Name: 정자의 대체로 마우스 파르테노유전학 Haploid 배아 줄기 세포의 응용 프로그램 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: 배우세요 마우스 단배체 배아줄기세포를 정자 대체로 활용하여 반복제 배아를 생성하는 방법을. 이 기술은 게놈 각인 연구와 생식생물학 연구에 혁신적인 도구를 제공합니다.

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우리는 phaESC 라인의 파생 에 대한 줄리오 디 미닌 박사와 유동 세포 측정 작업에 대한 박사 레모 프레이만 감사합니다. 우리는 또한 미켈 레 샤프너 씨와 토마스 M. 헤네크 씨가 배아 전이와 기술 지원을 인정합니다. 이 작품은 스위스 국립 과학 재단 (보조금 31003A_152814/1)에 의해 지원되었다.

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<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androgenetic+haploid+embryonic+stem+cells+produce+live+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Androgenetic haploid embryonic stem cells produce live transgenic mice.</a> Nature. 490 (7420), 407-411 (2012).</li>
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<li>Elling, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+maintenance+of+mouse+haploid+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Derivation and maintenance of mouse haploid embryonic stem cells.</a> Nature Protocols. 14 (7), 1991-2014 (2019).</li>
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<li>Shuai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+mammalian+offspring+by+haploid+embryonic+stem+cells+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation of mammalian offspring by haploid embryonic stem cells microinjection.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 31, 1-15 (2014).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), e3923(2012).</li>
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<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9-mediated+base-editing+screening+in+mice+identifies+DND1+amino+acids+that+are+critical+for+primordial+germ+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9-mediated base-editing screening in mice identifies DND1 amino acids that are critical for primordial germ cell development.</a> Nature Cell Biology. 20 (11), 1315-1325 (2018).</li>
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체세포 핵 전달(SCNT)에 의한 포유류 복제는1990년대,20,21년에개척되었다. 이러한 발전은 30년 전에 양서류22에서실시한 복제 연구를 따랐다. 상당한 지연은 포유류에서 배아학 및 게놈 각인의 어려움을 반영합니다. 포유류 SCNT의 발달은 이 프로토콜에 상세히 기술된 정액을 대체하기 위한 haESC의 적용을 위한 기초입니다.
세포 주기 동기화는 SCNT23의성공을 위한 중요한 요소입니다. 이것은 또한이 프로토콜에서 haESC의 주입에 대 한 경우. 기증자 게놈을 수령인으로 도입하려면 배아 발달을 중단하는 염색체 파손 또는 골수 계수를 피하기 위해 세포 주기 단계가 일치하도록 요구합니다. 반 클로닝은 두 개의 게놈과 세포 세포가 호환되어야 한다는 추가복잡성을 가지고 있습니다. 이전 보고서는 M-phase 체포 및 rorogenetic haESC의 주입이 난모세포7에G1 상 haESCs의 주입 보다는 반 복제된 태아의 더 나은 발달 비율을 산출했다는 것을 보여주었습니다. 이 보고서는 M-phase를 반 복제에 적합한 동기화 지점으로 제안합니다. 이에 따라, phaESC는 미토티컬디드 디메콜신과 메타단계에서 체포되어 MII 난우세포의 난소에 주입되었으며, 이는 메이오증의 메타페이오 II에서 자연적으로 체포되었다. 중요한 것은, M-위상 체포는 기증자와 수령인 세포 주기 사이 우수한 동기화를 제공하는 고효율마우스 ESC에서 달성될 수 있습니다.
미토시스 동안 핵막이 분해되고 복제된 염색체가 부착되는 스핀들 형태가 형성됩니다. M-phase DKO-phaESC를 주입한 후, 자매 크로마티드는 의사 극체와 zygote7(그림 3E)으로분리된다. 따라서 DKO-phaESC의 단일 염색체 세트는 반 복제 된 배아에 기여합니다. DKO-phaESC 염색체의 자매 크로마티드는 주사 후에 정확하게 분리될 수 있다는 것이 중요합니다. 손상되지 않은 DKO-phaESC의 플라즈마 멤브레인은 의사 극성 체체로의 분리를 방지합니다. 우리는 실제로 DKO-phaESC의 혈장 막이 파열되지 않은 드문 경우를 관찰했고, 배아는 주입 후 ooplasm에서 그대로 DKO-phaESC를 나타냈다(도 3D). 따라서, 파이프팅에 의해 DKO-phaESC의 플라즈마 멤브레인을 제거하기 위해주의를 기울여야한다. 주입 하는 동안, 염색체의 메이 오 틱 스핀들의 중단을 방지 하 고 염색체 분리 결함으로 이어질 수 있는 동등 하 게 중요 한 결과 뿐만 아니라 aneuploidy를 유도.
포유류에서, 게놈 각인은 정액 보충으로 phaESCs의 적용을 제한합니다. Parthenogenetic haESCs는 유전체 각인의 모계 구성을 소유, 정자는 아버지 구성을 소유 하는 반면. 따라서, 전체 기간 새끼의 생성은 정자 대체로 야생 형 phaESC의 주입 후 발생하지 않았습니다. 이러한 제한을 극복하기 위해 IG및 H19-DMC의삭제는 phaESC에서 설계됩니다. 모계 Igf2-H19 및 Gtl2-Dlk1 loci에서 각인된 발현의 변형은 전송된 2세포 배아에 기초하여 5.1% 이상의 주파수를 가진 반 복제된 마우스의 생성을 허용하기 위한 게놈 각인물의 구성을 바꾸기에 충분하다. 이러한 관찰은 2개의 각인된 유전자를 표적으로 하는 것이 마우스에 있는 정액을 대체할 수 있는 기능적인 아버지 구성으로 phaESCs의 게놈을 전환한다는 것을 건의합니다. 그럼에도 불구 하 고, phaESCs의 영구적인 유전 수정이 전략에 대 한 필요. 대체 전략으로, 및 유전 적 haESC를 고려할 수 있습니다. Androgenetic haESCs는 정자 게놈에서 파생되고 친자 각인을 가지고 있습니다. 야생형 및 유전적 haESC가 정자 대체품으로 기여하여 전이 배아4,7,24의1.3%와 1.9%의 주파수에서 전체 기간새끼를생성하는 데기여했다는보고가 있었습니다. 전체 기간 새끼는 또한 IG의삭제와 함께 및 rorogenetic haESC를 주입하여 얻어졌습니다 - 및 H19-DMRs의주파수에서 20.2% 전송된 2 세포 배아24. 각인이 배양에서 불안정해질 수 있기 때문에 변형된 안드로유전학 적 haESC를 사용하여 반 복제의 효율성이 증가할 가능성이 높습니다. 각인 결함은 중요한 DMR의 유전 적 삭제에 의해 수정됩니다.
난소 또는 정자 게놈에 직접 유전자 변형을 도입하는 어려움을 고려, haESCs는 별도로 부모 게놈을 조작하기위한 가치있는 도구입니다. 정자의 대체로 haESCs를 사용하는 것은 마우스 생식선에서 게놈 편집을위한 놀라운 이점을 제공합니다. 최근 연구는 CRISPR/Cas9 기반 게놈 편집을 배아 발달에 중요한 각각기 영역의 특성화를 위한 haESC의 적용과결합했다(12). 이 연구는 Bi임산부 마우스의 발달에서 H19-및IG-DMR과 병용으로 Rasgrf1-DMR의역할을 분석하고, 양성쥐의 발달에 있어 7가지 DMRs의 기능을 분석하였다. 정자에 대한 haESC를 대체하는 방법은 원시 세균 세포 발달에서 DND1 단백질 내의 주요 아미노산을 식별하고 뼈발달24,25,26에서유전자를 식별하기 위한 유전자 스크리닝 접근법의 기초를 형성하였다. 배아 발달의 주요 요인을 확인하기 위한 게놈 각인 및 유전 검열에 대한 연구는 게임 게놈으로 haESCs의 적용을 위한 상당한 접근입니다.

