Name: 작은 크기의 텔레오스 모델 일본어 메다카(오리지아스 latipes)에서고나데토미및 혈액 샘플링 절차 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: 배우세요 일본어 메다카(Oryzias latipes)에서 고나데토미 및 혈액 샘플링 절차를 통해 성호르몬의 생리학적 역할을 연구하는 방법을. 이 기술은 생존률 100%를 달성하며 척추동물 신경내분비 가소성 연구에 활용됩니다.

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저자는 생선 축산에 그녀의 도움을 주셔서 미스 루르드 카레온 G 탄에게 감사드립니다. 이 사업은 일본과학진흥회(JSPS)의 NMBU,보조금 지원(교부번호 18H04881 및 18K19323)에 의해 지원되었으며, 스미토모 재단에서 SK에 기초과학 연구 프로젝트를 지원했습니다.

모든 실험과 동물 취급은 노르웨이 생명 과학 대학의 실험 동물 복지에 대한 권고에 따라 수행되었습니다. 고나데토미를 사용한 실험은 노르웨이 식품 안전 당국(FOTS ID 24305)에 의해 승인되었습니다.
참고: 실험은 성인 남성과 여성(생후 6~7개월, 체중 0.35g, 길이 2.7cm)을 사용하여 수행하였다. 상기 성은42,47에기재된 바와 같이 등쪽 및 항문 지느러미의 크기 및 모양과 같은 이차성 특성을 구별함으로써 결정되었다.
1. 기기 및 솔루션 준비
<ol><li>마취 주식 솔루션 (0.6 % 트리카인)을 준비합니다.<ol>
<li>10x 인산염 완충식살린(PBS)의 100mL에서 트리카인(MS-222)을 0.6g 희석한다.</li>
		<li>트리카인 스톡 용액 1mL을 여러 1.5mL 플라스틱 튜브에 분배하고 사용할 때까지 -20°C에 보관하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>수족관 용수 2L에 NaCl 18g을 추가하여 회수수(0.9% NaCl 솔루션)를 준비합니다. 사용 전까지 실온에 용액을 보관하십시오.</li>
	<li>날카로운 점을 얻기 위해 대각선으로 면도기를 파괴하여 절개 도구를 준비(도 1A).</li>
	<li>혈액 항응고제 용액(0.05 U/μL 의 나트륨 헤파린)을 1x PBS의 500 μL로 나트륨 헤파린 25 μL을 희석하여 준비합니다. 사용 전까지 항응고제 용액을 4°C에 저장합니다.</li>
	<li>제조업체의 지시에 따라 바늘풀러(도 1B)로유리 모세관을 당겨 90mm 길이의 유리 모세관에서 2개의 유리 바늘을 준비한다. 참고: 유리 바늘의 외경은 1mm이고 내부 직경은 0.6 mm입니다.</li>
	<li>뚜껑을 절단하여 1.5mL 플라스틱 튜브 뚜껑을 준비하고 바늘 외부직경(도 1C)에맞는 구멍을 만듭니다. 구멍을 만들기 위해 9mm 유리 모세관의 한쪽 끝을 가열하고 뚜껑을 통해 가열 된 유리 모세관을 찌르십시오. 또는 바늘을 사용하여 구멍의 직경이 9mm 유리 모세관에 맞을 때까지 뚜껑을 찌르게하십시오.</li>
</ol>2. 고나데토미 시술
<ol><li>수족관 수의 30mL에 트리카인 재고(0.6%)의 튜브 1개(0.6%)를 희석하여 마취용액의 0.02%를 준비한다.</li>
	<li>1.3 단계에서 설명된 초미세 및 2개의 미세한 집게(비교적 넓은 팁이 있는 분수), 작은 가위, 나일론 실 및 면도기 등 해부 도구를 준비합니다.</li>
	<li>물고기를 30-60초 동안 0.02% 마취용액에 넣어 생선을 마취합니다. 참고: 마취 의 지속 시간은 물고기의 크기와 무게에 따라 달라 지며 적응해야합니다. 물고기가 완전히 마취되도록 하기 위해 물고기 몸은 집게를 사용하여 부드럽게 꼬집을 수 있습니다. 물고기가 반응하지 않으면 고나데스토미를 시작할 수 있습니다.</li>
	<li>마취 용액에서 물고기를 꺼내 어처 현미경으로 물 밖으로 물고기를 측면에 수평으로 놓습니다.</li>
	<li>암컷의 오바리절제술(OVX)<ol>
<li>난수성 계란(암컷 몸 바깥에 매달려 있는 계란)을 제거하고 절개부위(도 2A)에서비늘을 긁어낸 경우.</li>
		<li>면도날을 사용하여 골반과 항문 지느러미(그림2A)사이에 갈비뼈 사이에 약 2-2.5mm 길이의 절개를 부드럽게 만듭니다. 그런 다음 넓은 팁으로 미세 한 포셉을 사용하여 난소를 조금씩 꺼내면서 생선 복부를 부드럽게 꼬집습니다.</li>
