정자의 대체로 마우스 파르테노유전학 Haploid 배아 줄기 세포의 응용 프로그램

이 프로토콜은 반수체 마우스 배아 줄기 세포의 게놈 각인의 변형을 잘못된 정자로 간주하여 마우스에서 자체 재배 배아의 생성을 가능하게 합니다. 배우자의 유전자 변형은 일반적으로 어려운 기술을 필요로 합니다. 이 방법론을 사용하면 잡종 배아 줄기 세포에서 부모 배우자를 조작하여 정자 대체 옵션으로 마우스에 나중에 도입할 수 있습니다.

이 방법은 배아에서 부계 배우자의 인위적인 특정 변형을 가능하게 하기 때문에 특히 게놈 각인 및 소작 연구에 적용할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 쥐 발생학자인 Charles Etienne Dumeau입니다. 실험을 위한 홀딩 및 마이크로 주입 피펫을 준비하려면 먼저 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 길쭉한 모양과 점진적인 테이퍼로 붕규산 유리 모세관을 당깁니다.

홀딩 피펫을 준비하려면 외경이 60-100 마이크로미터인 당겨진 모세관을 필라멘트의 유리 구슬 위에 마이크로 단조에 배치합니다. 필라멘트를 켜고 비드에 닿을 때까지 모세관을 내립니다. 모세관이 비드에 부착되면 필라멘트의 스위치를 끄고 모세관을 후퇴시켜 모세관이 곧은 끝으로 끊어지도록 합니다.

다음으로, 부러진 모세관 팁을 필라멘트의 유리 구슬 옆에 수평으로 놓고 필라멘트를 가열하여 모세관 팁의 내경이 10-20마이크로미터가 될 때까지 끝을 녹입니다. 그런 다음 모세관을 팁에서 약 1mm 떨어진 유리 구슬 위에 놓고 필라멘트를 가열하여 모세관이 20도 각도로 구부러지도록 합니다. 마이크로 주입 피펫을 준비하려면 가열된 필라멘트의 유리 비드 위에 외경이 약 6마이크로미터인 당긴 모세관을 배치하고 비드에 닿을 때까지 모세관을 내립니다.

모세관이 부착되면 필라멘트의 스위치를 끄고 모세관을 집어넣습니다. 모세관은 곧은 끝으로 끊어집니다. 그런 다음 모세관 끝에서 약 1mm 떨어진 유리 구슬 위로 모세관을 이동하고 필라멘트를 가열하여 모세관이 20도 각도로 구부러질 수 있도록 합니다.

세포질 내 주사를 수행하려면 10cm 접시의 거꾸로 된 뚜껑에 PVP 용액 5 마이크로 리터 방울과 M2 배지 20 마이크로 리터 방울을 놓고 방울을 미네랄 오일로 덮습니다. 접시를 무대에 놓고 마이크로 매니퓰레이터에 고정 피펫을 설치합니다. 마이크로 로더 팁을 사용하여 마이크로 사출 피펫에 플루오로카본 오일을 채우고 피펫을 피에조 액추에이터에 장착합니다.

현미경을 통해 관찰하면서 microinjection 피펫을 PVP 용액 한 방울로 내립니다. 피펫이 잠기면 피펫을 위아래로 여러 번 사용하여 유리에 PVP를 코팅합니다. 소량의 PVP 용액을 미세주입 피펫에 로드합니다.

미세주입 및 홀딩 피펫을 M2 매체에 담그고 드롭 하단의 피펫에 초점을 맞춥니다. 약 2마이크로리터의 이중 녹아웃 parthogenic ES 세포 현탁액을 M2 배지 드롭으로 옮기고 구강 피펫을 사용하여 10개의 M2 난모세포를 동일한 드롭으로 옮깁니다. 하나의 난모세포를 회전시키고 홀딩 피펫을 통해 음압을 가하여 난모세포를 유지하여 perivitelline 공간이 microinjection 피펫을 향하도록 하고 metaphase two plate가 microinjection 피펫의 경로에 위치하지 않도록 주의합니다.

미세주입 피펫의 팁에 하나의 이중 녹아웃 parthogenic ES 세포를 추출하고 세포막의 파열을 확인합니다. microinjection 피펫에 가벼운 음압을 가하고 4개의 피에조 임펄스를 전달하면서 microinjection 피펫의 끝을 perivitelline 공간 쪽으로 밀어 투명대를 돌파합니다. 미세주입 피펫으로 난모세포를 관통하여 난소가 반대쪽으로 뻗어나가도록 하고 하나의 피에조 펄스를 적용하여 난소를 뚫고 난소가 미세주입 피펫의 샤프트를 따라 이완되도록 합니다.

최소한의 배지로 double knockout parthogenic ES cell을 난형에 주입하고 미세주입 피펫을 난모세포에서 부드럽게 빼냅니다. 주입된 난모세포를 홀딩 피펫에서 분리하고 나중에 채취할 수 있도록 마이크로 드롭의 측면으로 이동합니다. 모든 난모세포가 주입되면 난모세포를 KSOM 배지가 포함된 예열된 중앙 웰 접시로 옮기고 활성화하기 전에 섭씨 37도, 5% 이산화탄소에서 접시를 1시간 동안 배양합니다.

유세포 분석을 통해 CAG/EGFP 전이유전자를 운반하는 이 대표적인 이중 녹아웃 parthogenic ES 세포주의 DNA 함량 분석은 G0, G1, S 및 G2 M 단계에서 반수체 및 이배체 세포의 분포를 보여줍니다. 유전형 분석은 H19 및 유전자간 차등 메틸화 영역에서 야생형 대립유전자의 부재를 확인하기 위해 수행할 수 있습니다. CAG/EGFP 전이유전자를 이중 녹아웃 병원성 ES 세포에 도입하여 현미경으로 녹색 형광을 시각화하여 반복제 배아에 대한 기여도를 연구할 수 있습니다.

유세포 분석 분석은 demuculcene 처리 후 G2 M 상이 정지된 반수체 및 이배체 세포에 해당하는 두 개의 집단을 보여줍니다. 1N 반수체 피크가 없다는 것은 세포의 휴식 주기가 대체로 완료되었음을 나타냅니다. 주입 후, EGFP 발현은 구성된 반클론 배아에서 거의 검출되지 않습니다.

이중 녹아웃(double knockout)의 세포질(cytoplasm)이 분원성 ES 세포(parthogenic ES cell)로 난모세포(난모세포)의 큰 세포질(large cytoplasm)로 분산됨에 따라. 활성화 후 6시간 후에는 최대 3개의 극체를 현미경으로 관찰할 수 있습니다. 난모세포의 첫 번째와 두 번째 극성체와 반수체 ESC의 하나의 유사 극성체.

발달 능력을 입증하기 위해 반복제된 배아는 배반포 단계까지 배양될 수 있습니다. 또한, 만삭 암컷 마우스는 수혜자 암컷의 난관으로 이식된 반복제된 2개의 세포기 배아로부터 얻을 수 있습니다. 마이크로 주입 중에는 난모세포가 활성화될 때 염색체 분리를 방지하기 위해 반수체 배아 줄기 세포의 원형질막을 파열하는 것이 중요합니다.

단일유전학적 반수체 ES 세포 대신 안드로겐 반수체 ES 세포도 사용할 수 있습니다.연구 목적에 따라 모계 또는 부계 배우자를 정자 대체물로 선택할 수 있습니다.