Name: 상호 연결된 뉴런의 마이크론 규모의 조직을 위한 자기 플랫폼 제작 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: 학습하세요 자기 나노입자를 이용한 뉴런 세포 조직화 방법을 통해 마이크론 규모의 신경망 형성을 제어하는 기술입니다. 이 플랫폼은 생체접합 장치 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 과학 기술부, 이스라엘, 그리고 이스라엘 과학 재단 (569/16)에 의해 지원되었다.

참고: 생물 안전 캐비닛에서 모든 생물학적 반응을 수행합니다.
1. 자기 플랫폼 제작
<ol><li>리소 그래피<ol>
<li>스크리버 펜을 사용하여 유리 슬라이드를 2 x 2cm2cm로 자른다. 아세톤으로 유리 슬라이드를 청소한 다음 이소프로파놀을 울트라 초음파 욕조에서 각각 5분 동안 청소합니다. 초고순도(UHP) 질소로 건조시다.</li>
		<li>60s용 6,000rpm의 스핀 코팅을 사용하여 포토레지스트로 유리를 코팅하고 두께1.5μm에 도달하고 60s용 100°C에서 굽습니다. 포토마스크 나 마스크리스 리소그래피를 사용하여 원하는 패턴으로 포토 레지스트에 적합한 파장을 사용하여 샘플을 광원에 노출시하십시오.</li>
		<li>제조업체의 지침에 따라 증류수(DW)로 희석된 개발자에서 40대 를 개발합니다. DW에서 45s로 세척하고 UHP 질소 가스로 건조시십시오. 광학 현미경으로 패턴을 검사합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>스퍼터 증착<ol>
<li>증착 시스템의 메인 챔버에 샘플을 삽입하고 기본 압력 (~5 × 10-8 Torr)을 기다립니다. 가스 흐름을 엽니다. 본 원에서 표준 스퍼터링(28sccm[분당 표준 입방cm)에 대한 아르곤 흐름을 설정합니다. 스퍼터 대상을 점화한 다음 스퍼터 압력을 3mTorr로 설정합니다.</li>
		<li>원하는 속도를 달성할 때까지 각 대상의 전력을 늘립니다. 참고: Pd 요금: 0.62 A/s = 16s에서 1.0 nm; Co80Fe20 비율: 0.32 A/s, 0.2 nm 에서 6.25 s.</li>
		<li>회전을 켭니다. 각각 대상 셔터를 열고 닫아 Co80Fe20과 Pd 대상을 번갈아 가며 FM 다층을 증정합니다. Co80Fe20 (0.2 nm)/Pd (1.0 nm)의 14 개의 바이레이어를 입금하고 추가 2 nm Pd 캡핑 레이어로 마무리하십시오.</li>
		<li>리프트 오프: 샘플을 아세톤에 30분 간 담그고 이소프로판올로 헹구세요. 그런 다음 UHP 질소로 건조하고 사용전까지 깨끗하고 건조한 환경에서 샘플을 유지합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 운송 측정을 통한 자기 장치의 특성화
<ol><li>FM 다층으로 증착된 100 μm 너비의 교차 모양의 자기 막대가 있는 Si 기판 또는 유리 슬라이드를 사용합니다(그림 1C 인셋 참조). 양면 테이프를 사용하여 샘플을 홀더에 부착합니다.</li>
	<li>와이어 본더를 사용하여 4개의 와이어를 샘플에 결합하고, 하나는 교차 전극의 각 다리에 연결됩니다. 자기장이 시료에 수직이 되도록 자기장으로 운송 측정 시스템 내부의 샘플 홀더 및 샘플을 설정합니다. 실온에서 측정을 수행합니다.</li>
	<li>장치의 횡방향 전압(VT)측정을 수행; 그림 1C(인세트)의 표시를 따르십시오: 접점 1과 3 사이에 1mA의 전류를 적용합니다. 접촉 2와 4 사이의 VT를 측정합니다. 그런 다음 2와 4 사이의 전류를 적용하고 1과 3 사이의 전압을 측정합니다. 마지막으로, 측정의 전압 차이를 계산하고 VT를얻기 위해 2로 분할합니다. 스위칭 시스템을 사용하여 두 측정 구성 간에 자동으로 변경합니다.</li>
	<li>자기장을 0.4 T에서 -0.4 T 사이의 단계로 5mT의 단계로 쓸어 내고 VT를 필드의 함수로 측정합니다. 횡방향 저항(VT/I)대 자기장을 플롯하여 필름의 수직 자화에 비례하는 비정상적인 홀 신호를 결정합니다.</li>
</ol>3. 자기 측정에 의한 MP 및 자기 다층의 특성화
<ol><li>FM 다층용 자기 측정<ol>
<li>SI 기판에 FM 다층입금(섹션 1.2 참조). 샘플을 4 x 4mm2 크기의 6 제곱으로 자른다. 샘플을 다른 위에 쌓고 자기장의 방향에 수직으로 캡슐에 정렬합니다(그림 1D 인세트 참조).</li>
		<li>캡슐을 자력계에 삽입하고 실온에서 자화를 측정합니다. 자기장을 -0.4 T와 0.4 T 사이로 쓸어 버리면 됩니다.</li>
		<li>자기 층의 두께, 샘플의 크기 및 기판 수를 고려하여 자기 물질의 총 부피를 계산합니다. 자기 물질의 총 부피로 자화를 분할합니다.</li>
		<li>자기장(단위 부피당)과 자기장을 플롯합니다. 높은 자기장 반응으로부터 기판의 횡자기 배경을 빼고 그래프에서 FM의 포화 자화를 추정한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>MP용 자기측정<ol>
<li>지정된 대량의 MP를 합성 폴리머 캡슐에 삽입합니다. 작은 자화 포화 값을 측정하는 경우 더 큰 볼륨을 고려하십시오.</li>
		<li>의원이 용매에 일시 중단되는 경우 캡슐을 하룻밤 동안 열어 두어 MP를 건조하십시오. 캡슐을 자력계에 삽입하고 실온에서 자화를 측정합니다. 자기장을 -0.2 T와 0.2 T 사이로 쓸어 버리면 됩니다.</li>
		<li>지정된 볼륨을 입자 농도로 곱하여 MP의 총 질량을 계산합니다. 결과를 1g으로 정규화합니다.</li>
		<li>정규화된 자화(그램당)와 자기장을 플롯합니다. 그래프에서 MP의 자화 포화도를 추정합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 콜라겐 코팅 프로토콜
<ol><li>코팅 플라스틱 접시<ol>
<li>0.01 M HCl을 자동 증류수(DDW)의 500mL에 HCl 490 μL을 추가하여 준비합니다. 참고: 화학 후드에서만 이 단계를 수행합니다.</li>
		<li>콜라겐 타입 1(쥐 꼬리로부터용액) 0.01 M HCl에서 1:60-1:80을 희석하여 50 μg/mL의 최종 작동 농도를 얻습니다. 35mm 배양 접시에 희석 용액 1.5mL를 놓습니다. 후드에 접시를 1 시간 동안 그대로 둡니다.</li>
		<li>용액을 제거하고 멸균 1x 인산염 완충식식염(PBS)으로 3배 세척합니다. 요리는 세포 씨를 위해 준비가되어 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>코팅 유리 슬라이드<ol>