		<li>미세 포셉을 사용하여 난소의 끝을 잘라 내분(도 2B)을제쳐 놓습니다. 참고 : 가능하면 난소 주머니를 부러 뜨리지 않도록주의하십시오. 난소 낭이 깨진 경우, 심지어 비 배란 계란을 떠나지 않고 가능한 한 완전히 모든 gonad 흔적을 제거합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>남성의 낙초 절제술<ol>
<li>항문 위의갈비뼈(그림 2A)를부드럽게 절개하고 미세한 집게를 사용하여 절개를 천천히 엽니다.</li>
		<li>미세 한 집게를 사용하여 부드럽게 고환을 잡고 천천히 고환을 꺼냅니다. 그 후, 고환의 끝을 완전히 제거하기 위해 고환의 끝을 잘라(도 2B). 남성 치열 절제술의 경우, 모든 제제는 절개 부위까지 여성에서 유사합니다. 고환을 잡을 때, 때때로 고환을 닮은 지방이 얻어집니다. 그러나 지방을 복원한 후 고환을 다시 찾아볼 수있다(도 2B). 참고: 남성과 여성 모두, 사망률로 이어질 수 있는 과도 한 손상을 방지 하기 위해 복부에 절개 크기를 최소화 하는 것이 중요 하다. 때때로 내장은 또한 곤드와 함께 절개를 통해 나타날 수 있습니다, 그래서 그들은 제대로 닫기 전에 절개 내부에 반환 되어 있는지 확인. 난소와 메다카 복부의 고환 위치에 대한 사전 지식이 필수적입니다.</li>
	</ol></li>
	<li>남성과 여성에서 유사하게 절개를 봉합(그림 3).<ol>
<li>절개 부위 옆에 나일론 실을 놓고 초미세 포셉을 사용하여 내체 캐비티를 통해 절개 오른쪽으로부터 피부를 찌르고 미세한 집게로 실을 채운다(도3;1-2).</li>
		<li>실을 꺼내기 위해 외부 바디 캐비티를 통해 절개 왼쪽에서 피부를 찌르십시오 (도 3;3-4).</li>
		<li>절개 개구부를 닫고 두 개의 매듭을 만들고 과도한 스레드를 잘라냅니다(그림 3; 4-6). 참고: 봉합사는 적절히 단단해야 하며, 물고기의 나머지 실은 봉합사의 느슨해지는 것을 막을 수 있을 만큼 충분히 길어야 합니다. 마취에서 봉합까지의 전체 절차는 일반적으로 최대 6 분이 걸립니다. 시간이 길어지면 필멸의 삶이 될 수 있습니다.</li>
		<li>물고기를 복구 물에 넣고 수족관 시스템으로 옮기기 전에 적어도 24 시간 동안 물고기를 둡니다. 참고: 고나절제생선은 보통 회복수에서 1-2시간 후에 정상적인 행동을 보여줍니다. 따라서 실험 목적에 따라 이 시간 간격 이후에 물고기를 샘플링할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 혈액 샘플링 절차
<ol><li>유리 바늘, 실리콘 모세관, 구멍이있는 플라스틱 튜브, 빈 1.5 mL 플라스틱 튜브, 소형 심립분리기 및 테이프 : 도구를 준비합니다.</li>
	<li>2.1단계에서 설명된 바와 같이 0.02% 마취용액을 사용하여 물고기를 마취시키고, 물고기를 수직위치(도 4A)에해부 현미경아래에 놓는다. 소달 펑크 정맥의 시각화를 용이하게하기 위해 밝은 표면에 물고기를 놓습니다.</li>
	<li>실리콘 모세관(도4B)에유리 바늘을 부착하여 혈액 서랍을 설치합니다. 넓은 팁 집게로 바늘의 끝을 깨고 흡입 및 불면 항 응고용으로 바늘 내부를 코팅하십시오. 참고: 흡입 시 혈액의 직접적인 접촉을 피하기 위해 최소 50cm 길이의 빨판과 실리콘 모세관을 사용하는 것이 좋습니다. 또한 바늘 끝의 개구부가 충분히 커서 혈액을 그릴 수 있는지 확인하십시오.</li>
	<li>바늘을 물고기의 페더클 영역쪽으로 직접, caudal peduncle 정맥을 목표로(도 5A)바늘의 총 부피가 채워질 때까지 적어도 4 분의 1까지 입을 사용하여 혈액을 그립니다(도 5B). 참고 : 물고기 몸에서 바늘을 제거하기 전에 흡입을 중지하는 것이 중요합니다.</li>
	<li>바늘을 풀어 바늘의 날카로운 면의 근접에 테이프 조각을 넣어. 수거 튜브에 구멍이 있는 뚜껑을 놓고 바늘을 외부에 바늘 끝으로 구멍을 통해 튜브 내부에 놓습니다(도5C).</li>
	<li>물고기를 복구 물에 넣고 수족관 시스템으로 옮기기 전에 적어도 24 시간 동안 물고기를 둡니다. 참고: 동일한 물고기에서 두 번째 혈액 샘플링을 수행하려면 첫 번째 혈액 샘플링 후 1 주일 후에 혈액을 샘플링하십시오.</li>
	<li>채취한 혈액을 1-2초 동안 실온에서 1,000xg로 스핀다운하여 튜브의 혈액을 채취합니다.</li>
	<li>다운스트림 응용 프로그램으로 직접 진행하거나 사용전까지 -20°C에 혈액을 저장하십시오. 참고: 전체 혈액에서 섹스 스테로이드 추출에 대 한 이전 연구를 참조48.</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

