Name: 뇌혈관화의 초기 이벤트를 모방하는 미세 유체 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: 배우세요 뇌혈관화 초기 이벤트를 모방하는 3D 미세 유체 모델을 이용한 혈관생물학 연구 방법입니다. 이 플랫폼은 전단응력과 VEGF 농도를 정밀 제어하여 약물 스크리닝에 활용됩니다.

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이 작품은 중국 보조금 지원의 국립 자연 과학 연구 재단에 의해 지원되었다 (보조금 Nos. 11827803, 31971244, 31570947, 11772036, 61533016, U20A20390 및 32071311), 중국의 국가 주요 연구 개발 프로그램 (2016YFC101110101 및 2016YFC102202), 111 프로젝트 (B130039), 111 프로젝트 (B130039), 111 프로젝트 (B130039)

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오랜 시간 동안, 신생아의 실시간 관찰은 문제가되었습니다. 최근22, 32,40,46,54의발아을 위해 EC와 인접한 중전성 선박을 만들기 위해 여러 가지 접근법이 개발되었지만 기계적 미세 환경은 여전히 지속적으로 유지되기 어렵다. 높은 발광 전단 응력과 경도 유동의 낮은 속도를 받는 EC의 초기 생체 역학 적 미세 환경을 모방하는 것은 어려운 대상입니다. 여기에서, 우리는 먼저 생리적 미세 환경을 모방한 신생혈관화의 초기 사건을 시뮬레이션하는 MIEN 모델을 제시했습니다. MIEN 모델을 사용하면 자동적이고 효율적이며 거품이 없는 장기 관류가 달성됩니다. IC에 광막 전단 응력은 생리적 수준에 머무르는 경내 흐름실험 중에 언제든지 선택적으...