<li>콜라겐 타입 1 (쥐 꼬리에서 용액) 1:50 에서 30% v/v 에탄올을 희석합니다. 35mm 접시를 코팅하려면 20 μL의 콜라겐을 30% 에탄올 의 1mL에 추가하십시오.</li>
		<li>용액으로 접시를 덮고 모든 솔루션이 증발할 때까지 기다려 몇 시간 동안 접시를 덮어 둡시다. 멸균 1x PBS로 3배 세척; 유리 슬라이드는 셀 시드를 위한 준비가 되어 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 셀룰러 MNP 의 섭취와 생존 가능성
<ol><li>셀룰러 MNP 섭취<ol>
<li>10% 말 세럼(HS), 5% 태아소 혈청(FBS), L-글루타민 1%, 페니실린/스트렙토마이신 1%, 로스트웰파크 의료연구소(RPMI) 배지에 0.2% 앰포테리신, 필터 를 사용하여 0.22 μm 을 사용하여 PC12 세포 배양을 위한 기본 성장 배지를 준비한다.</li>
		<li>말 혈청(HS), L-글루타민 1%, 페니실린/연쇄절제술 1%, RPMI 배지에 0.2% 암포테리신을 추가하여 PC12 분화 매체를 준비하고 0.22 μm 나일론 필터를 사용하여 필터를 사용한다.</li>
		<li>기본 성장 배지의 10 mL를 가진 비 처리 된 배양 플라스크에서 세포를 성장; 2-3일마다 플라스크에 기본 성장 배지 10mL를 추가하고 8일 후에 세포를 하위 배양한다.</li>
		<li>세포 섭취의 경우, 원심분리기 튜브에서 20 ×0g 및 실온에서 8분 동안 세포 현탁액을 원심분리하고 상체를 폐기하십시오.</li>
		<li>신선한 기본 성장 배지의 3 mL에서 세포를 다시 중단합니다. 다시, 원심 분리는 200 g및 실온에서 5 분 동안 세포 현탁액을 ×, 상체를 폐기합니다. 신선한 분화 배지의 3mL에서 세포를 다시 중단합니다.</li>
		<li>주사기와 바늘을 사용하여 세포 클러스터를 분해하는 세포를 10배 흡입합니다. 혈전계를 사용하여 세포를 계산하고, 일반 코팅되지 않은 35mm 접시에 106 세포를 시드.</li>
		<li>접시에 MNP 서스펜션의 계산된 부피와 분화 매체의 부피를 추가하여 원하는 MNP 농도 및 총 부피를 달성한다. 세포, MP 및 분화 배지를 혼합; 24시간 동안 37°C에서 5% CO2 가습 인큐베이터로 접시를 배양한다.</li>
		<li>실온에서 20 ×0 g에서 5 분 동안 셀 서스펜션을 원심 분리하고 상복부을 폐기하십시오. 신선한 분화 배지의 1 mL에서 세포를 다시 중단하고 혈류계를 사용하여 세포를 계산합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>MNP 로드 셀 분화<ol>
<li>수행 프로토콜(섹션 5.1)을 수행합니다. 종자 8 × 104 MNP로드 셀에 35mm, 콜라겐 형 l-코팅 된 접시분화 배지의 존재(섹션 4.1에서 콜라겐 코팅 프로토콜 참조). 24 시간 후, 추가 1:100 신선한 뮤린 베타 신경 성장 인자 (β-NGF) (최종 농도 50 ng/mL).</li>
		<li>분화 매체를 갱신하고 2 일마다 신선한 뮤린 β-NGF를 추가하십시오. 광학 현미경 검사를 사용하여 2 일마다 세포를 이미지합니다. 네트워크 형성 후(PC12 세포의 경우 6-8일), 공초점 현미경을 이용하여 세포를 이미지화하고, 입자의 형광을 관찰한다.</li>
	</ol></li>
	<li>MNP 로드 셀에 대한 생존 가능성 분석: 2,3-bis-(2-메톡시-4-니트로-5-설포페닐)-2H-테트라졸륨-5-카르바카니드(XTT) 세포 생존성 테스트.<ol>
<li>5.1.1 단계에 따라 기본 성장 매체를 준비합니다. 다양한 농도(0.1 mg/mL, 0.25 mg/mL, 0.5 mg/mL 기본 성장 매체)에서 MPP를 가진 PC12 세포를 육성하고 또한 평평한 96웰 플레이트(총 부피 100 μL/well)에서 삼중판에 대한 제어에 대한 MPP없이 육성한다. 37°C에서 5% CO2,가습된 인큐베이터에서 24시간 동안 세포를 배양한다.</li>
		<li>배경 보정을 위해 셀없이 매체를 포함하는 빈 우물을 준비합니다. XTT 시약 용액을 해동하고, 사용직전에 37°C 배스내로 N-메틸 디벤조피라진 메틸 황산염을 함유한 반응 용액을 해동한다. 명확한 해결책이 얻어지을 때까지 부드럽게 소용돌이치십시오.</li>
		<li>하나의 96웰 플레이트의 경우 XTT 시약 5mL와 활성화 용액 0.1 mL을 혼합하십시오. 각 우물에 반응 용액의 50 μL을 추가하고, 우물에서 염료를 균일하게 분배하기 위해 접시를 약간 흔들어 5 시간 동안 인큐베이터에 플레이트를 배양합니다.</li>
		<li>450 nm의 파장에서 효소 연결 면역 소르벤트 분석기(ELISA) 판독기를 사용하여 빈 우물에 대한 샘플의 흡광도를 측정합니다. 630 nm의 파장을 사용하여 기준 흡광도를 측정하고 450 nm 측정에서 빼낸다.</li>
		<li>XTT 시약으로 배양된 배양 배지에서 450nm의 약간의 자발적흡광도가 발생함에 따라, 다른 우물의 평균 흡광도를 빼낸다. 셀 샘플과 동일한 테스트된 농도에서 MP의 병렬 샘플에서 신호 값을 뺍니다.</li>
	</ol></li>
	<li>MNP 로드 셀에 대한 생존 가능성 분석: 레사쥐린 기반 세포 생존 가능성 테스트<ol>
<li>5.1.1 단계에 따라 기본 성장 매체를 준비합니다. 다양한 농도(0.1 mg/mL, 0.25 mg/mL, 기본 성장 매체에서 0.5 mg/mL) 및 24시간 동안 평평한 96웰 플레이트에서 MPPs를 제어하지 않고 MPP를 가진 PC12 세포를 경작한다. 37°C에서 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 세포를 배양한다. 세포 없이 배지를 포함하는 빈 우물을 준비합니다.</li>
		<li>1x PBS로 셀을 씻으시면 됩니다. 37°C 인큐베이터에서 2h에 대한 배지에 레사쥐린 기반 시약(10%w/v)을 첨가한다.</li>
		<li>ELISA 리더에 샘플의 150 μL 알리쿼트를 배치하고 560 nm의 흡사 파장및 590 nm의 방출 파장에서 흡광도를 측정합니다. 셀 샘플과 동일한 테스트된 농도에서 MP의 병렬 샘플에서 신호 값을 뺍니다.</li>
	</ol></li>
</ol>6. 유도 결합 플라즈마 (ICP)를 사용하여 세포 내부MNP 농도의 특성화
<ol><li>5.1.1 단계에 따라 기본 성장 매체를 준비합니다. 다른 농도 (0.1 mg / mL, 0.25 mg /mL, 기본 성장 매체에서 0.5 mg /mL) 및 평평한 96 웰 플레이트 (총 부피 100 μL /웰)에서 삼중 판에서 제어로 MPPs없이 MPP와 PC12 세포를 육성합니다. 5%CO2,가습인 인큐베이터에서 24시간 동안 37°C에서 배양한다.</li>