이전 문헌에서 보고 된 바와 같이, gonadectomy 및 혈액 샘플링 은 BPG 축의 조절에 섹스 스테로이드의 역할과 관련된 질문을 조사하기 위해 오랫동안 다른 모델 종에서 사용되었습니다. 그러나 이러한 기술은 더 큰 동물에게만 가능할 것으로 보입니다. 일반적으로 사용되는 텔레오스트 모델인 일본 메다카의 작은 크기를 고려하여, 이 종에 대해 가능한 고나데토미및 혈액 샘플링을 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다.
고나데톰화된 물고기의 생존율이 거의 100%에 이르렀다는 사실은 고나데절절제술 절차가 메다카에 적용될 수 있음을 나타낸다. 유사하게, 혈액 샘플링의 절차는 이 절차를 겪은 후에 100% 생존율에 의해 도시된 바와 같이 물고기의 생존도에 영향을 미치지 않습니다. 또한, 가짜 조작 된 수컷과 함께 양육 된 sham-조작 된 여성은 oviposition 및 100 % 수정 된 계란을 나타내며 절개와 봉합 절차는 물고기의 번식에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타냅니다. 즉, 그...

척추 동물에서, 성 스테로이드, 주로 생식선에 의해 생산 되는, 다양 한 피드백메커니즘을통해 뇌-뇌 뇌-Gonadal (BPG) 축의 규제에 중요 한 역할을1,2,3,4,5. 또한, 성 스테로이드는 뇌에서 뉴런의 증식 및 활동에 영향을 미치는6,7,8 및 내분비 세포, gonadotropes를 포함 하 여, 뇌 하 수 체9,10,따라서 뇌와 뇌 하 수 체 가소성에서 중요 한 역할을 제공. 포유류에 상대적으로 좋은 지식에도 불구 하 고, 성 스테로이드에 의해 중재 BPG 축 조절의 메커니즘은 비 포유류 종에서 이해 되 고에서 멀리, 진화 보존 원리의 가난한 이해로 이어지는11. 뇌와 뇌 하 수 체 가소성에 섹스 스테로이드의 역할을 문서화 하는 연구의 여전히 제한 된 수가 있다, 따라서 다양 한 척추 동물 종에 섹스 스테로이드의 역할 및 효과의 추가 조사에 대 한 필요성을 제기.
척추동물 중, 텔레오스트는 스트레스 반응12,13,성장14,15,영양 생리학16,17 및 재생2를포함하여 수많은 생물학적 및 생리학적 질문을 해결하는 강력한 모델 동물이되었다. 텔레오스트, 있는 섹스 스테로이드는 주로 에스트라디올에 의해 표현된다 (E2) 여성과 11 케토 테스토스테론 (11-KT)남성에서 18,19,종에 걸쳐 재생의 일반적인 원리를 조사하기위한 신뢰할 수있는 실험 모델이었다. 텔레오스트는 시상 하 부-뇌 하 수 체 연결에 있는 고유성을 보여줍니다20,21 및 뚜렷한 염소도트로프 세포(22),이는 때때로 규제 메커니즘의 해명에 대 한 편리. 또한, 실험실과 현장 실험 모두에 그들의 편의성으로 인해, teleosts는 다른 유기체에 비해 많은 장점을 제공합니다. 그들은23,24를구입하고 유지하는 것이 상대적으로 저렴합니다. 특히, 제브라피쉬(Daniorerio)와일본 메다카(Oryziaslatipes)와같은 작은 텔레오스트 모델은 매우 높은 fecundity와 상대적으로 짧은 수명 주기가 있는 종으로 유전자 기능 및 질병메커니즘(23)의신속한 분석을 가능하게 하며, 따라서 많은 잘 발달된 프로토콜과 유전적 질병을 고려하여 생물학적 및 생리학적 문제의 과다를 해결하는 데 더 큰 이점을제공한다.
