Name: 베이커효모사카로미세스 세레비시아에 미토콘드리아 게놈 발현 제품의 라벨링 및 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: 배우세요 베이커효모 Saccharomyces cerevisiae의 미토콘드리아 게놈에서 발현되는 8개 폴리펩타이드를 방사성 표지와 겔 전기영동을 통해 라벨링하고 시각화하는 방법을. 이 프로토콜은 미토콘드리아 단백질 생합성 연구에 필수적인 기술입니다.

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이 연구는 기본 연구를위한 러시아 재단에 의해 투자되었다, 부여 번호 18-29-07002. P.K.는 러시아 연방 과학기술고등교육부의 국가 배정에 의해 지원되었으며, AAAA-A16-11602160073-5를 지원받았다. M.V.P.는 러시아 연방 과학 고등 교육부의 지원을 받았으며, 교부번호 075-15-2019-1659(게놈 연구 의 쿠르차토프 센터 프로그램)를 지원받았습니다. 이 작업은 부분적으로 모스크바 주립 대학 개발 프로그램의 프레임에서 구입 한 장비에 수행되었다. I.C., S.L., M.V..B.는 모스크바 주립 대학 교부금 "노아의 방주를 선도하는"에 의해 추가로 지원되었다.

1. 효모 문화 준비
<ol><li>냉동 재고 배양에서 적절한 매체로 신선한 접시에 효모를 줄입니다. 24-48h에 대한 30 °C에서 배양 인큐베이터에 플레이트를 넣습니다. 참고: 온도에 민감한 돌연변이가 허용 온도에서 자랄 수 있도록 합니다.</li>
	<li>YPGal 배지 2mL(펩톤 2%, 효모 추출물 1%, 갈모 추출물 2%)에서 효모 배양을 접종하여 15mL 튜브의 신선한 줄무늬에서 30°C에서 200rpm에서 밤새 교반하는 배양합니다.</li>
	<li>600nm(OD600)의파장에서 배양의 광학 밀도를 측정한다.</li>
	<li>멸균 튜브에 0.2 흡광도 단위에 대응하는 부피를 취하고, 실온에서 30 초 동안 9,000 x g의 펠릿 효모 세포를 복용하고 상복부을 폐기하십시오.</li>
	<li>5 s에 대 한 소용돌이하 여 멸 균 수의 0.5 mL로 셀을 세척. 펠릿 효모 세포는 실온에서 30 초 동안 9,000 x g에서 슈퍼 나탄을 폐기합니다. 신선한 YPGal 배지의 2 mL에 세포를 희석.</li>
	<li>OD 600이 1.5-1.9 값에 도달할 때까지200 rpm 및 30°C에서 교반하는 배양. 참고: 효모 성장률은 다양하므로 기다릴 준비를 하십시오. 이른 아침에 1.3-1.6 단계를 하는 것이 합리적입니다. 그것은 일반적으로 4-5 시간이 걸리지만 더 오래 걸릴 수 있습니다.</li>
</ol>2. 방사성 동위 원소 통합
<ol><li>마이크로센심분리기 튜브에서 하나의 광학 장치에 해당하는 배양 량을 전송합니다. 튜브를 3,000 x g에서 1분 동안 회전시키고 상체를 폐기합니다. 5 초 동안 소용돌이로 멸균 수의 0.5 mL로 씻어.<ol>
<li>펠릿 효모 세포는 실온에서 30 초 동안 9,000 x g에서 슈퍼 나탄을 폐기합니다. 멸균 변환 버퍼의 0.5 mL에서 효모 세포를 재일시 중단합니다. 서스펜션을 15mL 튜브에 놓습니다. 참고: 번역 버퍼는 pH 6.0을 함유한 2% 갈라토세(w/v) 및 50mM 칼륨 인산염을 함유하는 솔루션입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>0.2 mg/mL의 최종 농도까지 세포 현탁액에 사이클로헨시미드를 추가하십시오. 세포 변환을 억제하기 위해 200 rpm 및 30 °C에서 5 분 교반하는 동안 배양하십시오. 참고: 사이클로헤시미드 용액(20 mg/mL, 에탄올)은 실험 전에 신선하게 준비해야 한다. 클로람페니콜은 동일한 농도7에서애니소마이신으로 성공적으로 대체될 수 있다.</li>
	<li>세포 현탁액에 35S-메티오닌의 25-30 μCi를 추가하고 200 rpm 및 30 °C에서 30 분 교반하는 동안 배양하십시오. 참고: 35S-메티오닌과 35S-시스테인의 혼합물도 사용할 수 있습니다. 퓨어 35S-메티오닌은 가장 강력한 신호와 최고의 신호 대 잡음 비율을 초래합니다. 일반적으로 메티오닌은 미토콘드리아 단백질에서 이 아미노산의 함량이 높기 때문에 시스테인보다 더 효과적입니다. 그러나, 35S-메티오닌과 시스테인의 EasyTag 혼합물은 저렴하고 비교 결과를 제공합니다7. 주의: 35S-메티오닌은 방사성입니다. 방사성 물질 취급에 대한 일반적인 안전 관행을 따르십시오. 참고: 방사능의 통합이 시간이 지남에 따라 총 신호가 평준화되는 한계에 도달하는 것으로 잘 알려져 있습니다. 이 제한에 도달하면 다른 번역 제품이 합성되는 속도를 결정하는 것은 거의 불가능합니다. 미토콘드리아 번역의 속도를 분석하기 위해, 선형 방식으로 35S-메티오닌을 가진 잠복의 시간에 따라 신호 강도가 증가하는 조건에 필수적이다. 일반적인 실험실 야생 형 균주의 경우 신호는 이미 30 분보다 훨씬 짧은 잠복 시간에 대해 포화상태입니다. 번역 돌연변이는 매우 다르게 행동할 수 있습니다. 시간 과정은 방사능 통합의 운동학을 확립하고 따라서 번역의 비율을 확립하기 위해 수행되어야한다, 적어도 새로운 변형으로 작업 할 때. 이를 위해 몇 분 간격으로 샘플을 채취하는 것이 좋습니다(예: 2.5, 5.0, 7,5, 10 및 20분).</li>