신생 혈관 화는성인,혈관 신생 및 동맥 발생5에서두 가지 주요 과정을 포함하는 많은 정상 및 병리학 적 과정1,2,3,4에서발생합니다. 혈관 내피 성장 인자(VEGF)6,기계적 자극, 특히 혈류 유도 전단 응력과 같은 가장 잘 알려진 성장 인자 외에, 신생혈관화7의 조절에 중요하다. 우리가 알다시피, 전단 응력의 크기와 형태는 혈관 세포의 다른 부분에서 극적으로 그리고 동적으로 변화하여 혈관 세포8,9,10,11,12에중요한 영향을 미칩니다. 이전 연구는 전단 스트레스가 세포 표현성 변화, 신호 변환, 유전자 발현 및 벽화 세포와의통신(13,14,16, 17,17,18,19,20)을포함한 EC의 다양한 측면에 영향을 미칠 수 있음을 보여주었다. 따라서, 신생 혈관화를 조절21,22,23,24.
따라서, 신생 혈관화를 더 잘 이해하기 위해, 시험관 내의자연 세포 미세 환경에서 공정을 재구성하는 것이 중요하다. 최근에는 마이크로선박을 만들고 미세한 조형 및 미세유체 기술의 발전을 활용하여마이크로환경 25,26,27을정밀하게 제어하기 위해 많은 모델이 설립되었습니다. 이들 모델에서, 마이크로용기는하이드로겔(28,29),폴리디메틸실록산(PDMS) 미세유체칩30,31, 32또는3D 바이오프린팅33,34에의해 생성될 수 있다. 발광 전단 응력(22,23,35,36,경전 유동37,38,39,40,혈관신생 인자41,42,균주/스트레치43,44, 45)및 다른 유형의세포32,46k와공동 배양등의 미세 환경의 일부 측면이 대조되었다. 일반적으로 대형 저수지 또는 주사기 펌프를 사용하여 퍼퓨즈 배지를 제공하였다. 이들 모델의 환원유량은 저수지와마이크로튜브(22,23,38,40)사이의 압력 강하에 의해 만들어졌다. 그러나 기계적 미세 환경은 이러한 방식으로 지속적으로 유지하기 어려웠습니다. 전단 응력이 높은 높은 유속이 관류에 사용되는 경우 Transendothelial 흐름이 증가하고 생리 수준을 초과할 것입니다. 이전 연구는 신생아 혈관화의 초기 기간에, 경피성 흐름의 속도는 일반적으로 0.05 μm/ s8이하의 그대로 있는 IC 및 지하 막 때문에 아주 낮다는 것을 보여주었습니다. 한편, 혈관 계통의 발광 전단 응력은 크게 다르지만 평균 값인 5-20 dyn/cm2,11,47로비교적 높다. 현재, 전작의 경피흐름의 속도는 일반적으로 0.5-15 μm/s22,38,39,40사이로 유지되었으며, 발광 전단 응력은 보통 10dyn/cm222미만이었다. 높은 발광 전단 스트레스와 생리학적 수준의 경내 흐름을 동시에 지속적으로 노출시키기가 어려운 대상으로 남아 있습니다. 
본 연구에서는, 우리는 신생 혈관화 (MIEN)의 초기 사건을 모방하는 시험관 내 3D 모델을 설명합니다. 우리는 관류 마이크로 튜브를 형성하고48발아과정을 시뮬레이션하기 위해 미세 유체 칩과 자동 제어, 고효율 순환 시스템을 개발했습니다. MIEN 모델을 사용하면 신생 혈관화의 초기 기간에 자극된 EC의 미세 환경이 먼저 다시 회수됩니다. EC는 높은 발광 전단 스트레스, 생리학적 수준의 경위 흐름 및 다양한 VEGF 분포에 의해 동시에 자극될 수 있다. 우리는 MIEN 모델을 구체적으로 설정하는 단계와 다른 연구자에게 참조를 제공하기를 희망하여 주의를 기울여야 할 핵심 사항을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Genview</td><td>GP3108</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 I, 쥐 꼬리</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>전자기 핀치 밸브</td><td>Wokun Technology</td><td>WK02-308-1/3</td><td></td></tr><tr><td>내피 세포 매체(ECM)</td><td>Sciencell</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>Every Green</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Corning</td><td>354008</td><td></td></tr><tr><td>FITC-dextran</td><td>Miragen</td><td>60842-46-8</td><td></td></tr><tr><td>그래픽 프로그래밍 환경</td><td>Lab VIEW</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>이미지 편집 소프트웨어</td><td>PhotoShop</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>이미지 처리 프로그램</td><td>ImageJ</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>91237</td><td></td></tr><tr><td>리소그래피 장비</td><td>광학 전자 연구소, 중국 과학원</td><td>URE-2000/35</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>82762</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 연동 펌프</td><td>리드 유체</td><td>BT101L</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 주사기 펌프</td><td>리드 유체</td><td>TYD01</td><td></td></tr><tr><td>산소 플라즈마</td><td>MING HENG</td><td>PDC-MG</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10x)</td><td>Beyotime</td><td>ST448</td><td></td></tr><tr><td>영구 에폭시 네거티브 포토레지스트</td><td>Microchem</td><td>SU-8 2075</td><td></td></tr><tr><td>페놀 레드 나트륨 염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5530</td><td></td></tr><tr><td>폴리디메틸실록산(PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine hydrobromide (PDL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7886</td><td></td></tr><tr><td>폴리테트라플루오로에틸렌</td><td>테프론</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>프로그램 소프트웨어</td><td>MATLAB</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 VEGF-165</td><td>StemImmune LLC</td><td>HVG-VF5</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨(NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.06498</td><td></td></tr><tr><td>스테이지 상단 인큐베이터</td><td>Tokai Hit</td><td></td><td></td>NA</tr><tr><td>SU-8 개발자</td><td>Microchem</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)실란</td><td>시그마-알드리치</td><td>448931</td><td></td></tr><tr><td>TRITC 팔로이딘</td><td>시그마-알드리치</td><td>P5285</td><td></td></tr></tbody></table>