수많은 연구에서, 혈액샘플링 기술과 함께 생식선(gonadectomy)을 제거하는 것은 포유류26,27,28,조류29 및 양서류30에서척추동물 생식 생리학에 미치는 영향을 포함하여 많은 생리적 질문을 조사하는 방법으로 사용되어 왔다. 생식 생리학에 대한 생식 세포절제술 효과는 타목시펜과 클로미펜과 같은 성 스테로이드 길항제에 의해 대안적으로 모방될 수 있지만, 약물의 효과는양성효과(31,32)로인해 일관성이 없는 것으로 보인다. 성 스테로이드 길항제에 만성 노출 난 소 확대로 이어질 수 있습니다33,34,건강에 해로운 표현형으로 인해 장기 목적을 위한 그것의 효과의 관찰을 비활성화할 수 있습니다. 또한, 특정 성 스테로이드의 특정 효과를 보증하기 위해, 성 스테로이드 길항제 치료 후 복구 실험을 수행하는 것은 불가능하다. 그 앞서 언급 한 포인트와 함께, 섹스 스테로이드 길항제 사용의 다른 트레이드 오프 광범위 하 게 검토 되었습니다31,32. 따라서, gonadectomy 여전히 섹스 스테로이드의 역할을 조사 하는 강력한 기술로 오늘 나타납니다.
고나데절과 혈액 샘플링 기술은 상대적으로 더 큰 종에서 수행하기 쉽지만, 유럽 농어(디센트라쿠스 라브릭스)35,블루 헤드 wrasse(탈라소마 비파시아툼)36,도그피쉬(실리오리누스 캐니쿨라)37 및 메기(헤테롭네스 화석 과 클라리아스 목욕 라쿠스)38,39,그들은 작은 물고기에 적용 할 때 도전을 제기한다. 예를 들어, 물고기 마취 전달 시스템 (FADS)40의 사용은 덜 실현 가능하고 작은 물고기에 대한 과도한 물리적 손상경향이있는 것으로 보인다. 또한, 일반적으로 더 큰 물고기(40)에 사용되는 gonadectomy 절차는 과도한 손상을 피하기 위해 높은 정밀도를 필요로하는 작은 물고기에 적합하지 않습니다. 마지막으로, 혈액 샘플링은 혈관에 대한 제한된 접근과 그 동물에 있는 혈액의 소량 때문에 도전적입니다. 따라서, 작은 텔레오스트에서 gonadectomy 및 혈액 샘플링의 모든 단계를 보여주는 명확한 프로토콜은 중요합니다.
이 프로토콜은 동아시아가 원산지인 작은 민물고기인 일본 메다카에서 혈액 샘플링을 거쳐 고나데스토미의 단계별 절차를 보여줍니다. 일본 메다카는 서열게놈, 여러 분자 및 유전적 도구25개,이차성 특성 또는 생식선 이전에 성적 차이에 대한 조사를 허용하는 유전적 성결정 시스템이41로잘 개발된다. 흥미롭게도, 일본 메다카는 다른 많은 텔레오스트 종에 반하는 융합 된 조나(42)를가지고 있습니다. 이 두 가지 기술을 결합한 이 두 가지 기술은 총 8분밖에 걸리지 않으며혈관(43)의라벨링, 뇌하수체섹션(44) 및 뇌뉴런(45)의 패치 클램프, 1차 세포배양(46)을포함하는 이 종에 대해 이미 존재하는 비디오 프로토콜 목록을 완성할 것이다. 이러한 기술은 연구 커뮤니티가 미래에 뇌와 뇌 하 수 체 가소성뿐만 아니라 피드백 메커니즘에서 섹스 스테로이드의 역할을 조사하고 더 잘 이해할 수 있게 해 줄 것입니다.