포유류에서, gametes는 차세대로 유전 정보를 전송하는 유일한 세포입니다. 오키트와 정자의 융합은 성인 동물로 발전하는 디플로이드 zygote를 형성합니다. 게임성 게놈의 돌연변이는 자식에 의해 상속되고 종1의유전적 변이를 유도한다. 생식선에 돌연변이의 도입은 유전자 기능 및 질병 모델링의 특성화를 포함하여 다양한 생물학적 연구를 위해 유전자 변형 동물을 생산하기 위해 적용되었습니다. 난모세포와 정자 는 모두 말기 분화 하 고 증식을 중단 한 고도로 전문화 된 세포. 따라서 게임테를 직접 수정하는 것은 기술적으로 어렵고 전문적인 접근 방식이 개발되었습니다. 유전자 변형은 유전자 변형 된 ESC를 발아 세포로 주입하여 마우스 세균에 도입 될 수 있으며, 여기서 개발 배아에 통합되어 생식선을 식민지화할 수 있습니다. 또한 CRISPR/Cas9 시스템을 포함한 게놈 편집 접근법을 이용한 zygotes의 유전자 변형이 널리 채택되고있다 2.
최근에는 게임게놈3,4,5,6,7,8을대체할 수 있는 haESC를 적용하는 뛰어난접근법이보고되었다. HaESCs는 파르테노유전학 또는 및 rorogenetic haploid blastocysts의 내부 세포 질량에서 파생된 줄기 세포주이며 염색체4,7,9,10의단일 세트를 소유한다. 파르테노유전학과 안드로유전학 적 haESCs 모두 난모세포로 내트라토플라스믹 주입 후 반 복제 된 마우스의 게놈에 기여할 수 있음을 입증되었습니다. 다른 접근법과는 달리, haESCs의 게놈은 자기 갱신 능력 때문에 배양에서 직접 수정될 수 있습니다. 정자를 haESCs로 대체하여 생식선에 유전자 변형을 도입하는 것은 생물학적 연구를위한 중요한 방법입니다. 그것은 개별적으로 문화를 제공하고 각각 parthenogenetic 또는 androgenetic haESCs에서 파생되는 모계 또는 친자 게놈을 조작할 가능성을 제공합니다. HaESCs는 그 때 유전체 각인, 진상성 표현 및 부모 특정 프로세스의 연구 결과에 특히 유리한 게임 게놈 대체로 이용될 수 있습니다.
마우스에서는 정상적인 배아발달(11)에모계 및 친자 게놈 정보가 모두 요구된다. 따라서, 전체 기간 새끼는 야생형 파르테노유전학 적 haESC(phaESC)가 정자 게놈5,8을대체하기 위해 주입되었을 때 얻을 수 없었다. 발달 블록을 극복하기 위해, 파르테노유전학 적 haESCs의 모계 게놈의 게놈 각인은 아버지 구성으로 교정될 필요가 있다. 이는 차별화된 메틸화된 영역(DM)을 조작하여 달성할 수 있다. 현재까지 H19-DMR, Gtl2-Dlk1 IG-DMR및 Rasgrf1-DMR의표적 삭제는 phaESC3,5,8,12에서모성 발현 유전자를 억압하기 위해 연구되었다. 이러한 연구는 H19-DMR과 IG-DMR모두의 삭제가 정자 염색체를 대체할 수 있는 친자 각인 구성으로 모계를 변환하기에 충분하다는 것을 보여주었습니다. 두 DMR 삭제를 난피세포로 운반하는 phaESC의 내트라피토프라진 주사는 전송된 2세포 배아의 5.1%와 15.5% 사이의 주파수를 가진 반 복제 새끼를 산출하였다.
이 프로토콜은 H19-DMR과 IG-DMR모두의 삭제와 phaESC의 응용 프로그램을 기반으로하며, 이는 이중 녹아웃 phaESC (DKO-phaESC)를 용어. 우리는 DKO-phaESC 라인을 확립하기 위해 phaESC에서 게놈 각인의 수정에 대한 자세한 지침을 제공합니다, 정자 게놈의 대용으로 난동구에 DKO-phaESC의 주입, 배반 복제 배아의 배양에 대한, 및 반 복제 된 마우스를 얻기위한. 이 프로토콜은 친자 게놈의 정확하고 직접적인 조작을 필요로 하는 연구원을 위한 참고및 반 복제된 태아 및 마우스의 생성입니다.