	<li>서스펜션을 원심분리관(각각 잘 분리)으로 옮기고, 원심분리기 세포는 실온에서 5분 동안 × g에서 200g으로 옮기고 상부체를 폐기한다. 신선한 분화 배지의 1 mL에서 세포를 다시 중단하고 혈류계를 사용하여 세포를 계산합니다.</li>
	<li>적어도 15 분 동안 각각 잘 각각 에 70 % 질산의 100 μL로 처리하여 세포를 lyse. lysed 셀에 DDW 5mL을 추가하고 솔루션을 필터링합니다.</li>
	<li>ICP를 사용하여 철 농도를 측정하고 세포 수를 사용하여 세포당 Fe 농도를 기록합니다.</li>
</ol>7. 자기 플랫폼의 세포 분화 및 성장
<ol><li>패턴기판을 70% v/v/에탄올로 청소하고 기판을 후드에 35mm 배양 접시에 놓습니다. 패턴기판 아래에 큰 자석(~1500 Oe)을 1분 동안 놓고 먼저 자석에서 접시를 위아래로 이동한 다음 자석을 후드에서 꺼내서 자석을 제거합니다. 자외선을 15분 동안 켭니다.</li>
	<li>4.2항에 따라 기판을 콜라겐 유형 1로 코팅합니다. 세포 MNP 섭취량(섹션 5.1), 35mm 배양 접시에105세포를 종자 후 세포를 중단하고, 분화 배지의 2mL를 추가한다. 37°C에서 5% CO2,가습인 인큐베이터로 배양한다.</li>
	<li>24 시간 후, 추가 1:100 신선한 뮤린 β-NGF (50 ng/mL의 최종 농도). 분화 매체를 갱신하고 2 일마다 신선한 뮤린 β-NGF를 추가하십시오. 가벼운 현미경 을 사용하여 2 일마다 세포를 이미지하고, 네트워크 형성 후, 세포에 면역 염색을 수행 (섹션 8.1).</li>
</ol>8. MNP로드 셀 염색
<ol><li>튜불린 면역 염색<ol>
<li>10mL의 16%w/v PFA 용액, 10x PBS 4mL, DDW 26mL을 혼합하여 4% 파라포름데히드(PFA) 용액을 준비한다. 비이온 계면활성제500μL을 1x PBS50mL에 추가하여 50mL의 1% PBT를 50mL로 준비한다. 1% PBT의 25mL와 1x PBS의 25mL를 혼합하여 0.5% PBT의 50mL를 준비한다. 1% 소 세럼 알부민과 1%의 일반 당나귀 세럼을 0.25% PBT로 혼합하여 블로킹 솔루션을 준비합니다. 참고: 화학 후드 내부에서만 PFA를 사용하십시오.</li>
		<li>셀에서 상체 배지를 제거합니다. MNP로드 셀을 화학 후드 내부의 실온에서 15분 동안 4% PFA로 수정합니다. MNP로드 셀을 1x PBS로 3배, 세척할 때마다 5분씩 화학 후드 안에 세척합니다.</li>
		<li>MNP 로드 셀을 10분 동안 0.5% PBT로 페메아빌화합니다. MNP 로드 된 세포를 실내 온도에서 45 분 동안 차단용으로 먼저 배양한 다음 토끼 방지 α-tubulin 항체를 차단용으로 4 °C에서 밤새 차단합니다. 1x PBS로 MNP 로드 셀 3배, 세척 시 5분 세척.</li>
		<li>MNP로드 세포를 Cy2-conjugated 당나귀 항토끼 이차 항체로 어둠 과 실온에서 45분 동안 배양합니다. MNP로드 셀을 1x PBS로 3배, 세척할 때마다 5분 세척합니다.</li>
		<li>공초점 이미징을 수행합니다. 튜룰린의 경우 492nm의 여기 파장과 510nm의 방출 파장을 사용하십시오. MP의 경우 (로다민)의 경우 578 nm의 흥분 파장과 613 nm의 방출 파장을 사용합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>4′,6-디아미드노-2-페닐린돌 (DAPI)로 핵 염색<ol>
<li>MNP로드 셀을 1x PBS로 3배, 세척할 때마다 5분 세척합니다. 시료 주위의 여분의 액체를 제거하고, DAPI를 함유한 마운팅 매체의 1방울(~50 μL)을 추가하여 22mm x 22mm의 면적을 커버하고, 어둠과 실온에서 5분 동안 배양합니다.</li>
		<li>MNP로드 셀을 1x PBS로 3배, 세척할 때마다 5분 세척합니다. 공초점 이미징을 수행합니다. DAPI의 경우 358nm의 난회 파장과 461nm의 방출 파장을 사용하십시오. MP의 경우 (로다민)의 경우 578 nm의 흥분 파장과 613 nm의 방출 파장을 사용합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. 측정 및 통계 분석
<ol><li>MNP 로드 셀 분화의 형태 분석<ol>
<li>세포체로부터의 다양한 거리에서 교차의 수를 측정하기 위해 NGF로 치료 후 최대 3일 동안 배양된 세포의 상 영상을 습득한다. 참고: 나중에 수행하면 세포가 네트워크를 개발하여 단일 세포 분해능 측정을 방지할 수 있습니다.<ol>
<li>이미지 프로세싱 프로그램인 ImageJ에서 이미지를 열고 반자동 중성염 추적 및 길이측정(36)을가능하게 하는 NeuronJ 플러그인을 사용합니다. neurite 추적자 플러그인을 사용하여 neurites를 추적하고 데이터를 이진 이미지로 변환합니다. 소마의 중심을 정의합니다.</li>
			<li>NeuronJ 플러그인에서 사용할 수 있는 Sholl 분석을 수행합니다. 최대 반지름을 정의합니다. 실험을 세 번 반복합니다. 각 실험에서 100개 이상의 세포를 분석합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>셀 현지화 분석<ol>
<li>인큐베이션 3일 후 자기 영역에 국소화된 세포의 백분율을 결정하기 위해 MNP 섭취 유무에 관계없이 세포의 공초점 현미경 이미지를 획득한다. DAPI 염색(섹션 8.2)을 사용합니다.</li>
		<li>수동으로 패턴 (감기 세포) 및 그렇지 않은 세포 위에 또는 부분적으로 세포를 계산합니다. 세 가지 실험을 반복합니다. MNP와 섭취량 없이 400개 이상의 세포를 분석합니다.</li>
		<li>총 세포 수의 자기 패턴 위에 있는 세포의 상대적 비율을 계산합니다.</li>
		<li>단일 샘플 Z-테스트를수행하여 세포 분포가 동위혈세포 착륙의 결과인지, 또는 자기 패턴에 바람직한 바이어스가 있는지 를 분석한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>성장 지향성 분석<ol>
<li>중성염 외성장 방향성에 미치는 영향을 정량화하기 위해 8일간의 배양 후 MNP 치료 유무에 관계없이 세포의 공초점 현미경 이미지를 획득한다. 면역 염색(섹션 8.1)을 수행합니다.</li>
		<li>ImageJ 소프트웨어를 사용하여 두 조건에서 셀 중성염과 마그네틱 스트라이프 사이의 각도를 측정합니다. 참고: 마그네틱 스트라이프에 있는 소마에서 유래한 중성염만 분석합니다.</li>
		<li>줄무늬(Δθ)의 방향을 기준으로 중성염 각도의 분포를 플롯합니다. Δθ분포의 치제곱 테스트를 수행하여 분포가 정상또는 균일하지 않음을 입증합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