<table><tbody><tr><td>유리 모세혈관</td><td></td><td>GD1</td><td>필라멘트가 있는 유리 모세관 GD-1; Narishige</td></tr><tr><td>Heparin 나트륨 염</td><td></td><td>H4784-1G</td><td>Sigma-aldrich</td></tr><tr><td>니들 풀러</td><td></td><td>P97</td><td>화염 / 갈색 마이크로 피펫 풀러 모델 P-97; 셔터 계기</td></tr><tr><td>나일론 스레드</td><td></td><td>N45VL</td><td>폴리아미드 봉합사, 0.2 미터법; Crownjun</td></tr><tr><td>플라스틱 튜브</td><td></td><td>T9661</td><td>Eppendorf Safe-lock 마이크로 센트이퓨지 튜브 1.5 ml, Sigma-aldrich</td></tr><tr><td>면도날</td><td></td><td>-</td><td>Astra Superior Platinum Double Edge 면도날 녹색, salonwholesale.com</td></tr><tr><td>실리콘 캐필러리</td><td></td><td>a16090800ux0403</td><td>Uxcell 실리콘 튜브 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com&nbsp;</td></tr><tr><td>트리카인</td><td></td><td>WXBC9102V</td><td>알드리치 화학</td></tr></tbody></table>

작은 크기의 텔레오스 모델 일본어 메다카(오리지아스 latipes)에서고나데토미및 혈액 샘플링 절차

Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes)

성 스테로이드, 생식선에 의해 생산, 뇌와 뇌 하 수 체 조직 가소성및 뇌와 뇌 하 수 체에 피드백을 제공 하 여 모든 척추 동물에서 재생의 신경 내 분 비 제어에 필수적인 역할을. Teleost 물고기는 포유동물에 비해 생식 전략의 조직 가소성과 변화의 높은 수준을 가지고 있으며 섹스 스테로이드의 역할과 그들이 행동하는 메커니즘을 조사하는 유용한 모델로 나타납니다. 스테로이드 레벨을 측정 하기 위해 혈액 샘플링함께 gonadectomy를 사용 하 여 섹스 스테로이드 생산의 주요 소스의 제거 는 잘 설립 하 고 더 큰 물고기에서 상당히 실현 하 고 역할 및 섹스 스테로이드의 효과 조사 하는 강력한 기술. 그러나 이러한 기술은 소규모 텔레오스트 모델에서 구현될 때 문제를 제기합니다. 여기에서는 남성과 여성 일본 메다카 모두에서 고나데토미의 단계별 절차를 설명하고 혈액 샘플링을 진행합니다. 이러한 프로토콜은 높은 생존율, 물고기의 수명 및 표현형에 대한 안전, 성 스테로이드 클리어런스의 관점에서 재현성이 높은 메다카에서 매우 실현 가능한 것으로 나타났다. 이 작은 teleost 모델을 사용 하 여의 다른 장점과 결합 된 이러한 절차의 사용은 크게 척추 동물에서 섹스 스테로이드에 의해 제공 된 생식 및 조직 가소성의 신경 내 분 비 제어에 피드백 메커니즘의 이해를 향상 시킬 것 이다.