<table><tbody><tr><td>1.5 mLTube</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td>haESC 배양</td></tr><tr><td>15 ml 튜브</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>haESC 배양</td></tr><tr><td>12웰 플레이트</td><td>Thermo Scientific</td><td>150628</td><td>haESC 배양</td></tr><tr><td>24웰 플레이트</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td>haESC 배양</td></tr><tr><td>6웰 플레이트</td><td>Thermo Scientific</td><td>140675</td><td>haESC 배양</td></tr><tr><td>96웰 플레이트</td>, <td>Thermo Scientific</td><td>167008</td><td>haESC 배양</td></tr><tr><td>&베타;-메르캅토에탄올</td>, <td>Merck</td><td>M6250</td>, <td>haESC 배양</td></tr><tr><td>BSA 분획</td>, <td>Gibco</td><td>15260-037</td>, <td>haESC 배양</td></tr><tr><td>CHIR 99021</td>, <td>Axon</td><td>1386</td>, <td>haESC 배양</td></tr><tr><td>Demecolcine 용액</td>, <td>Merck</td><td>D1925</td>, <td>haESC 배양</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>41965-039</td><td>haESC 배양</td></tr><tr><td>DMEM / F-12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td>haESC 배양</td></tr><tr><td>DR4 마우스</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>3208</td><td>haESC 배양</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Merck</td><td>E5134</td><td>haESC 배양</td></tr><tr><td>FBS</td><td>biowest</td><td>S1810-500</td><td>haESC 배양</td></tr><tr><td>냉동 매체</td><td>amsbio</td><td>11897</td><td>haESC 배양</td></tr><tr><td>젤라틴</td><td>Merck</td><td>G1890</td><td>haESC 배양</td></tr><tr><td>Hepes 용액</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td>haESC 배양</td></tr><tr>조사<td>MEF</td><td>Gibco</td><td>A34966</td><td>haESC 배양</td></tr><tr><td>LIF(백혈병 억제 인자)(</td><td>수제)</td><td>-</td><td>haESC 배양</td></tr><tr><td>Lipofection 시약</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>haESC 배양</td></tr><tr><td>NDiff 227</td><td>Takara</td><td>Y40002</td><td>haESC 배양</td></tr><tr><td>PD 0325901</td><td>Axon</td><td>1408</td><td>haESC 배양</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>haESC 배양</td></tr><tr><td>piggyBac plasmid carrying a CAG-EGFP transgene</td><td>Addgene</td>#<td>40973</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>piggyBac transposase plasmid</td><td>System Biosciences</td><td>PB210PA-1</td><td>haESC 배양</td></tr><tr><td>pX330 플라스미드</td><td>Addgene</td><td>#42230</td><td>haESC 배양</td></tr><tr><td>pX458 플라스미드</td><td>Addgene</td><td>#48138</td><td>haESC 배양</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td>haESC 배양</td></tr><tr><td>DNA 중합효소</td><td>Thermo Scientific</td><td>F549S</td><td>유전형 분석</td></tr><tr><td>dNTP Mix</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0192</td><td>유전형 분석</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Merck</td><td>100983</td><td>염</td></tr><tr><td>산</td><td>Merck</td><td>100317</td>형 <td>분석</td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>Merck</td><td>109634</td><td>유전형</td></tr><tr><td>분석 단백질 분해 효소 K</td><td>Axon</td><td>A3830</td><td>유전형 분석</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Merck</td><td>71729</td><td>염화</td></tr><tr><td>나트륨</td><td>Merck</td><td>106404</td><td>유전형 분석</td></tr><tr><td>ThermoMixer</td><td>Epeendorf</td><td>5384000012</td><td>유전형 분석</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Merck</td><td>T1503</td><td>유전형 분석</td></tr><tr><td>5 mL 튜브</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td>유세포 분석</td></tr><tr><td>5 mL 튜브 세포 여과기 캡</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td>유세포 분석</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>유세포 분석</td></tr><tr><td>MoFlo Astrios EQ</td><td>Beckman Coulter</td><td>B25982</td><td>유세포 분석</td></tr><tr><td>1mL 주사기</td><td>Codan</td><td>62.1640</td><td>과배란</td></tr><tr><td>30게이지 1/2인치 바늘</td><td>Merck</td><td>Z192362-100EA</td><td>과배란</td></tr><tr><td>B6D2F1 마우스</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>100006</td><td>과배란</td></tr><tr><td>hCG</td><td>MSD 동물 건강</td><td>49451</td><td>과배란</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010015</td><td>과배란</td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Avivasysbio</td><td>OPPA1037 5000 IU</td><td>과배란</td></tr><tr><td>10cm 접시</td><td>Thermo Scientific</td><td>150350</td><td>배아 조작</td></tr><tr><td>4웰 플레이트</td><td>Thermo Scientific</td><td>179830</td><td>배아 조작</td></tr><tr><td>50 mL 튜브</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td>배아 조작</td></tr><tr><td>6cm 접시</td><td>Thermo Scientific</td><td>150288</td><td>배아 조작</td></tr><tr><td>센터 웰 디쉬</td><td>Corning</td><td>3260</td><td>배아 조작</td></tr><tr><td>디지털 로커</td><td>Thermo Scientific</td><td>88880020</td><td>배아 조작</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>AppliChem</td><td>A0878</td><td>배아 조작</td></tr><tr><td>히알루로니다제</td><td>Merck</td><td>H4272</td><td>배아 조작</td></tr><tr><td>KSOM</td><td>Merck</td><td>MR-020P-5F</td><td>배아 조작</td></tr><tr><td>M16 매체</td><td>Merck</td><td>M7292</td><td>배아 조작</td></tr><tr><td>M2 매체</td><td>Merck</td><td>M7167</td><td>배아 조작</td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>Merck</td><td>M8410</td><td>배아 조작</td></tr><tr><td>유리 모세관</td><td>Merck</td><td>P1049-1PAK</td><td>배아 조작</td></tr><tr><td>실체 현미경</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>배아 조작</td></tr><tr><td>염화 스트론튬</td><td>Merck</td><td>13909</td><td>배아 조작</td></tr><tr><td>5ml 주사기</td><td>Codan</td><td>62.5607</td><td>미세주입</td></tr><tr><td>붕규산 유리 캡슐</td><td>과학 제품</td><td>GB100T-8P</td><td>미세주입</td></tr><tr><td>CellTram 4r 오일</td><td>Eppendorf</td><td>5196000030</td><td>미세주입</td></tr><tr><td>Fluorinert FC-770</td><td>Merck</td><td>F3556</td><td>미세주입</td></tr><tr><td>홀딩 피펫</td><td>BioMedical</td><td></td> <td>Instruments-Microinjection</td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-U</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Microinjection 피펫</td><td>BioMedical</td> <td>Instruments-Microinjection</td><td></td></tr> <tr><td>Microlaoder tips</td><td>Eppendorf</td><td>5252 956.003</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Micromanipulaor arms</td><td>Narishige</td><td>NT-88-V3</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>PiezoXpert</td><td>Eppendorf</td><td>5194000016</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>PVP (Polyvinylpyrrolidine)</td><td>Merck</td><td>PVP360</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Syringe filter</td><td>SARSTEDT</td><td>83.1826.001</td><td>미세주입</td></tr></tbody></table>