저자는 경쟁 적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

대표적인 결과는 미크로네 규모의 신경망 형성을 제어하고 조직하기 위한 제시된 방법론의 효과를 입증한다. MNP로드 PC12 세포는 실행 가능한 상태로 남아 있으며 FM 전극에서 특정 부위로 자기 힘에 매료된 자기 민감성 장치로 변형되었습니다. 이것은 세포가 얇은 선이 아닌 육각형의 더 큰 정점에게 우선적으로 부착된 그림 5C에서가장 잘 설명됩니다. 더욱이, 세포의 분기는 또한 자기 패턴을 따르는 호의적으로 발전했습니다. 모든 대조군 실험은 자기력이 세포 체와 아웃성장을 국소화하도록 지시했다는 것을 명백하게 입증하였다. 지형큐가 중성염(40)을 지시하는 데 사용될수 있다는 것이 입증되었지만,41,국회의원이 없는 세포가 패턴의 형상에 아무런 반응을 보이지 않았기 때문에 여기서는 그렇지 않다.
상향식 접근 법은 많은 연구 시설에...

뉴런의 마이크로패턴은 조직 재생1,2,3,4,5 및 신경전자기기6,7,8의개발에 큰 잠재력을 지니고 있다. 그러나 생물학적 조직에서와 같이 높은 공간 해상도에서 뉴런의 미크론 스케일 포지셔닝은 중요한 과제를 제기합니다. 이 규모에 미리 디자인된 구조물을 형성하는 것은 현지으로 소마 운동성 및 축축한 성장을 통제하여 신경 세포 프로세스의 지도가 필요합니다. 이전 연구는 화학 및 물리적 단서의사용을 제안9,10,11,12 신경 성장을 안내하기위한. 여기서, 새로운 접근법은자기장 그라데이션(13,14,15,16,17)에의한 세포 포지셔닝을 제어하여 원격으로 조작할 수 있는 자기 민감성 단위로 MPP를 탑재하는 세포를 선회하는 데 초점을 맞추고 있다.
마그네틱 칩 및 MNP 로드 셀을 사용하여 세포 반응을 유도하는 데 필요한 힘을 특징으로 하는 Kunze 등은 세포 내부의 기계적 장력에 의해 초기 축하 신장을 유발할 수 있음을입증하였다(18). Tay 등은 향상된 자기장 그라데이션을 갖춘 미세 가공 기판이 칼슘 표시기염료(19)를사용하여 MP와 함께 투제된 신경 회로의 무선 자극을 허용한다는 것을 확인하였다. 더욱이, Tseng 외. 세포 내부의 나노 입자를 결합하여 세포장력(20)에접근하는 국소화된 나노입자 매개 력을 초래하였다. 이것은 기계적 힘에 세포 반응을 공부하는 것을 도운 마이크로 자기 기판의 정의된 패턴의 제조로 이끌어 냈습니다. 국소화된 나노입자 매개력의 적용으로부터 발생하는 세포장력은세포(20)내의 나노입자를 결합함으로써 달성되었다. 상보금속 산화물 반도체(CMOS)-미세유체 하이브리드 시스템은 CMOS 칩에 마이크로 전자석 배열을 내장하여 자기비드(21)로태그된 개별 세포의 움직임을 제어하는 이외 에 의해 개발되었다.
Alon 외. 마이크로 스케일, 미리 프로그래밍 된 자기 패드를 자기 "핫스팟"으로 사용하여 세포(22)를찾습니다. 특정 활성은 또한 특정 세포립23에서나노 입자를 국소화하기 위해 마이크로 패턴 자기 배열을 사용하여 세포 내에서 자극 될 수있다. 셀룰러 MNP 섭취량은 거머리, 쥐 및 마우스 기본 뉴런24,25,26에서성공적으로 입증되었다. 여기서, 이것은 이전에 MPNPs27의높은 upup을 보여주기 위하여 보고된 쥐 PC12 pheochromocytoma 세포주에서 입증되었습니다. 최근에는 암 치료제28,29,30,31에서약물 전달 및 열요법을 포함한 다양한 의료 응용 프로그램이 있었습니다. 구체적으로, 연구는 MP와 뉴런 네트워크32,33,34, 35의응용프로그램을다룹니다. 그러나, 단일 세포 수준에서 의원을 사용 하 여 뉴런의 자기 조직 추가 조사를 받을 자격이.
이 작품에서, 상향식 접근 방식은 신경 배열을 제어하기 위한 미리 디자인된 플랫폼을 통해 현지 자기력을 설계하기 위하여 기술되었습니다. FM 다층의 미크로네 스케일 패턴의 제조가 제시되었습니다. 이 독특한 FM 다층 구조는 안정적인 수직 자화를 만들어 모든 자기 패턴에 대한 효과적인 어트랙션 력을 초래합니다. 인큐베이션을 통해 MP는 PC12 세포에 로드되어 자기 에 민감한 장치로 변형시켰습니다. MNP 로드 된 세포, 도금 및 자기 플랫폼 위에 분화, 자기 패턴에 우선적으로 부착되었고, neurite 아웃 성장은 패턴 모양과 잘 정렬되어 지향 네트워크를 형성하였다. FM 다층 및 MP의 자기 특성을 특성화하기 위해 여러 가지 방법이 기재되었으며, 세포 MNP 섭취량 및 세포 생존 가능성 감수성에 대한 기술도 제시되었다. 또한, 뉴런 성장의 형태학적 매개 변수와 결과의 통계 적 분석은 상세하다.

<table><tbody><tr><td>16% 파라포름알데히드(포름알데히드) 수용액</td><td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>6웰 세포 배양 플레이트</td><td>FALCON</td><td>353846</td><td></td></tr><tr><td>96웰 세포 배양 플레이트</td><td>SPL 생명 과학</td><td>30096</td><td></td></tr><tr><td>암포테리신 B 용액</td><td>생물학</td><td>산업 03-028-1B</td><td></td></tr><tr><td>AZ 1514H 포토레지스트</td><td>MicroChemicals </td><td></td><td></td>GmbH</tr><tr><td>AZ 351 B 개발자</td><td>MicroChemicals GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td><td>생물학 산업</td><td>03-010-1B</td><td></td></tr><tr><td>세포 및 조직 배양 플라스크</td><td>Biofil</td><td>TCF002250</td><td>75.0 cm^2 250 mL 벤트 캡, 비처리</td></tr><tr><td>세포 배양 접시</td><td>Greiner Bio-One</td><td>627-160</td><td>35 mm</td></tr><tr><td>세포 증식 키트(XTT 기반)</td><td>생물학 산업</td><td>20-300-1000</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 튜브</td><td>Biofil</td><td>CFT021500</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>Co80Fe20 at% 스퍼터 타겟</td><td>ACI 합금</td><td></td><td>99.95</td></tr><tr><td>%콜라겐 유형 I</td><td>Corning Inc.