이 프로토콜은 작은 크기의 모델 텔레오스트, 일본 메다카에서 gonadectomy 및 혈액 샘플링을 수행하기위한 모든 단계를 설명합니다. 암컷의 오방 절제술(OVX) 후 물고기의 생존율은 100%(물고기 10마리 중 10개)이며, 수컷의 94%(물고기 18마리 중 17마리)는 난초 절제술 후 살아남았다. 한편, 혈액 샘플링 절차가 수행 된 후, 모든 (38 물고기) 물고기가 살아남았다.
샴-조작 된 여성은 oviposition(도 6A)를나타내고 모든 계란은 수정되어 배아 발달을 허용하였다(도 6B). 샴 으로 작동하는 수컷은 1-2 주 후에 계란을 비옥하게 할 수 있었습니다. 부분적으로 고나데브로 자란 6명의 부분적으로 고나데톰화된 암컷 중 2명은 2개월 ...

이 기사는 동물 생리학에서 성 스테로이드의 역할을 조사하기 위해 일본 메다카(Oryzias latipes)를모델로 사용하여 작은 텔레오스트 물고기에서 혈액을 고나데톰화하고 샘플링하는 빠른 프로토콜을 설명합니다.

Sex steroids, produced by the gonads, play an essential role in brain and pituitary tissue plasticity and in the neuroendocrine control of reproduction in ...