정자의 대체로 마우스 파르테노유전학 haploid 배아 줄기 세포의 응용 프로그램

Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

성적 번식을 가진 유기체에서, 생식 세포는 새로운 개별으로 발전하는 강성 성 세포의 근원입니다. 마우스에서는 정자에 의한 난미세포의 수정은 완도성 zygote를 만듭니다. 최근, 몇몇 간행물은 haploid 배아 줄기 세포 (haESCs)가 게임 게놈을 대체하고 마우스로 발전하는 태아에 기여할 수 있다는 것을 보고했습니다. 여기서, 우리는 난모세포로 내트라토플라스믹 주입에 의해 배아를 구성하는 정액의 대용품으로 parthenogenetic haESCs를 적용하는 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 정자 대체로 haESCs를 준비하고, 하ESC 염색체를 난모세포로 주입하고, 반 복제 된 배아의 문화를위한 단계로 구성됩니다. 배아는 배아 전달 후에 비옥한 반 복제 마우스를 산출할 수 있습니다. 정자 교체로 haESC를 사용하면 생식선에서 게놈 편집, 배아 발달 연구 및 게놈 각인에 대한 조사가 용이합니다.

이 프로토콜의 목적은 반 복제 배아와 마우스를 얻기 위해 정자의 대체로 haESCs를 적용하는 것입니다. 이를 위해, CAG-EGFP 트랜스진을 운반하는 DKO-phaESC 라인이 생성되어 MII 난모세포로 의 내트라토플라스믹 주입에 사용되었다. 친자 각인 구성으로 적합한 phaESC 라인을 얻기 위해 Cas9 뉴클레아제를 사용하여 유전 공학을 수행했습니다. haploid ESC 라인은 디플로이드 에대한 고유의 경향으로 인해 발생하는 haploid 및 디플로이드 세포를 함유하고있다 10. haploid 염색체 세트는 정액 게놈의 성공적인 교체를 위한 전제 조건입니다. 혈류 세포측정에 의한 DNA 함량 분석은 G0/G1-, S-및 G2/M-phases(그림2A)에서haploid 및 디플로이드 세포의 분포를 나타낸다.
DKO-phaESC 라인을 확립하기 위해 야생형 phaESC 라인은 안정적인 형질 전환 EGFP 발현을 위해 돼지박 트랜스포슨 구조와 H19및 IG-DMR의 삭제를 얻기 위한 CRISPR/Cas9 플라스미드로 전염되었습니다. DIPLOID ESC를 제외하고 EGFP를 표현하는 haploid ESC만 격리하기 위해 특정 정렬 게이트가 정의되었습니다(그림2A). 단일 haploid EGFP 양성 세포는 그 때 서브 클론을 얻기 위하여 96 웰 플레이트의 개별 우물로 도금되었다. MEF 피더는 트랜스페드 phaESC의 도금 효율 및 생존을 증가시키기 위해 사용되었다. 배양의 확장 후, PCR에 의해 초기 지노티핑 라운드가 수행되어 두 DMR의 삭제를 수행하는 하위 클론을 식별했습니다. MEF 피더가 배양에서 제거된 후, H19에서야생형 송계의 부재를 확인하기 위해 두 번째 유전자를 수행하였다- 및 IG-DMR(도2B). 총 135개의 서브 클론에서, 우리는 삭제된 송계를 운반하고 H19-DMR과IG-DMR 둘 다의 야생형 송계유전자가 없는 5haploid DKO-phESC 라인을 획득했습니다.
CAG-EGFP 트랜스진은현미경(그림 3A)에따라 녹색 형광의 시각화에 의한 반 복제 배아에 대한 기여를 연구하기 위해 DKO-phaESC에 도입되었다. 인트라토플라스혈 주사를 위해 DKO-phaESCs는 M-단계에서 그들을 체포하기 위해 데메콜신으로 치료되었습니다. 따라서, DKO-phaESC의 세포 주기는 MII 난모세포의 세포와 동기화되었다. 유동 세포측정 분석은 디메콜신(도3B)으로치료한 후 G2/M 상 체포 된 haploid (2n) 및 디플로이드 세포 (4n)에 해당하는 2명의 인구를 나타냈다. 1n haploid 피크의 부재는 세포 주기 체포가 크게 완료되었다는 것을 표시했습니다. M-위상 haploid ESC는 그 때 분류되고 난모세포로 주입되었습니다. 이를 위해, 단일 DKO-phaESC는 마이크로주입 파이펫에 적재되어 MII oocyte(그림3C)의세포질에 주입되었다. DKO-phaESC의 플라즈마 멤브레인은 미세 주입 파이펫의 끝으로 피펫을 주입하여 파열되었다.
주사 후, EGFP 발현은 DKO-phaESCs의 세포질이 난낭의 큰 세포질에 분산되었기 때문에 생성된 반 복제 배아에서 거의 검출되지않았다(도 3D). 드문 경우, 강렬한 EGFP 발현의 둥근 반점이 옴플라스내에서 관찰될 수 있다. 이 관찰은 손상되지 않은 DKO-phaESC의 부주의한 주입에 의해 발생했을 가능성이 있습니다. DKO-phaESC 세포막을 파열하지 않는 것은 추가 배아 발달과 호환되지 않을 가능성이 있으며 피해야한다. 주사 후 1시간 후, 배아는 염화염산염18로 치료에 의해 활성화되었다. 활성화개시 후 6시간 후,현미경(도 3E)하에서최대 3개의 극성 체체가 관찰되었다. 이러한 극지 체는 DKO-phaESC7으로부터난마세포 및 의사 극체의 제1 및 제2 극성 체에 해당한다. 또한, 2개의 프로핵은 정자와 정상 수정 후 zygotes의 프로핵 단계를 닮은 차동 간섭 대조 현미경의 밑에 관찰되었다.
발달 능력을 입증하기 위해 반 복제 된 배아는 배아 단계(그림 5A)로배양되었습니다. 더욱이, 전기 마우스는 반복제된 2세포 단계 배아를 받는 여성의 oviducts(도5B)로이송한 후 수득하였다. 예상대로, 반 복제 된 배아에서 파생 된 마우스는 난모세포나 난모세포 유래 phaESC가 Y 염색체를 운반하지 않는 여성이었다. 반 복제 된 마우스는 매우 정상이었고 야생 형 스위스 웹스터 남성과 짝을 이면 건강한 자손을 생산했습니다. 지금까지, 반 복제 된 마우스는 명백한 건강 문제없이 600 일 이상 살아있다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig01v3.jpg"> 그림 1: 정자 대체로 DKO-phaESC의 적용에 대한 개요. (A)프로토콜의 절차의 시간 프레임. (B)이 계획은 DKO-phaESC 선(1~6단계)을 설정하는 단계를 보여줍니다. (C)이 계획은 MiI oocyte(단계 7-14)로 DKO-phaESC의 내트라피토프라증 주입에 의해 반 복제 배아를 구성하는 단계를 보여줍니다. 약어: DKO = 더블 녹아웃; phaESC = 부분 유전 적 haploid 배아 줄기 세포; FACS = 형광 활성화 셀 분류; MEF = 마우스 배아 섬유아세포. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig02v2.jpg"> 그림 2: CrispR/Cas9 매개 삭제 - 및 IG-DMRs에 의해 DKO-phaESC 라인의 설립. (A)안정적인 EGFP 발현을 위한 피기박 플라스미드와 4개의 CRISPR/Cas9 플라스미드를 통해 피기박 플라스미드로 트랜스포메이션한 후 phaESC의 유동 세포측정 분석. 비트랜스감염 된 phaESC는 대조군으로 표시됩니다. DNA 프로파일(상단)은 haploid 및 diploid 세포의 세포 주기 분포를 나타낸다. EGFP를 발현하는 G1/S상 haploid 세포는 녹색 게이트(아래쪽, 오른쪽)에 의해 표시됩니다. (B)MEFs(제1 기형)에서 재배된 phaESC 서브 클론의 지노티핑과 MEFs(제2 기형)의 제거 후. 서브 복제 된 phaESC 라인 1, 2, 3 및 4는 야생 형 세포, H19-DMR 삭제, IG-DMR 삭제 및 결합 된 H19- 및 IG-DMR삭제를 각각 나타냅니다. DKO-phaESC 라인 5-8H19-DMR및 IG-DMR삭제를 모두 소유 하 고 야생 형 알 것에서 무료입니다. 약어: DKO = 더블 녹아웃; phaESC = 부분 유전 적 haploid 배아 줄기 세포; DMR = 차별화된 메틸화 영역; MEF = 마우스 배아 섬유아세포; EGFP = 향상된 녹색 형광 단백질; WT = 야생형. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig03v3.jpg"> 그림 3: Mitotically 체포 된 DKO-phaESC를 MII 난미세포로 주입합니다. (a) H19-및 IG-DMR의 CAG-EGFP 유전자 및 삭제를 전달하는 DKO-phaESC 배양의 형태; 스케일 바 = 50 μm.(B)디메콜신 처리 없이 데메콜신으로 체포된 후 DKO-phaESC의 대표적인 유동 세포 분석이 대조군으로 나타났다. (C)미세 주입 파이펫에서 DKO-phaESC의 형태. 파이펫팅에 의해 플라즈마 멤브레인을 파열하기 전(왼쪽) 및 후(오른쪽) 단일 손상형 DKO-phaESC가 도시되어 있다. 