</td><td>354236</td><td>쥐꼬리, 농도 범위 3-4 mg/mL</td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Leica</td><td></td><td>TCS SP5</td></tr><tr><td>Cy2-conjugated AffiniPure Donkey Anti-rabbit 2차 항체</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td>DAPI 플루오로마운트-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>일회용 바늘</td><td>KDL</td><td></td><td>23 G</td></tr><tr><td>일회용&nbsp; 주사기</td><td>Medispo</td><td>1160227640</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>기증자 말 혈청</td><td>Biological Industries</td><td>04-124-1A</td><td></td></tr><tr><td>ELISA 리더</td><td>Merk Millipore</td><td></td><td>BioTek 시너지 4 하이브리드 마이크로 플레이트 리더</td></tr><tr><td>에탄올 70 %</td> <td>ROMICAL LTD</td><td>19-009102-80</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 절대 (탈수)</td> <td>Biolab-chemicals</td><td>52505</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청 (FBS)</td> <td>생물 산업</td><td>04-127-1A</td><td></td></tr><tr><td>신선한 쥐 &beta; -NGF</td><td>Peprotech</td><td>450-34</td><td></td></tr><tr><td>GMW C- 프레임 전자석 .</td><td>버클리 시스템 LTD</td><td></td><td>3470, 45mm</td></tr><tr><td>염산 32%</td><td>대정화학 & METALS</td><td>4170-4100</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>US National Institutes of Health, Bethesda</td><td></td><td>NeuronJ 플러그인</td></tr><tr><td>유도 결합 플라즈마(ICP)</td><td>Ametek Spectro</td><td></td><td>SPECTRO ARCOS ICP-OES, FHX22 MultiView 플라즈마</td></tr><tr><td>Keithley 소스 측정 Keithley</td><td></td><td></td><td>2400</td></tr><tr><td>Keithley 스위칭 시스템</td><td>Keithley</td><td></td><td>3700</td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>생물학 산업</td><td>03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>광학 현미경</td><td>Leica</td><td></td><td>DMIL LED</td></tr><tr><td>마스크리스 포토리소그래</td>피 <td>Heidelberg Inst.</td><td></td><td>MLA150</td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>BAR-NAOR</td><td>BN1042000C</td><td></td></tr><tr><td>질산 70%</td><td>시그마-알드리치</td><td>438073</td><td></td></tr><tr><td>노멀 당나귀 혈청(NDS)</td><td>시그마</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>hylabs</td><td>BP507/1LD</td><td></td></tr><tr><td>PC12 세포주</td><td>ATCC</td><td>CRL-1721</td><td></td></tr><tr><td>Pd 스퍼터 타겟</td><td>ACI 합금</td><td></td><td>99.95%</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 니스타틴 용액</td><td>생물학 산업</td><td>03-032-1B</td><td></td></tr><tr><td>PrestoBlue 세포 생존 시약</td><td>분자 프로브</td><td>A-13261</td><td>레사주린 기반</td></tr><tr><td>토끼 항체 &alpha;-tubulin</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RF 마그네트론 스퍼터링 시스템</td><td>Orion AJA Int.</td><td></td><td>L</td></tr><tr><td>-글루타민이 있는 Orion 8 RPMI 1640</td><td>Biological Industries</td><td>01-100-1A</td><td></td></tr><tr><td>초음파 처리 수조</td><td>KUDOS</td><td>SK3210HP</td><td>주파수: 53kHz. 초음파 출력: 135W</td></tr><tr><td>SQUID 자력계</td><td>Quantum Design, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>CHEM-IMPEX INTERNATIONAL</td><td>1279</td><td>비이온 계면활성제</td></tr><tr><td>XTT 세포 생존율 시약</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