이 방법은 신경내분비계에서의 성 스테로이드의 역할, teleosts의 가소성 및 조절, 그리고 더 크게는 척추동물에서 성스테로이드의 역할을 포함하여 생식선의 생리학적 기능에 관한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 것입니다. 이 프로토콜은 연구 커뮤니티에서 널리 사용되는 소형 모델 teleost medeka에서 높은 성공률로 성선 절제술을 수행할 수 있도록 합니다. 성공하고 높은 생존율을 달성하기 위해서는 이 기술, 특히 생식선을 평가하고 물고기를 봉합하는 데 적절한 훈련이 필요합니다.마취액에서 물고기를 꺼내 해부 현미경 아래에 옆으로 수평으로 놓는 것으로 시작합니다. 여성의 난소 절제술을 시행하려면 절개 부위의 비늘을 긁어냅니다. 면도날을 사용하여 갈비뼈와 골반 및 항문 지느러미 사이를 2-2.5mm 정도 부드럽게 절개합니다.끝이 넓은 가는 집게를 사용하여 난소를 꺼내면서 물고기 복부를 부드럽게 꼬집습니다. 사망에 이를 수 있는 갈비뼈가 부러지지 않도록 하는 것이 중요합니다. 가는 집게로 난소 끝을 잘라 따로 보관합니다.남성의 경우 고환 절제술을 시행하려면 항문 위의 갈비뼈 사이를 절개하고 가는 집게를 사용하여 절개 부위를 천천히 엽니다. 집게로 고환을 부드럽게 잡고 천천히 꺼냅니다. 그런 다음 고환의 끝을 잘라 완전히 제거합니다.시술을 시행한 후 남성과 여성 모두 유사하게 절개 부위를 봉합합니다. 절개 부위에 나일론 실을 놓고 절개 부위 오른쪽에서 체강 내를 통해 초미세 집게를 사용하여 실을 잡습니다. 그런 다음 절개 부위 왼쪽에서 체강 바깥쪽을 통해 피부에 구멍을 뚫어 실을 꺼냅니다.절개 구멍을 닫고 2 매듭을 만들고 여분의 실을 자릅니다. 물고기를 등장성 회수수에 넣고 수족관 시스템으로 옮기기 전에 최소 24시간 동안 그대로 두십시오. 실리콘 모세관에 유리 바늘을 부착하여 혈액 서랍을 조립합니다.넓은 끝 집게로 바늘 끝을 부러뜨리고 흡입 및 불어 바늘 안쪽에 항응고 용액을 코팅합니다. 꼬리 꽃자루 정맥을 겨냥하여 바늘을 물고기의 꽃자루 부위 쪽으로 향하게 하고 바늘 총 부피의 1/4 이상이 채워질 때까지 입을 사용하여 혈액을 뽑습니다. 바늘을 풀고 날카로운 면 근처에 테이프 조각을 붙입니다.채취 튜브에 구멍이 있는 뚜껑을 놓고 바늘 끝이 바깥쪽에 있는 구멍을 통해 튜브 내부에 바늘을 넣습니다. 물고기를 회수수에 넣고 수족관 시스템으로 옮기기 전에 최소 24시간 동안 그대로 두십시오. 섬광은 관에 있는 혈액을 모으기 위하여 1, 000 시간 G에 1-2 초 동안 혈액을 회전시킨다.난소 절제술(OVX) 후 여성의 생존율은 100%였고 고환 절제술 후 남성의 경우 94%였다. 모든 물고기는 혈액 채취 절차에서 살아남았습니다. 가짜로 수술한 암컷은 OV 위치를 보였다.모든 난자는 수정되어 배아 발달로 진행되었습니다. 생식선 절제술을 올바르게 시행했을 때 물고기의 체형이 약간 변했고 생식선 조각이 남지 않았습니다. 절개 부위와 봉합사는 성선 절제술 후 4주 후에 완전히 사라졌습니다.4개월 후에도 모든 물고기는 여전히 건강한 표현형을 보였고 생식선 조직은 발견되지 않았습니다. 암컷의 혈액 분석 결과, 수술 24시간 후 OVX 물고기의 E2 수치가 가짜 수술 물고기보다 현저히 낮았습니다. 4개월 후에도 OVX 물고기의 E2 수치는 여전히 가짜 물고기보다 현저히 낮았습니다.생식선의 1/3에서 1/2만 제거된 부분적으로 OVX 물고기는 가짜 물고기보다 E2 수준이 현저히 낮았고, 전체 OVX 물고기보다 E2 수준이 훨씬 높았습니다. 난초 절제술을 받은 수컷의 11-KT 농도는 수술 24시간 후 가짜 수술 물고기보다 현저히 낮았습니다. 4개월 후에도 11-KT 수치는 여전히 가짜 어류보다 낮았습니다.부분적으로 난초 절제술을 받은 물고기는 가짜 수술을 받은 물고기보다 11-KT 수치가 낮았고 완전히 난초 절제술을 받은 물고기보다 높은 수치를 보였습니다. 성공적인 시술을 위해서는 물고기 내부의 다른 기관을 손상시키지 않고 가능한 한 신중하고 완벽하게 생식선을 제거하는 것이 중요합니다. 성 스테로이드가 뇌와 뇌하수체 세포 가소성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있기 때문에 이 기술은 작은 텔레ost 모델에서 기본 메커니즘을 조사할 수 있는 강력한 도구를 제공합니다.

gonadectomy-blood-sampling-procedures-small-size-teleost-model

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Medaka 및 zebrafish는 척추 게놈 기능의 유전자 해부에 대한 보완하고 있습니다. 이 프로토콜은 medaka의 배아에 성공 microinjection, 실험실에서 medaka와 zebrafish를 사용하여 embryological 및 유전자 분석을위한 중요한 기술에 대한 핵심 포인트를 강조 표시합니다.

모델 생물체 유전자로 사용하기 위해 Medaka의 태아의 Microinjection

하드 chorion 부드러운 배아, medaka의 배아의 조작으로 인해 더 zebrafish에 비해 참여합니다. 이 비디오는 chimeras의 생산을위한 이미징 및 세포 이식에 대한 아가로 오스의 장착 dechorionation 포함한 medaka의 배아를 조작하는 방법에 대한 단계별 절차를 나타냅니다. 이러한 절차는 척추 게놈 기능의 유전자 해부 위해 상호 보완적인 기능을 최대한 활용하기 위해 실험실에서 medaka와 zebrafish를 사용하는 필수적입니다.