스케일 바 = 20 μm.(D)MII 난모세포에 DKO-phaESC를 주입 한 후 1 h에서 배아를 구성. EGFP 형광 및 밝은 필드의 병합 된 이미지가 표시됩니다. 검은 색 화살촉은 피할 수 있어야 하는 손상되지 않은 DKO-phaESC를 주입한 후 강렬한 EGFP 발현의 둥근 반점을 나타냅니다. 스케일 바 = 50 μm.(E)스트론튬 염화물로 활성화가 개시된 후 6h 반 복제 배아의 차동 간섭 대비 이미지가 나타났다. 백색 화살촉은 주입된 DKO-phaESC에서 1개의 의사 극성 바디를 포함하여 3개의 극성 바디를 가진 배아를 표시합니다; 스케일 바 = 50 μm. 약어: DKO = 더블 녹아웃; phaESC = 부분 유전 적 haploid 배아 줄기 세포; EGFP = 향상된 녹색 형광 단백질. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig04.jpg"> 그림 4: DKO-phaESCs를 난마세포로 주입하기 위한 설치 방식. (A)사출 피펫, 홀딩 파이펫 및 사출 챔버내 의 난미가 나타난다. α, 미세 주입 파이펫의 각도를 구부립니다. (B)내트라토플라스솜 주사를 위한 미세 조작 접시에 방울의 레이아웃. 약어: DKO = 더블 녹아웃; phaESC = 부분 유전 적 haploid 배아 줄기 세포. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig05.jpg"> 그림 5: 반 복제 된 배아의 개발. (A)시험관내 반 복제 배아의 사전 이식 개발. EGFP 발현은 처음에 4세포 배아에서 관찰된다 2 일째 에 트라이토플라스믹 주사 후. 4일째에, 강렬한 EGFP 발현은 배반구체에서 관찰될 수 있다; 스케일 바 = 100 μm.(b)2세포 배아 전달 후 얻어진 반 복제 마우스가 받는 사람에게 전달된다. 74 dpp에서, 반 복제 마우스 (화살표 머리)는 야생 형 스위스 웹스터 남성과 짝짓기 후 자연 출생에 의해 그녀의 첫 번째 새끼 (별표)를 전달했다. 이 그림에 나타난 반 복제 배아 및 반 복제 된 마우스는 Aizawa 외3에서보고된 것과 동일합니다. 약어: EGFP = 향상된 녹색 형광 단백질; .dpp, 일 산후. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="4">젤라틴 솔루션</td>
		</tr><tr><td>구성 요소</td>
			<td>재고 농도</td>
			<td>볼륨/무게</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr><tr><td>물</td>
			<td>-</td>
			<td>500 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>젤라틴</td>
			<td>-</td>
			<td>1 g</td>
			<td>0.2%</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Haploid 배아 줄기 세포 (HaESC) 배지</td>
		</tr><tr><td>구성 요소</td>
			<td>재고 농도</td>
			<td>볼륨/무게</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr><tr><td>NDiff 227</td>
			<td>-</td>
			<td>10mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>CHIR 99021</td>
			<td>10mM</td>
			<td>3 μL</td>
			<td>3 μM</td>
		</tr><tr><td>PD 0325901</td>
			<td>10mM</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>1 μM</td>
		</tr><tr><td>LIF</td>
			<td>1 x 106 IU/mL</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>1,000 IU/mL</td>
		</tr><tr><td>페니실린-연쇄절제술</td>
			<td>100x</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>1x</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">HaESC 유지 보수 버퍼</td>
		</tr><tr><td>구성 요소</td>
			<td>재고 농도</td>
			<td>볼륨/무게</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr><tr><td>HaESC 매체</td>
			<td>-</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>HEPES 솔루션</td>
			<td>1 M</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>20mM</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">세척 버퍼</td>
		</tr><tr><td>구성 요소</td>
			<td>재고 농도</td>
			<td>볼륨/무게</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr><tr><td>DMEM / F-12</td>
			<td>-</td>
			<td>100 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>BSA 분획</td>
			<td>7.5%</td>
			<td>7.1 mL</td>
			<td>0.5%</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">MEF 배지</td>
		</tr><tr><td>구성 요소</td>
			<td>재고 농도</td>
			<td>볼륨/무게</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr><tr><td>DMEM</td>
			<td>-</td>
			<td>500 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>FBS</td>
			<td>-</td>
			<td>56 mL</td>
			<td>10%</td>
		</tr><tr><td>β-메르카포에탄올</td>
			<td>14.3 몰/L</td>
			<td>3.9 μL</td>
			<td>100 μM</td>
		</tr><tr><td>페니실린-연쇄절제술</td>
			<td>100x</td>
			<td>5.6 mL</td>
			<td>1x</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">리시스 버퍼</td>
		</tr><tr><td>구성 요소</td>
			<td>재고 농도</td>
			<td>볼륨/무게</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr><tr><td>물</td>
			<td>-</td>
			<td>8.25 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>트리스-HCl (pH 8.5)</td>
			<td>1 M</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>100mM</td>
		</tr><tr><td>EDTA</td>
			<td>0.5M</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr><tr><td>SDS 솔루션</td>
			<td>10%</td>
			<td>200 μL</td>
			<td>0.2%</td>
		</tr><tr><td>나Cl</td>
			<td>5M</td>
			<td>400 μL</td>
			<td>200 mM</td>
		</tr><tr><td>프로틴아제 K</td>
			<td>20 mg/mL</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>100 μg/mL</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">활성화 매체</td>
		</tr><tr><td>구성 요소</td>
			<td>재고 농도</td>