상호 연결된 뉴런의 마이크론 규모의 조직을 위한 자기 플랫폼 제작

Fabrication of Magnetic Platforms for Micron-Scale Organization of Interconnected Neurons

조직 된 신경망으로 뉴런을 직접 하는 능력은 재생 의학에 대 한 큰 의미를 가지고, 조직 공학, 그리고 바이오 인터페이싱. 많은 연구는 화학 및 지형 단서를 사용 하 여 신경 세포를 지시 하는 것을 목표로. 그러나, 넓은 지역에 미크론 규모에 조직 통제의 보고는 부족합니다. 여기서, 마이크로 패턴, 자기 원소에 내장된 자기 플랫폼을 사용하여 미리 설정된 부위에 뉴런을 배치하고 미크로네 스케일 해상도로 뉴런 아웃성장을 유도하는 효과적인 방법이 설명되었습니다. 자기 나노 입자 (MNP)를 가진 뉴런을 적재하는 것은 자기 그라데이션에 의해 영향을 받을 수 있는 민감한 자기 단위로 변환한다는 것을 보여주었습니다. 이 접근법에 따라, 일반적인 뉴런과 같은 모델인 PC12 세포가 도금되고 초파라자성 나노 입자로 로드되는 독특한 자기 플랫폼이 제작되었습니다. 안정적인 수직 자화를 가진 강자성(FM) 다층의 박막이 증착되어 자기 패턴을 향한 효과적인 어트랙션력을 제공하도록 증착되었다. 이러한 MNP 로드 PC12 셀은 자기 플랫폼 위에 도금및 분화되어 자기 패턴에 우선적으로 부착되었으며, 중성염 아웃성장이 패턴 형상과 잘 정렬되어 지향 네트워크를 형성하였다. 자기 특성의 정량적 특성화 방법, 세포 MNP 섭취량, 세포 생존가능성 및 결과의 통계적 분석이 제시된다. 이 접근법은 신경망 형성의 제어를 가능하게하고 자기력의 조작을 통해 신경-전극 인터페이스를 향상, 이는 네트워크의 체외 연구를위한 효과적인 도구가 될 수 있으며 새로운 치료 생체 통합 방향을 제공 할 수 있습니다.

기하학적 모양이 다른 자기 플랫폼이 제작되었습니다(그림1A). 자기 패턴은 스퍼터링에 의해 증착되었다 : Co80Fe20 및 Pd의 14 다층, 각각 0.2 nm 및 1 nm. 전자 현미경 검사법은 ~18nm(도1B)로자기 패턴의 총 높이를 드러냈다. 이 독특한 FM 다층 증착은 MNP로드 셀의 전체 자기 패턴과가장자리(22,37)를향해 도용된 세포의 매력을 가능하게 하는 기판 평면에 비해 수직 자화 완화(PMA)를 갖춘 안정적인 플랫폼을 생성한다. FM 다층 구조의 파라미터는 FM 다층의 교차형 장치가 제조된 자력 수송 측정(도1C 인세트)을 특징으로 하고, 기판에 수...

이 작품은 신경 조직의 제어를위한 지역 자기력의 엔지니어링에 상향 식 접근 방식을 제시한다. 자기 나노 입자 (MNPs)로로드 된 뉴런 과 같은 세포는 수직 자화와 마이크로 패턴 플랫폼에 의해 도금및 제어됩니다. 또한 자기 특성화, MNP 세포 섭취, 세포 생존 가능성 및 통계 분석이 설명되어 있습니다.

The ability to direct neurons into organized neural networks has great implications for regenerative medicine, tissue engineering, and bio-interfacing. ...