뇌혈관화의 초기 이벤트를 모방하는 미세 유체 모델

Microfluidic Model to Mimic Initial Event of Neovascularization

신생 혈관화는 일반적으로 초기 단계에서 내피 세포 (EC)의 기존 정상 혈관 및 생체 역학 미세 환경에서 초기화되어 신생아 혈관화의 다음 과정으로부터 크게 다릅니다. 신생 혈관화의 다른 단계를 시뮬레이션하는 모델이 많이 있지만, 정상적인 혈관 미세 환경의 해당 자극하에서 신생 혈관화의 초기 과정을 항복하는 시험관 내 3D 모델은 여전히 부족합니다. 여기서 는 신생 혈관화(MIEN)의 초기 이벤트를 모방한 체외 3D 모델을 재구성했습니다. MIEN 모델에는 미세 유체 발아 칩과 자동 제어, 고효율 순환 시스템이 포함되어 있습니다. 내피로 코팅된 기능적이고 난설성이 있는 마이크로채널이 형성되었고, 발아 공정은 미세유체 발아 칩에서 시뮬레이션되었다. 초기 생리학적 미세환경은 미세유체 조절 시스템으로 회수되었으며, 이 시스템은 높은 발광 전단 스트레스, 생리학적 경전혈, 다양한 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 분포에 동시에 노출될 것이다. MIEN 모델은 신생아 혈관화 메커니즘의 연구에 쉽게 적용 될 수 있으며 약물 선별 및 독성 응용 프로그램을위한 저렴한 플랫폼으로 잠재적 인 약속을 보유합니다.

여기에 제시된 신생혈관화(MIEN)의 초기 이벤트를 모방하는 시험관 내 3D 모델은 미세유체 발아 칩과 미세유체 제어 시스템으로 구성되었다. 미세유체 발아 칩은 이전 간행물22,23,37,40,51,52, 53에서최적화되었다. 간략하게, 그것은 3 개의 채널및 6 개의 포트를 포함: 내피 세포 배양 채널 과 4 개의 미디어 주입 포트와 액체 채널, 그리고 두 개의 하이드로겔 주입 포트와 중앙 하이드로겔 채널(그림 3). 미세유체 제어 시스템은 마이크...

여기서, 우리는 미세 유체 칩과 자동으로 제어되는 고효율 순환 미세 유체 시스템을 제공하여 신생 혈관화의 초기 미세 환경을 재구성하여 내피 세포 (EC)가 높은 발광 전단 응력, 생리학적 수준의 경내 연골 흐름 및 다양한 혈관 내막 성장 인자 (VEGF)에 의해 자극 될 수 있도록 합니다.

Neovascularization is usually initialized from an existing normal vasculature and the biomechanical microenvironment of endothelial cells (ECs) in the ...

신생 혈관, 새로운 혈관의 생성은 정상 및 병리학 적 사건 모두에서 매우 규제 되는 과정입니다. 신생 혈관화를 더 잘 이해하려면 체외에서 자연 세포 미세 환경에서 프로세스를 재구성하는 것이 중요합니다. 우리는 미세 유체 칩과 자동 제어를 개발했습니다.고효율 순환은 관류 마이크로 튜브를 형성하고 새로운 혈관화의 초기 이벤트에 재현하기 위해 단백질을 사용하는 시뮬레이션하기 위해 수행됩니다. 미세 유체 발아 칩은 세 개의 채널로 구성되었다. 내피 세포 배양 채널과 액체 채널은 넓은 중앙 하이드로겔 채널에 의해 분리되었다.미세 유체 제어 시스템은 미세 사기 펌프 및 전자기 핀치 밸브로 구성되었다. 버블 트랩 칩, 미세 유체 발아 칩, 마이크로 연동 펌프 및 배양 매체 저수지. 미세 유체 시스템으로, 내피 세포는 높은 발광 전단 스트레스, 생리학적 수준의 경내 피류 및 다양한 혈관 내피 성장 인자 분포에 의해 동시에 자극될 수 있다.파이펫 20 마이크로리터 의 125 섬유넥틴의 밀리리터 당 마이크로 그램 세포 배양 채널의 하나의 미디어 주입 포트로. 파이펫 팁을 잘라 세포 배양 채널의 포트에 가위를 넣습니다. 파이펫 팁을 세포 배양 채널의 다른 배지 주입 포트에 삽입합니다.그런 다음, 세포 배양 채널에서 공기를 피펫하여 섬유네틴으로 채웁니다. 칩을 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 세포 파종 전에, 각 배지 주입 포트에 내피 세포 배지의 파이펫 20 마이크로 리터와 30 분 동안 섭씨 37도에서 칩을 배양.그런 다음 모든 미디어 주입 포트의 모든 미디어를 피펫합니다. 다음으로, 세포 배양 채널의 하나의 배지 주입 포트로 세포 현탁액의 파이펫 5 마이크로리터. 그런 다음 내피 세포는 차동 유수압하에서 전체 채널에 빠르게 확산됩니다.다른 포트에 ECM 매체의 약 4~6마이크로리터를 추가하여 정압 압력을 조정하고 세포 이동을 중지합니다. 칩을 인큐베이터셀로 리모컨합니다. 그런 다음 내피 세포가 세포 배양 채널의 내부 표면 주위에 코팅 될 때까지 30 분마다 칩을 뒤집습니다.파이펫 팁을 사용하여 사출 포트에 부착된 셀을 매우 신중하게 제거합니다. 그런 다음 4개의 가시 암컷 Luer 어댑터를 미디어 사출 포트에 삽입하고 ECM 매체로 채웁니다. 칩을 분리하여 인큐베이터에 적용하고, 12시간마다 ECM 미디어와 루어 어댑터를 변경합니다.미세 유체 제어 시스템을 조립하려면 폴리테트라플루오로틸렌 튜브 2개, 짧은 실리콘 튜브