			<td>볼륨/무게</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr><tr><td>KSOM</td>
			<td>-</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>염화 스트론튬</td>
			<td>1 M</td>
			<td>5 μL</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr><tr><td>EGTA</td>
			<td>0.5M, pH 8.0</td>
			<td>4 μL</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">PVP 솔루션</td>
		</tr><tr><td>구성 요소</td>
			<td>재고 농도</td>
			<td>볼륨/무게</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr><tr><td>M2 매체</td>
			<td>-</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>PVP</td>
			<td>-</td>
			<td>0.6 g</td>
			<td>12%</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">PMSG 솔루션</td>
		</tr><tr><td>구성 요소</td>
			<td>재고 농도</td>
			<td>볼륨/무게</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr><tr><td>PBS</td>
			<td>-</td>
			<td>450 μL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>PMSG</td>
			<td>500 IU/mL</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>50 IU/mL</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">hCG 솔루션</td>
		</tr><tr><td>구성 요소</td>
			<td>재고 농도</td>
			<td>볼륨/무게</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr><tr><td>PBS</td>
			<td>-</td>
			<td>450 μL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>hCG</td>
			<td>500 IU/mL</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>50 IU/mL</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">히알루로니다제 배지</td>
		</tr><tr><td>구성 요소</td>
			<td>재고 농도</td>
			<td>볼륨/무게</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr><tr><td>M2 매체</td>
			<td>-</td>
			<td>380 μL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>히알루로니다제</td>
			<td>10 mg/mL</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>0.5 mg/mL</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">약어: LIF = 백혈병 억제 인자; MEF = 마우스 배아 섬유아세포;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">FBS = 태아 소 혈청; DMEM = 덜벡코의 수정된 독수리 매체; BSA = 소 세럼 알부민;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">EDTA = 에틸렌디아민테트라아세산; SDS = 도데킬술페이트 나트륨; EGTA = 에틸렌 비스 (옥시에틸렌니틸로)테트라아세트산;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">PBS = 인산염 완충식식염; PVP = 폴리 비닐피롤리돈; hCG = 인간 융기 생식선 호르몬;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">PMSG = 임신 한 마레 혈청 생식샘 호르몬.</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 중간, 버퍼 및 솔루션 레시피입니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>이름</td>
			<td colspan="2">시퀀스(5' ~ 3')</td>
			<td>신청</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-P1</td>
			<td colspan="2">GTG GTT AGT TCT ATA TGG GG</td>
			<td>지노티핑</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-P2</td>
			<td colspan="2">AGA TGG GGT CAT TCT TTT CC</td>
			<td>지노티핑</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-P3</td>
			<td colspan="2">TCT TAC AGT CTG GTC TTG GT</td>
			<td>지노티핑</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-P1</td>
			<td colspan="2">TGT GCA GCA GCA AAG CTA AG</td>
			<td>지노티핑</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-P2</td>
			<td colspan="2">CCA CAA AAA CCT CCC TTT CA</td>
			<td>지노티핑</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-P3</td>
			<td colspan="2">ATA CGA TAC GGC AAC CAA CG</td>
			<td>지노티핑</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA1-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCA TGA ACT CAG AAG AGA CTG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA1-R</td>
			<td colspan="2">AAA CCA GTC TCT TCT 개그 TTC ATG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA2-F</td>
			<td colspan="2">CAC CAG GTG 아가 ACC ACT GCT 개그</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA2-R</td>
			<td colspan="2">AAA CCT CAG CAG TGG TTC TCA CCT</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA1-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCG TAC AGA GCT CCA TGG CAC</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA1-R</td>
			<td colspan="2">AAA CGT GCC ATG 개그 CTC TGT ACG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA2-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCT GCT 태그 AGG TAC TAC GCT</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA2-R</td>
			<td colspan="2">AAA CAG CGT AGT ACC TCT AAG CAG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 올리고뉴클레오티드 목록.

