상호 연결된 뉴런의 마이크론 규모의 조직을 위한 자기 플랫폼 제작

우리의 접근 방식을 통해 자기 조작을 사용하여 신경망 형성을 제어할 수 있습니다. 이것은 네트워크의 체외 연구를위한 효과적인 도구이며 생체 계면 장치에 대한 새로운 치료 방향을 제공합니다. 이 기술을 통해 우리는 마이크로폰 스케일에서 세포의 위치와 성장을 모두 제어하여 자기 패턴과 네트워크 조직을 유연하게 설계할 수 있습니다.

효율적이고 독성이 없는 자기 나노입자 멸균이 중요합니다. 성공하려면 적절한 자기 나노 입자가 필요합니다. 중요한 특징은 크기, 코팅 및 상황 자화 값입니다.

절차를 시연하는 것은 내 실험실의 마스터 학생인 Reut Plen과 Dafna Levenberg가 될 것입니다. 먼저 스크리버 펜을 사용하여 유리 슬라이드를 2센티미터 로 잘라냅니다. 유리 슬라이드를 아세톤으로 청소한 다음 초음파 욕조에서 각각 5분 동안 이소프로파놀을 청소합니다.

그런 다음 초고순도 질소로 건조시다. 6, 000 RPM에서 스핀 코팅을 사용하여 포토레지스트로 유리를 코팅하여 60초 동안 1.5 마이크로미터 두께를 달성하고 섭씨 100도를 60초 동안 굽습니다. 원하는 패턴을 달성하기 위해 광마스크 또는 마스크리스 리소그래피를 사용하여 샘플을 광원에 노출합니다.

제조업체의 지침에 따라 증류수로 희석된 개발자에서 40초 동안 샘플을 개발합니다. 그런 다음 45초 동안 물에 씻고 UHP 질소 가스로 건조시다. 광학 현미경으로 패턴을 검사합니다.

증착 시스템의 하중 잠금 챔버에 샘플을 삽입하고 기본 압력을 기다립니다. 메인 챔버에서 샘플을 전송하고 증착에 적합한 높이로 샘플을 설정합니다. 원하는 속도를 달성할 때까지 각 대상의 전력을 늘립니다.

회전을 켜고 코발트, 철 및 팔라듐 대상을 각각 열고 닫아 강자다층을 증정합니다. 코발트 철 팔라듐 의 14 바이레이어를 입금하고 추가 팔라듐 캡핑 층으로 마무리. 증착이 완료되면 증착 시스템에서 샘플을 언로드합니다.

샘플을 아세톤에 30분간 담그고 이소프로판올로 헹구세요. 그런 다음 UHP 질소로 건조하고 현미경으로 검사하십시오. 사용 전까지 깨끗하고 건조한 환경에서 보관하십시오.

강자성 다층으로 증착된 100 마이크로미터 너비의 십자가 모양의 자기 바가 있는 유리 슬라이드를 사용하십시오. 양면 테이프를 사용하여 샘플을 홀더에 부착합니다. 와이어 본더를 사용하여 4개의 와이어를 샘플에 결합합니다.

자기장이 시료에 수직이 되도록 자기장으로 운송 측정 시스템 내부의 샘플 홀더 및 샘플을 설정합니다. 텍스트 원고에 설명된 대로 횡방향 전압 측정을 수행합니다. 자기장을 쓸어내고 필드의 함수로서 횡전압을 측정합니다.

횡방향 저항을 자기장의 함수로 플롯하여 필름의 수직 자화에 비례하는 비정상적인 홀 신호를 결정합니다. 텍스트 원고에 설명된 바와 같이 PC12 세포 배양을 위한 기본 성장 배지 및 분화 매체를 준비한다. 기본 성장 배지의 10 밀리리터와 비 처리 된 배양 플라스크에서 세포를 성장, 플라스크에 매 2 ~ 3 일마다 매체의 10 밀리리터를 추가.

8 일 후 세포를 하위 배양. 세포 섭취의 경우 200G 및 실온에서 8분 동안 세포 현탁액을 원심분리한 다음 상퍼를 폐기하십시오. 신선한 기본 성장 매체의 세 밀리리터에서 세포를 다시 중단.

5 분 동안 다시 세포를 원심 분리 한 다음 상체를 버리고 신선한 분화 배지의 세 밀리리터에서 세포를 다시 중단합니다. 세포 클러스터를 분해하기 위해 주사기와 바늘을 사용하여 세포를 10 번 흡인 한 다음 혈전계를 사용하여 세포를 계산하고 코팅되지 않은 일반 35 밀리미터 접시에 백만 개의 세포를 시드합니다. 원하는 MNP 농도를 달성하기 위해 MNP 서스펜션 및 분화 배지의 계산된 볼륨을 접시에 첨가한다.