우리의 접근 방식을 통해 자기 조작을 사용하여 신경망 형성을 제어할 수 있습니다. 이것은 네트워크의 체외 연구를위한 효과적인 도구이며 생체 계면 장치에 대한 새로운 치료 방향을 제공합니다. 이 기술을 통해 우리는 마이크로폰 스케일에서 세포의 위치와 성장을 모두 제어하여 자기 패턴과 네트워크 조직을 유연하게 설계할 수 있습니다.효율적이고 독성이 없는 자기 나노입자 멸균이 중요합니다. 성공하려면 적절한 자기 나노 입자가 필요합니다. 중요한 특징은 크기, 코팅 및 상황 자화 값입니다.절차를 시연하는 것은 내 실험실의 마스터 학생인 Reut Plen과 Dafna Levenberg가 될 것입니다. 먼저 스크리버 펜을 사용하여 유리 슬라이드를 2센티미터 로 잘라냅니다. 유리 슬라이드를 아세톤으로 청소한 다음 초음파 욕조에서 각각 5분 동안 이소프로파놀을 청소합니다.그런 다음 초고순도 질소로 건조시다. 6, 000 RPM에서 스핀 코팅을 사용하여 포토레지스트로 유리를 코팅하여 60초 동안 1.5 마이크로미터 두께를 달성하고 섭씨 100도를 60초 동안 굽습니다. 원하는 패턴을 달성하기 위해 광마스크 또는 마스크리스 리소그래피를 사용하여 샘플을 광원에 노출합니다.제조업체의 지침에 따라 증류수로 희석된 개발자에서 40초 동안 샘플을 개발합니다. 그런 다음 45초 동안 물에 씻고 UHP 질소 가스로 건조시다. 광학 현미경으로 패턴을 검사합니다.증착 시스템의 하중 잠금 챔버에 샘플을 삽입하고 기본 압력을 기다립니다. 메인 챔버에서 샘플을 전송하고 증착에 적합한 높이로 샘플을 설정합니다. 원하는 속도를 달성할 때까지 각 대상의 전력을 늘립니다.회전을 켜고 코발트, 철 및 팔라듐 대상을 각각 열고 닫아 강자다층을 증정합니다. 코발트 철 팔라듐 의 14 바이레이어를 입금하고 추가 팔라듐 캡핑 층으로 마무리. 증착이 완료되면 증착 시스템에서 샘플을 언로드합니다.샘플을 아세톤에 30분간 담그고 이소프로판올로 헹구세요. 그런 다음 UHP 질소로 건조하고 현미경으로 검사하십시오. 사용 전까지 깨끗하고 건조한 환경에서 보관하십시오.강자성 다층으로 증착된 100 마이크로미터 너비의 십자가 모양의 자기 바가 있는 유리 슬라이드를 사용하십시오. 양면 테이프를 사용하여 샘플을 홀더에 부착합니다. 와이어 본더를 사용하여 4개의 와이어를 샘플에 결합합니다.자기장이 시료에 수직이 되도록 자기장으로 운송 측정 시스템 내부의 샘플 홀더 및 샘플을 설정합니다. 텍스트 원고에 설명된 대로 횡방향 전압 측정을 수행합니다. 자기장을 쓸어내고 필드의 함수로서 횡전압을 측정합니다.횡방향 저항을 자기장의 함수로 플롯하여 필름의 수직 자화에 비례하는 비정상적인 홀 신호를 결정합니다. 텍스트 원고에 설명된 바와 같이 PC12 세포 배양을 위한 기본 성장 배지 및 분화 매체를 준비한다. 기본 성장 배지의 10 밀리리터와 비 처리 된 배양 플라스크에서 세포를 성장, 플라스크에 매 2 ~ 3 일마다 매체의 10 밀리리터를 추가.8 일 후 세포를 하위 배양. 세포 섭취의 경우 200G 및 실온에서 8분 동안 세포 현탁액을 원심분리한 다음 상퍼를 폐기하십시오. 신선한 기본 성장 매체의 세 밀리리터에서 세포를 다시 중단.5 분 동안 다시 세포를 원심 분리 한 다음 상체를 버리고 신선한 분화 배지의 세 밀리리터에서 세포를 다시 중단합니다. 세포 클러스터를 분해하기 위해 주사기와 바늘을 사용하여 세포를 10 번 흡인 한 다음 혈전계를 사용하여 세포를 계산하고 코팅되지 않은 일반 35 밀리미터 접시에 백만 개의 세포를 시드합니다. 원하는 MNP 농도를 달성하기 위해 MNP 서스펜션 및 분화 배지의 계산된 볼륨을 접시에 첨가한다.세포, MP 및 분화 매체를 혼합한 다음 5%의 이산화탄소 가습 인큐베이터에서 24시간 동안 37°C의 가습된 인큐베이터로 접시를 배양합니다. 패턴기판을 70%에탄올로 청소하고 후드에 35mm 배양 접시에 놓습니다. 패턴기판 아래에 큰 자석을 1분간 놓고 접시를 위아래로 움직여 자석을 후드밖으로 꺼내서 제거합니다.자외선을 15분간 켭니다. 콜라겐 코팅 유리 기판을 준비하려면 콜라겐 타입 1을 1 대 50 비율로 30%에 탄올로 희석시키도록 한다. 용액으로 유리를 덮습니다.모든 용액이 증발 할 때까지 4 시간 동안 후드에 발견 된 접시를 두고 멸균 PBS에서 세 번 세척하십시오. 인큐베이터에서 세포를 제거하고, 200 G에서 5 분 동안 세포 현탁액을 원심 분리하고 상퍼를 폐기하십시오. 신선한 분화 배지의 1 밀리리터에서 세포를 다시 중단하고 혈종계를 사용하여 세포를 계산합니다.35밀리미터 배양 접시에서 기판 꼭대기에 있는 5개의 세포에 종자 10 및 분화 배지의 2밀리리터를 추가하였다. 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소 가습기 인큐베이터로 배양합니다. 24 시간 후에, 세포에 1-100 신선한 뮤린 베타 NGF를 추가합니다.차별화 매체를 갱신하고 2일마다 신선한 베타-NGF를 추가합니다. 가벼운 현미경 검사를 사용하여 2 일마다 세포를 이미지하고 네트워크 형성 후 세포에 면역 염색을 수행합니다. 서로 다른 기하학적 모양을 가진 자기 플랫폼은 제작되었고 형광성 옥사이드 MP는 핵형성에 의해 합성되었다.MVP의 자기 측정은 자기화 곡선에 히스테리, 낮은 채도 필드 및 상대적으로 높은 자기 화 포화도가 없음을 보여줍니다. PC12 세포는 산화철 형광 MNPs와 혼합된 배지에서 배양되어 자기 단위로 변형시켰다. 의원은 세포의 종으로 내면화되었다, 하지만 핵에.세포 내부의 철 농도는 배지에서 MNP 농도가 증가함에 따라 증가하였다. MNP로드 PC12 세포의 생존가능성은 MNP의 상이한 농도를 위한 소알 분석을 이용한 MNP 로드 세포의 형태학적 파라미터를 비교하여 대조군 세포와 차이가 없음을 나타내며 평가하였다. XTT와 Resazurin 기반 분석제는 MVP의 평가 된 농도가 세포에 대한 상당한 세포 독성을 보여주지 않았다는 것을 확인했습니다.MNP 치료를 유한 하고 없는 PC12 세포가 자기 기판상에서 재배및 분화되었다. 자화 세포는 자기 패턴에 부착하고 패턴에 따라 가지를 성장하는 것으로 나타났으며 MNP 처리가없는 세포는 자기 장치에 대한 친화력없이 성장했습니다. 육각형 기하학을 가진 기판에 세포의 위치는 여기에서 도시된다.MNP 로드 된 세포 체의 75 %는 자기 줄무늬와 접촉한 반면, 자화되지 않은 세포의 35 %만이 줄무늬에 위치했다. 세포 포지셔닝 효과 외에도, 이러한 자기 플랫폼은 성장하는 중성염의 방향성을 제어하는 것으로 나타났다. 신경 성장 방향성에 대한 자기 효과를 평가하기 위해, 중성염과 자기 줄무늬 사이의 각도를 측정하여 자기 줄무늬의 방향과 상당한 상관 관계를 나타냈다.이 절차는 자기 나노 입자에 그들을 연상 한 후, 약물과 같은 활성 화합물을 지시하기 위해 쉽게 적응된다. 높은 처리량 약물 스크리닝 assays 또는 조직 내의 국소 치료로 번역될 수 있다. 이 새로운 접근 방식은 자기 매력적인 구조를 추가하여 다른 기판이나 장치를 기능화할 수 있는 새로운 가능성을 열어줍니다.현재, 우리는 향상된 생체 적합성 뉴런 칩 인터페이스를 개발하고 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 비디오에서 우리는 culturing의 뉴런에 microfluidic 장치를 farbricate을 사용 polydimethyl 실록산 (PDMS)과 소프트 리소그래피의 기술을 보여줍니다.