이 문서는 반 복제 배아의 건설을 위한 정액을 대신하기 위하여 parthenogenetic haploid 배아 줄기 세포의 사용을 입증하는 것을 작정입니다.

정자의 대체로 마우스 파르테노유전학 Haploid 배아 줄기 세포의 응용 프로그램

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...

이 프로토콜은 반수체 마우스 배아 줄기 세포의 게놈 각인의 변형을 잘못된 정자로 간주하여 마우스에서 자체 재배 배아의 생성을 가능하게 합니다. 배우자의 유전자 변형은 일반적으로 어려운 기술을 필요로 합니다. 이 방법론을 사용하면 잡종 배아 줄기 세포에서 부모 배우자를 조작하여 정자 대체 옵션으로 마우스에 나중에 도입할 수 있습니다.이 방법은 배아에서 부계 배우자의 인위적인 특정 변형을 가능하게 하기 때문에 특히 게놈 각인 및 소작 연구에 적용할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 쥐 발생학자인 Charles Etienne Dumeau입니다. 실험을 위한 홀딩 및 마이크로 주입 피펫을 준비하려면 먼저 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 길쭉한 모양과 점진적인 테이퍼로 붕규산 유리 모세관을 당깁니다.홀딩 피펫을 준비하려면 외경이 60-100 마이크로미터인 당겨진 모세관을 필라멘트의 유리 구슬 위에 마이크로 단조에 배치합니다. 필라멘트를 켜고 비드에 닿을 때까지 모세관을 내립니다. 모세관이 비드에 부착되면 필라멘트의 스위치를 끄고 모세관을 후퇴시켜 모세관이 곧은 끝으로 끊어지도록 합니다.다음으로, 부러진 모세관 팁을 필라멘트의 유리 구슬 옆에 수평으로 놓고 필라멘트를 가열하여 모세관 팁의 내경이 10-20마이크로미터가 될 때까지 끝을 녹입니다. 그런 다음 모세관을 팁에서 약 1mm 떨어진 유리 구슬 위에 놓고 필라멘트를 가열하여 모세관이 20도 각도로 구부러지도록 합니다. 마이크로 주입 피펫을 준비하려면 가열된 필라멘트의 유리 비드 위에 외경이 약 6마이크로미터인 당긴 모세관을 배치하고 비드에 닿을 때까지 모세관을 내립니다.모세관이 부착되면 필라멘트의 스위치를 끄고 모세관을 집어넣습니다. 모세관은 곧은 끝으로 끊어집니다. 그런 다음 모세관 끝에서 약 1mm 떨어진 유리 구슬 위로 모세관을 이동하고 필라멘트를 가열하여 모세관이 20도 각도로 구부러질 수 있도록 합니다.세포질 내 주사를 수행하려면 10cm 접시의 거꾸로 된 뚜껑에 PVP 용액 5 마이크로 리터 방울과 M2 배지 20 마이크로 리터 방울을 놓고 방울을 미네랄 오일로 덮습니다. 접시를 무대에 놓고 마이크로 매니퓰레이터에 고정 피펫을 설치합니다. 마이크로 로더 팁을 사용하여 마이크로 사출 피펫에 플루오로카본 오일을 채우고 피펫을 피에조 액추에이터에 장착합니다.현미경을 통해 관찰하면서 microinjection 피펫을 PVP 용액 한 방울로 내립니다. 피펫이 잠기면 피펫을 위아래로 여러 번 사용하여 유리에 PVP를 코팅합니다. 소량의 PVP 용액을 미세주입 피펫에 로드합니다.미세주입 및 홀딩 피펫을 M2 매체에 담그고 드롭 하단의 피펫에 초점을 맞춥니다. 약 2마이크로리터의 이중 녹아웃 parthogenic ES 세포 현탁액을 M2 배지 드롭으로 옮기고 구강 피펫을 사용하여 10개의 M2 난모세포를 동일한 드롭으로 옮깁니다. 하나의 난모세포를 회전시키고 홀딩 피펫을 통해 음압을 가하여 난모세포를 유지하여 perivitelline 공간이 microinjection 피펫을 향하도록 하고 metaphase two plate가 microinjection 피펫의 경로에 위치하지 않도록 주의합니다.미세주입 피펫의 팁에 하나의 이중 녹아웃 parthogenic ES 세포를 추출하고 세포막의 파열을 확인합니다. microinjection 피펫에 가벼운 음압을 가하고 4개의 피에조 임펄스를 전달하면서 microinjection 피펫의 끝을 perivitelline 공간 쪽으로 밀어 투명대를 돌파합니다. 미세주입 피펫으로 난모세포를 관통하여 난소가 반대쪽으로 뻗어나가도록 하고 하나의 피에조 펄스를 적용하여 난소를 뚫고 난소가 미세주입 피펫의 샤프트를 따라 이완되도록 합니다.최소한의 배지로 double knockout parthogenic ES cell을 난형에 주입하고 미세주입 피펫을 난모세포에서 부드럽게 빼냅니다. 주입된 난모세포를 홀딩 피펫에서 분리하고 나중에 채취할 수 있도록 마이크로 드롭의 측면으로 이동합니다. 모든 난모세포가 주입되면 난모세포를 KSOM 배지가 포함된 예열된 중앙 웰 접시로 옮기고 활성화하기 전에 섭씨 37도, 5% 이산화탄소에서 접시를 1시간 동안 배양합니다.유세포 분석을 통해 CAG/EGFP 전이유전자를 운반하는 이 대표적인 이중 녹아웃 parthogenic ES 세포주의 DNA 함량 분석은 G0, G1, S 및 G2 M 단계에서 반수체 및 이배체 세포의 분포를 보여줍니다. 유전형 분석은 H19 및 유전자간 차등 메틸화 영역에서 야생형 대립유전자의 부재를 확인하기 위해 수행할 수 있습니다. CAG/EGFP 전이유전자를 이중 녹아웃 병원성 ES 세포에 도입하여 현미경으로 녹색 형광을 시각화하여 반복제 배아에 대한 기여도를 연구할 수 있습니다.유세포 분석 분석은 demuculcene 처리 후 G2 M 상이 정지된 반수체 및 이배체 세포에 해당하는 두 개의 집단을 보여줍니다. 1N 반수체 피크가 없다는 것은 세포의 휴식 주기가 대체로 완료되었음을 나타냅니다. 주입 후, EGFP 발현은 구성된 반클론 배아에서 거의 검출되지 않습니다.이중 녹아웃(double knockout)의 세포질(cytoplasm)이 분원성 ES 세포(parthogenic ES cell)로 난모세포(난모세포)의 큰 세포질(large cytoplasm)로 분산됨에 따라. 활성화 후 6시간 후에는 최대 3개의 극체를 현미경으로 관찰할 수 있습니다. 난모세포의 첫 번째와 두 번째 극성체와 반수체 ESC의 하나의 유사 극성체.발달 능력을 입증하기 위해 반복제된 배아는 배반포 단계까지 배양될 수 있습니다. 또한, 만삭 암컷 마우스는 수혜자 암컷의 난관으로 이식된 반복제된 2개의 세포기 배아로부터 얻을 수 있습니다. 마이크로 주입 중에는 난모세포가 활성화될 때 염색체 분리를 방지하기 위해 반수체 배아 줄기 세포의 원형질막을 파열하는 것이 중요합니다.단일유전학적 반수체 ES 세포 대신 안드로겐 반수체 ES 세포도 사용할 수 있습니다.연구 목적에 따라 모계 또는 부계 배우자를 정자 대체물로 선택할 수 있습니다.