세포, MP 및 분화 매체를 혼합한 다음 5%의 이산화탄소 가습 인큐베이터에서 24시간 동안 37°C의 가습된 인큐베이터로 접시를 배양합니다. 패턴기판을 70%에탄올로 청소하고 후드에 35mm 배양 접시에 놓습니다. 패턴기판 아래에 큰 자석을 1분간 놓고 접시를 위아래로 움직여 자석을 후드밖으로 꺼내서 제거합니다.

자외선을 15분간 켭니다. 콜라겐 코팅 유리 기판을 준비하려면 콜라겐 타입 1을 1 대 50 비율로 30%에 탄올로 희석시키도록 한다. 용액으로 유리를 덮습니다.

모든 용액이 증발 할 때까지 4 시간 동안 후드에 발견 된 접시를 두고 멸균 PBS에서 세 번 세척하십시오. 인큐베이터에서 세포를 제거하고, 200 G에서 5 분 동안 세포 현탁액을 원심 분리하고 상퍼를 폐기하십시오. 신선한 분화 배지의 1 밀리리터에서 세포를 다시 중단하고 혈종계를 사용하여 세포를 계산합니다.

35밀리미터 배양 접시에서 기판 꼭대기에 있는 5개의 세포에 종자 10 및 분화 배지의 2밀리리터를 추가하였다. 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소 가습기 인큐베이터로 배양합니다. 24 시간 후에, 세포에 1-100 신선한 뮤린 베타 NGF를 추가합니다.

차별화 매체를 갱신하고 2일마다 신선한 베타-NGF를 추가합니다. 가벼운 현미경 검사를 사용하여 2 일마다 세포를 이미지하고 네트워크 형성 후 세포에 면역 염색을 수행합니다. 서로 다른 기하학적 모양을 가진 자기 플랫폼은 제작되었고 형광성 옥사이드 MP는 핵형성에 의해 합성되었다.

MVP의 자기 측정은 자기화 곡선에 히스테리, 낮은 채도 필드 및 상대적으로 높은 자기 화 포화도가 없음을 보여줍니다. PC12 세포는 산화철 형광 MNPs와 혼합된 배지에서 배양되어 자기 단위로 변형시켰다. 의원은 세포의 종으로 내면화되었다, 하지만 핵에.

세포 내부의 철 농도는 배지에서 MNP 농도가 증가함에 따라 증가하였다. MNP로드 PC12 세포의 생존가능성은 MNP의 상이한 농도를 위한 소알 분석을 이용한 MNP 로드 세포의 형태학적 파라미터를 비교하여 대조군 세포와 차이가 없음을 나타내며 평가하였다. XTT와 Resazurin 기반 분석제는 MVP의 평가 된 농도가 세포에 대한 상당한 세포 독성을 보여주지 않았다는 것을 확인했습니다.

MNP 치료를 유한 하고 없는 PC12 세포가 자기 기판상에서 재배및 분화되었다. 자화 세포는 자기 패턴에 부착하고 패턴에 따라 가지를 성장하는 것으로 나타났으며 MNP 처리가없는 세포는 자기 장치에 대한 친화력없이 성장했습니다. 육각형 기하학을 가진 기판에 세포의 위치는 여기에서 도시된다.

MNP 로드 된 세포 체의 75 %는 자기 줄무늬와 접촉한 반면, 자화되지 않은 세포의 35 %만이 줄무늬에 위치했다. 세포 포지셔닝 효과 외에도, 이러한 자기 플랫폼은 성장하는 중성염의 방향성을 제어하는 것으로 나타났다. 신경 성장 방향성에 대한 자기 효과를 평가하기 위해, 중성염과 자기 줄무늬 사이의 각도를 측정하여 자기 줄무늬의 방향과 상당한 상관 관계를 나타냈다.

이 절차는 자기 나노 입자에 그들을 연상 한 후, 약물과 같은 활성 화합물을 지시하기 위해 쉽게 적응된다. 높은 처리량 약물 스크리닝 assays 또는 조직 내의 국소 치료로 번역될 수 있다. 이 새로운 접근 방식은 자기 매력적인 구조를 추가하여 다른 기판이나 장치를 기능화할 수 있는 새로운 가능성을 열어줍니다.

현재, 우리는 향상된 생체 적합성 뉴런 칩 인터페이스를 개발하고 있습니다.