신경 소마와 Axons의 Compartmentalization위한 Microfluidic 장치의 제작

우리는 시험 관내 CNS 축삭 - glia의 상호 작용 연구를위한 새로운 다중 구획 신경 공동 문화 microsystem 플랫폼을 개발했습니다. 플랫폼은 병렬 여섯 독립적인 실험까지 실시 수 있으며, 새로 개발된 마이크로 / 매크로 하이브리드 제조 방법을 사용하여 가공했습니다.

다중 구획 CNS 뉴런 - glia 공동 문화 Microfluidic 플랫폼

이 비디오는 세포내이입(endocytosis)을 통해 신경 세포가 형광 자기 나노 입자(MNP)를 흡수하는 것을 보여줍니다. 자기 패턴의 기질에서 이러한 MNP 부하 뉴런을 성장시키면 세포가 부착될 수 있습니다. 배지를 포함하는 성장 인자의 추가는 뉴런 확장의 성장을 돕고, 기질의 자기장은 확장의 방향을 지시합니다.

자기 플랫폼에서 자기 나노 입자가 적재된 뉴런의 성장과 분화

이 비디오는 모듈러 뉴런 네트워크를 구축하기 위해 패턴화된 다중 전극 어레이(MEA)에서 뉴런 세포를 배양하는 과정을 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 신경 신호 전달 및 세포 상호 작용을 연구할 수 있습니다.

Constructing Patterned Neuronal Circuits on a Multi-Electrode Array

이 비디오는 시간에 따라 변하는 자기장을 사용하여 커버슬립의 패턴이 있는 원형 고리에서 성장한 신경 배양을 자극하는 방법을 보여줍니다.

자기장에 의한 패턴화된 신경 배양의 자극(Stimulation of patterned neuronal cultures by a magnetic field)

하나의 신경 세포의 미세 유체의으로 배열 및 생체 적합 물질 코팅의 칩 플라즈마 패턴 물 마스킹을위한 프로토콜을 설명합니다. 고도로 상호 공동 배양은 최소 셀 입력을 사용하여 제조 될 수있다.

단일 셀의 정밀도와의 연결을 공동 문화의 준비

이 원고는 공간적으로 제한, 기능적으로 상호 연결된 신경 회로로 구성된 체외 모듈 형 네트워크에서 성장하는 프로토콜을 설명합니다. 마스크는 폴리머 기판 위에 배양 세포 접착을 촉진하는 단백질 패턴 층을 사용한다. 도금 뉴런 코팅 분야 자발적인 연결을 설정 및 전기 생리 활성을 나타내는에서 성장.

설계, 치료, 세포 도금 및 기능적으로 간 연결 회로의 구성, 모듈 형 신경 네트워크의 배양 표면

이 원고는 마이크로 조직 공학 신경 네트워크의 제작에 대해 자세히 설명합니다. 3 차원 크기의 마이크론 크기의 구조물은 관 모양의 하이드로 겔에 둘러싸인 집적 된 신경 세포군에 걸친 길쭉한 정렬 축색관으로 구성됩니다. 이러한 살아있는 비계는 신경 회로를 재구성하거나 조절하기위한 기능적 중계 역할을하거나 회색 - 흰색 물질 신경 조직학을 모방 한 생물 여과 테스트 베드 (bifidelic test-bed) 역할을 할 수 있습니다.

신경 시스템 재구성, 변조 및 모델링을 위해 해부학 적으로 영감을받은 3 차원 미세 조직 공학 신경 회로망

이 프로토콜 문화 분류 기본 murine 뉴런을 플라스틱 칩의 사용을 설명 합니다. 이 칩은 소, 사용자 친화적인, 고해상도와 호환, 라이브, 그리고 형광 영상. 이 프로토콜에서는 이러한 칩 내 쥐 hippocampal 신경 격판덮개 유체 절연, axotomy 및 immunostaining을 수행 하는 방법을 설명 합니다.

Compartmentalizing 기본 Murine 뉴런에 대 한 조립된 플라스틱 미세 칩의 사용

이 프로토콜 신경 문화에 활동 전위 전송 공부에 대 한 미세 장치 microelectrode 배열 시험관에서 결합 하는 방법을 설명 하는 것을 목표로. 데이터 분석, 즉 탐지 및 전파 하는 활동 전위의 특성은 수행을 사용 하 여 새로운 고급, 아직 사용자 친화적이 고 자유롭게 사용할 수, 계산 도구.

Microelectrode 배열 마이크로 신경 통신 및 Axonal 신호 전파 공부에 대 한 인터페이스

마이크로미터 규모의 3D 프린팅을 통해 신경 세포 배양을 위한 고분자 장치의 신속한 프로토타이핑이 가능합니다. 원리 증명으로, 뉴런 사이의 구조적 연결은 신경돌기 성장에 영향을 미치는 장벽과 채널을 만들어 제한되었으며, 이러한 조작의 기능적 결과는 세포 외 전기 생리학에 의해 관찰되었습니다.

2광자 중합 마이크로 스케일 신경 세포 배양 장치의 3D 프린팅

학습하세요 자기 나노입자를 이용한 뉴런 세포 조직화 방법을 통해 마이크론 규모의 신경망 형성을 제어하는 기술입니다. 이 플랫폼은 생체접합 장치 연구에 활용됩니다.

상호 연결된 뉴런의 마이크론 규모의 조직을 위한 자기 플랫폼 제작

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