application-mouse-parthenogenetic-haploid-embryonic-stem-cells-as

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

초기 개발 단계 동안 원시 종자 세포로 차별화하는 배아 새싹 세포의 능력은 암, 불임에 관한 우리의 가설을 해결하기 위해 완벽한 모델​​입니다. 이 프로토콜은 10.5-11.5 일 게시 coitum 마우스 배아의 개발 생식선에서 원시 종자 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다.

절연 및 마우스 배아 새싹 세포의 유도

배아 세포 이식과 testis 조직 xenografting을위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 배아 세포 이식받는 testes의 기증자 파생 spermatogenesis의 결과와 spermatogonial 줄기 세포 (SSCs)의 식별을위한 기능성 reconstitution 분석을 나타냅니다. xenografting Testis 조직이받는 생쥐에서 다양한 공여 종의 testis 개발과 spermatogenesis를 재현한.

배아 세포 이식 및 Testis 조직 마우스에 Xenografting

여기 마우스 정자 cryopreservation을 위해 새로 개발된 I • Cryo 키트를 보여줍니다. 냉동 - 해동 정자와 두 개의 세포 단계의 배아 개발이 키트의 사용 5 마우스 종자에 지속적으로 개선되었다. 1.5 년 동안, 49 유전자 변형 마우스 라인 전 • Cryo 키트와 정자 cryopreservation에 의해 보관했다 나중에 성공적으로 IVF로 회복되었습니다.

전 · Cryo 키트를 사용하여 마우스 정자 Cryopreservation 및 복구

그들은 pluripotency에 대한 표준 테스트를 통과 때도 생성 유도 만능 줄기 세포 (iPSC) 라인이 발달 가능성을 서로 다른 행을 생산하고 있습니다. 여기 가진 전체 pluripotency로 iPSC 라인을 정의 iPSCs에서 완전히 파생 쥐를 생산하기 위해 프로토콜을...

유도 만능의 줄기 세포에서 파생 마우스의 생성

이 문서는 효율적으로 파생 하 고 만능 마우스 배아 줄기 세포 라인 blastocyst 단계에서 문화 프로토콜을 설명 합니다.

마우스 Preimplantation 배아에서 줄기 세포 라인의

여기 우리는 새로운 장비를 사용 하지 않고 키메라 생산을 증가 하는 프로토콜을 제시. 주입에 대 한 배아의 단순한 방향 변경 생산, 배아의 수를 증가 하 고 잠재적으로 생식 전송 타임을 줄일 수 있습니다.

트랜스-내부 세포 배아 줄기 세포의 대량 주입 리드 더 높은 Chimerism 요금

여기에서, 우리는 1 세포 배아의 동결 보존을 위한 수정된 방법 뿐만 아니라 유전자 변형 마우스의 효율적인 생성을 위한 동결 해동 된 배아 및 전기 천공의 사용을 결합하는 프로토콜을 제시한다.

유전자 변형 마우스의 고효율 생산을 위한 동결 해동 배아 사용

여기에서는 배아 줄기 세포를 사용하여 유전자 변형 마우스 모델, 특히 대형 DNA 녹인 (KI)을 개발하기위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 CRISPR/Cas9 게놈 편집을 사용하여 조정되어 기존의 상동 재조합 매개 선형화된 DNA 표적화 방법에 비해 KI 효율이 크게 향상되었습니다.

유전자 조작 마우스 모델 개발을 위한 배아 줄기 세포에서 CRISPR/Cas9 매개 고효율 유전자 표적화

제시된 자궁 경부 조작 방법은 정관 수술을받은 수컷과 암컷을 번식시킬 필요없이 생쥐에서 가임신을 유도 할 수 있습니다. 비수술적 배아 이식과 비수술적 인공수정의 성공을 위해서는 가임신유도가 필요하며, 이 두 가지 모두 제시되어 있다.

비수술적 배아 이식 또는 인공 수정 전에 정관 수술을 받은 수컷 없이 암컷 마우스에서 가임신을 유도하는 행위

여기에서는 마우스에서 ROSI(round spermatid injection)를 수행하는 방법, 유망한 임상 응용 기술을 가진 기술이며 배아 발달의 기전을 조사하기 위한 유용성을 소개합니다.

마우스 라운드 Spermatid 주입

이 논문은 단일 세포 및 핵의 염기서열 분석을 위한 gastrulating mouse embryos의 고품질 single-cell 및 nuclei suspensions를 위한 파이프라인을 설정합니다.

돌연변이 전체 마우스 배아의 단일 세포 RNA 염기서열 분석: epiblast에서 gastrulation 말기까지

배우세요 마우스 단배체 배아줄기세포를 정자 대체로 활용하여 반복제 배아를 생성하는 방법을. 이 기술은 게놈 각인 연구와 생식생물학 연구에 혁신적인 도구를 제공합니다.

정자의 대체로 마우스 파르테노유전학 Haploid 배아 줄기 세포의 응용 프로그램

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