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

microvascular 크기의 채널 (&lt;30 μm의)와 microfluidic 장치의 전체 내부 3D 표면에 걸쳐 문화 내피 세포 단일층를하는 방법이 설명되어 있습니다.

Hematologic 질환의 Microvascular 상호 작용 유학을위한 Endothelialized Microfluidics

신생아 쥐 망막에서 혈관 신생을 조절 다른 유전자 또는 약물의 역할의 조사를 허용하는 혈관의 잘 특성화 생리 학적 모델을...

혈관을 조사하기 위해 신생아 마우스 망막의 전체 마운트 면역 형광 염색<em&gt; 생체 내</em

마이크로 - 온 - 칩 플랫폼은 포토 리소그래피 리플 로우 레지스트 기술, 소프트 리소그래피, 그리고 미세 유체의 조합에 의해 개발되었다. endothelialized 마이크로 플랫폼은 생체 내 미세 혈관에서의 3 차원 (3D) 구조를 모방 제어 지속적인 혈류의 흐름에서 실행하고, 고품질의 실시간 영상을 허용하고 미세 혈관 연구에 적용 할 수 있습니다.

멀티 깊이 원형 단면 Endothelialized 마이크로 채널 - 온 - 칩의 개발을위한 절차

이 프로토콜은 생쥐에서 개발로 각막 micropocket 분석에 대해 설명합니다.

각막 Micropocket 분석 : 마우스 눈에있는 혈관의 모델

1차 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)는 미세유체 네트워크 장치 내에서 합류하도록 성장했습니다. 내피 세포 접합부와 F-액틴 분포를 설명하고 아데노신 삼인산(ATP)에 대한 반응으로 세포 내 칼슘 농도 및 산화질소 생성의 변화를 개별 세포 수준에서 실시간으로 정량화했습니다.

개발 및 특성화의<em&gt; 체외</em&gt; 미세 혈관 네트워크 및 내피의 정량적 측정 [칼슘<sup&gt; 2 +</sup&gt;]<sub&gt; 전</sub&gt; 및 질소 산화물 생산

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혈관 유래 미세 유체 네트워크의 이미지 유도, 레이저 기반의 제조

프로토콜에는 회전 타원 체에 perfusable 혈관 네트워크를 설계 하는 방법을 설명 합니다. 회전 타원 체의 주변 microenvironment 신생 유도 microchannels 미세 장치에는 회전 타원 체 연결을 고안 이다. 메서드를 사용 하면 3 차원 문화에 오랫동안 기다려온 기술 회전 타원 체의 관류를 수 있습니다.

미세 소자에서 조직 모델 perfusable 혈관 네트워크

이 방법은 표준화된 미세 유체 플랫폼에서 40개의 교류 3D 마이크로혈관으로서 iPSC 유래 내피 세포의 배양을 기술한다. 이 플랫폼은 확장 가능하고 처리량이 높은 방식으로 혈관 신생 콩나물의 해부학 및 안정화를 포함하여 3D로 그라데이션 구동 혈관 신생 발아를 연구 할 수 있습니다.

iPSC 유래 내피 세포의 퍼퓨비드 3D 혈관신생 발아연구를 위한 표준화 및 확장 성 분석

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배우세요 뇌혈관화 초기 이벤트를 모방하는 3D 미세 유체 모델을 이용한 혈관생물학 연구 방법입니다. 이 플랫폼은 전단응력과 VEGF 농도를 정밀 제어하여 약물 스크리닝에 활용됩니다.

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