWC 24가 동일한 분획에 집중되어 있음을 보여줍니다.그러나 스플라이소솜과 일시적으로 결합하기 때문에 더 가벼운 분획에도 존재합니다. 흥미롭게도 분수 11과 12는 Prp8과 19가 집중하기 시작하는 분수이며, 이는 B Act 복합체가 침전되기 시작하는 구배의 일부임을 시사합니다. 분획 11 및 12의 웨스턴 블롯 분석은 Prp8 및 19 신호가 8% 아크릴아마이드 겔에 거의 들어가지 않는 도말로 밝혀졌으며, 이는 실제로 대형 복합체의 일부임을 보여줍니다.CWC 24는 분획 12에도 존재하지만 훨씬 낮은 농도로 B Act 복합체에 대한 일시적인 결합과 일치합니다. 종합하면, 이러한 결과는 글루타르알데히드가 접합 하위 복합체에 대한 일시적인 인자의 결합을 안정화하기 위한 가교제로 사용될 수 있음을 보여줍니다. 이 방법은 스플라이소솜과 같은 일부 구성 요소와 일시적으로 연결되는 모든 동적 모터 서브 유닛 복합체의 연구에 적용할 수 있습니다.

utilization-grafix-for-detection-transient-interactors-saccharomyces

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 비디오에서는 표적 DNA와 상호 작용하는 여러 단백질을 검출하는 변형된 효모 단일 하이브리드 분석을 시연합니다. 형질전환된 효모 세포는 리포터 유전자의 상류에 있는 표적 DNA 염기서열을 포함합니다. 또한, 그들은 전사 인자 단백질을 발현합니다. 단백질이 복합체를 형성하고 표적 DNA에 결합할 때 리포터 유전자가 발현되고 효소로 검출될 수 있습니다.

이질체 단백질 복합체-DNA 상호작용을 검출하기 위한 Modified Yeast-One 하이브리드 분석

선택적 접합 조절은 다양한 생리학적 및 병리학적 과정에서 필수적인 세포 프로그램인 상피-중간엽 전이(EMT)에 기여하는 것으로 나타났습니다. 여기에서는 EMT 중 선택적 접합을 감지하기 위해 유도 가능한 EMT 모델을 사용하는 방법에 대해 설명합니다.

상피 - 간엽 전환시 선택적 스 플라이 싱 (alternative splicing)의 검출

여기에서 우리는 고형 종양 및 혈액 악성 종양에서 약물 내성에 비정상적인 스 플라이 싱의 영향을 조사하기위한 프로토콜을 설명합니다. 이 목표를 위해, 우리는 RNA-서열을 통해 부모와 체외에서 저항 모델의 transcriptomic 프로필을 분석 후보 유전자를 확인하기 위해 QRT-PCR 기반의 방법을 설립했다.

에 약물 저항 관련 소설 스플 라이스 변종을 감지하는 RNA 시퀀싱을 사용하여<em&gt; 체외</em&gt; 암 모델

우리는 여기서 중요한 생물학적 문제를 해결하기 위해 사례 연구와 같은 적외선 형광 염료 표지 DNA 프로브와 함께 정제 된 SOX-2 단백질을 사용하여 형광 전기 영동 이동성 이동 분석 (fEMSA)의 최적화 된 프로토콜을 설명합니다.

적외선 형광 염료로 표지 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 전기 영동 이동성 시프트 분석을위한 최적화 된 프로토콜

이 단일 분자 형광 교 잡 프로토콜 제자리에서 식물 성장 및 감수 분열 동안에 싹 트는 효 모 RNA 분자의 수를 계량 최적화 됩니다.

단일 분자 형광에서 제자리 교 잡 (smFISH) 신진 효 모 무성 한 성장 및 감수 분열 분석

이 프로토콜은 C. elegans 생식선에서 의한 체르메게에서 단백질-단백질 상호작용을 조사하기 위한 근접 결찰 분석법의 사용을 입증한다.

근접 결찰 분석술을 사용하여 C. 예쁜꼬마선에서 리보뉴클레오 단백질 복합어셈블리의 시투 검출

이 문서에서는 (a) 핵 추출물에서 U1 snRNP의 고갈에 대한 실험 절차에 대해 설명하며, 접합 활동의 수반되는 손실; (b) Galectin-3에 의한 U1 고갈 된 추출물에서 접합 활성의 재구성 - U1 snRNP 입자는 항 갈류 -3 항체와 함께 공동으로 구슬에 결합된다.

구슬에 갈렉틴-3 - U1 snRNP 복합체에 의한 접합 활동의 보완

우리는 살아있는 효모와 포유류 세포에서 포름알데히드가 교차하는 번역 (단백질 생합성) 복합체를 급속하게 안정화시키는 기술을 제시합니다. 접근은 과도 중간및 동적 RNA:단백질 상호 작용을 해부할 수 있습니다. 교차 연결된 복합체는 심층 시퀀싱 기반 프로파일링 방법, 현미경 검사법 및 질량 분석법과 같은 여러 다운스트림 응용 분야에서 사용할 수 있습니다.

진핵 세포에서 번역 단지의 신속한 생체 내 고정 및 격리

DetectSyn은 치료 또는 질병 상태에 걸친 상대적 시냅스 (시냅스 전 및 시냅스 후 참여) 수의 변화를 측정하는 편향되지 않은 신속한 형광 분석법입니다. 이 기술은 배양된 뉴런 및 고정 조직 모두에서 사용될 수 있는 근접 라이게이션 기술을 이용한다.

DetectSyn: Synapse 밀도의 변화를 감지하는 빠르고 편향되지 않은 형광 방법

구리 성장 분석인 ACT1-CUP1 분석은 전구체 메신저 RNA(pre-mRNA) 스플라이싱과 돌연변이 스플라이싱 인자가 스플라이세오솜 기능에 미치는 영향에 대한 빠른 판독을 제공합니다. 이 연구는 프로토콜을 제공하고 관심 있는 접합 문제를 해결하기 위해 가능한 사용자 정의를 강조합니다.

ACT1-CUP1 분석은 신진 효모에서 스플라이세오솜 돌연변이체의 기질 특이적 민감도를 결정합니다.

D-루프 포획(DLC) 및 D-루프 확장(DLE) 분석은 정량적 PCR과 함께 근접 결찰 원리를 활용하여 사카로마이세스 세레비시아에서 유도성 이중 가닥 절단 부위에서 D-루프 형성, D-루프 확장 및 생성물 형성을 정량화합니다.

사카로마이세스 세레비시아에서 근접 결찰 및 정량적 PCR을 통한 상동 재조합 중간체의 검출

학습하세요 글리세롤 그라디언트 원심분리와 가교제를 이용한 그라디언트 고정법으로 사카로미세스 세레비시아스의 스플라이소솜 과도성 상호작용을 분석하는 방법을. 이 기술은 느슨한 단백질 결합을 안정화하여 특정 스플라이싱 인자 상호작용을 식별합니다.

사카로미세스 세레비시아스 스플리케소터 서브콤플렉스의 과도성 행위자 검출을 위한 그라픽스의 활용

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