Chimeras의 생성에 대한 Medaka의 태아 및 세포 이식의 Dechorionation

배아 단계는 생체이물(xenobiotics)에 가장 취약합니다. 화학적 독성은 염도에 따라 다르지만 수생 생물에 대한 독성의 염분 의존성을 테스트하는 방법은 없습니다. 여기에서는 수생 배아에 대한 독성의 염분 의존성을 결정하기 위한 새롭고 높은 처리량의 방법을 설명합니다.

메다카 계란을 사용하여 실버 Nanocolloids의 염도에 의존하는 독성 분석

작은 실험용 물고기는 인간의 뼈 질환의 기저에 있는 메커니즘에 대한 뼈 연구와 뼈 조절 약물의 스크리닝을 위한 인기 있는 모델이 되었습니다. 이 보고서에서는 골다공증성 병변이 있는 medaka 유충의 뼈 세포에 대한 alendronate의 효과를 평가하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

약물 치료와<em&gt; 생체</em&gt;은 메다카 물고기 골다공증 모델에서 조골 파골 세포 상호 작용의 영상

여기서 우리는 제브라 피쉬 섹스의 분화 및 유지 보수의 조사를 용이하게 애벌레 제브라 피쉬의 성선 조직을 분리하기위한 프로토콜을 제시한다.

애벌레 Zebrafish의 생식소 조직의 해부

수륙 양용 생물학의 연구는 많은 분류학 그룹의 유기체를 구동 하는 생식, 생리, 배아 및 개발 프로세스에 대 한 귀중 한 정보를 제공 합니다. 여기에서, 우리는 양서류에 있는 난소 통제 그리고 감시를 공부하기 위하여 이용될 수 있는 다른 방법론에 포괄적인 가이드를 제출합니다.

양서류에서 난소 모니터링 및 제어를위한 생식 기술

체외 수정은 실험실 인구를 유지하고 다운스트림 응용을 위한 동기화된 배아를 생성하기 위하여 모형 유기체의 다양한 통용되는 기술입니다. 여기에서는 멕시코 테트라 물고기인 Astyanax멕시코어의 다양한 개체군에 대해 이 기술을 구현하는 프로토콜을 제시합니다.

아스티야낙스 멕시코의 게임테 컬렉션 및 체외 수정

여기서, 우리는 정상적인 발달 과정을 방해 하지 않고 제 브라 피시 배아의 크기를 감소 시키는 방법을 설명 한다. 이 기술을 사용 하면 크기 변경에 대 한 패턴 스케일링 및 개발 견고성을 연구할 수 있습니다.

배아 패턴 스케일링 연구를 위한 제 브라 피시 수술 크기 감소

이 기사에서는 작은 모델 물고기 medaka (Oryzias latipes)에서 정자를 수집하는 두 가지 빠르고 효율적인 방법과 컴퓨터 보조 정자 분석 (CASA)을 사용하여 정자의 질을 안정적으로 평가하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

Teleost 모델의 정자 수집 및 컴퓨터 보조 정자 분석 일본 메다 카 (Oryzias latipes)

이 프로토콜은 과립세포 세포가 없는 제브라피시에서 깨끗한 I기 난모세포를 신속하게 분리하기 위한 수정된 절차를 설명하여 난모세포별 연구를 위한 편리한 방법을 제공합니다.

과립 세포가 없는 제브라피시에서 Stage I 난모세포의 신속한 분리

성체 수컷 X. laevis에서 한 개의 고환을 외과적으로 제거하는 프로토콜을 제시하여, 나중에 두 번째 고환을 사용할 수 있게 합니다. 이 프로토콜은 체외 수정에 필요한 수컷 개구리 수를 줄이는 것을 목표로 합니다.

성체 수컷 Xenopus laevis의 단측 사인 절제술

배우세요 일본어 메다카(Oryzias latipes)에서 고나데토미 및 혈액 샘플링 절차를 통해 성호르몬의 생리학적 역할을 연구하는 방법을. 이 기술은 생존률 100%를 달성하며 척추동물 신경내분비 가소성 연구에 활용됩니다.

작은 크기의 텔레오스 모델 일본어 메다카(오리지아스 latipes)에서고나데토미및 혈액 샘플링 절차

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