	<li>라벨이 부착되지 않은 "콜드" 메티오닌(최종 농도는 20mMM이어야 한다)과 푸오마이신(최종 농도는 1-10 μg/mL이어야 한다)을 추가하여 라벨링을 중지합니다. 200 rpm 및 30 °C에서 10 분 교반하십시오. 참고: 이 단계는 리보솜에게 펩티드 변환을 완료할 시간을 제공하는 데 매우 중요합니다. 그렇지 않으면, 전체 길이보다 짧은 모든 폴리펩타이드는 다른 크기로 검출될 것이다. 미토콘드리아 번역 제품의 안정성을 결정하기 위해 이 단계에서 타임코스 실험(pulse-chase)을 수행할 수 있다. 이를 위해 30분 간격으로 시료를 채취하여 배양을 계속한다(예를 들어, 30분, 60, 90 분 및 120분).</li>
</ol>3. 효모 세포 리시스 및 단백질 추출
<ol><li>30 s에 대 한 9,000 x g에서 원심 분리에 의해 효 모 세포를 수집 합니다. 5 s에 대 한 소용돌이하 여 멸 균 수의 0.5 mL로 세포를 씻어. 펠릿 효모 세포는 실온에서 30 s에 대한 9,000 x g에서. 상부체를 폐기합니다. 메모. 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 샘플을 -20°C에 저장합니다.</li>
	<li>5-10s의 펠릿과 소용돌이에 75 μL의 용해 버퍼를 넣습니다. 참고: 리시스 버퍼는 1.8 M NaOH, 1M β-메카토에탄올, 1mM PMSF의 물이다. 단백질의 알칼리성 가수분해로 이어지는 리시스 버퍼로 과도한 배양을 피하십시오. 즉시 3.3 단계로 진행합니다.</li>
	<li>pH 6.8로 0.5M Tris-HCl 버퍼500 μL을 추가합니다. 소용돌이가 짧게.</li>
</ol>4. 단백질의 강수량
주의: 메탄올과 클로로폼은 유기 용매입니다. 유기 물질 취급을 위한 일반적인 안전 관행을 따르십시오.
<ol><li>샘플에 메탄올 600 μL을 추가합니다. 5 s에 대한 소용돌이.</li>
	<li>샘플에 150 μL의 클로로폼을 추가합니다. 5 s에 대한 소용돌이.</li>
	<li>원심 분리는 12,000 x g에서 2 분 동안 샘플을 원심 분리합니다. 조심스럽게 샘플러와 상위를 폐기.</li>
	<li>샘플에 메탄올 600 μL을 추가합니다. 튜브를 여러 번 반전시켜 조심스럽게 섞는다.</li>
	<li>원심 분리는 12,000 x g에서 2 분 동안 샘플을 원심 분리합니다. 상부체를 폐기합니다.</li>
	<li>80 °C에서 2 분 동안 펠릿을 공기 건조시십시오. 참고: 모든 액체가 증발해야 합니다. 펠릿이 불충분하게 건조된 경우 젤에 단백질의 비정상적인 분리가 있을 위험이 있다. 그러나 펠릿을 과도하게 건조시킬 수 없으므로 4°C에서 하룻밤 동안 보관할 수도 있습니다.</li>
	<li>침전된 단백질을 1x Laemmli 시료 버퍼의 60 μL에 녹입니다.</li>
	<li>40 °C에서 10 분 동안 가열하십시오. 참고: 95°C에서 시료를 끓이는 것은 집계를 유발하기 때문입니다. 골재가 여전히 형성되면 샘플을 12,000 x g에서 2분 동안 회전하고 상체를 수집합니다. 샘플은 -20°C에서 저장할 수 있습니다. 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.</li>
</ol>5. SDS 페이지
<ol><li>17.5% Laemmli SDS-폴리아크라이엘라미드 젤을 캐스팅합니다. 참고: 6M 우레아는 더 나은 atp8 및 atp9를 해결하기 위해 젤에 첨가될 수 있다. 그라데이션 15%-20% 젤도 더 나은 해상도를 제공할 수 있습니다.</li>
	<li>주머니에 각 샘플의 15 μL (40-50 μg)를적재합니다. 참고: OD600 값이 1.6단계에서 근접했다면 단백질 농도를 측정할 필요가 없습니다. 그렇지 않은 경우, 세제 호환 시약과 분석체를 사용하여 단백질 농도를 측정합니다.</li>
	<li>파란색 염료가 젤 길이의 약 65%에 도달할 때까지 차가운 방에서 젤을 실행합니다. 참고: 사용된 시스템(예: Protean II xi cell)의 경우, 우리는 두 가지 모드 중 하나를 사용합니다: 5 V/cm에서 16-17 h 또는 15 V/cm에서 5h. 브로모페놀 블루 염료보다 더 빨리 단백질이 실행되지 않지만, 긴 실행은 atp8 및 atp9 신호의 흐림을 초래할 수 있습니다.</li>
	<li>쿠마시 블루와 젤을 염색하고 로딩 컨트롤로 필요한 스캔이나 사진을 만듭니다. 참고: 로딩 제어를 만드는 또 다른 방법은 미토콘드리아 "하우스 키핑" 유전자, 예를 들어, 포린 1에 대한 항체를 면역로하는 것이다.</li>
</ol>6. 사학 사진
<ol><li>젤 건조기에서 젤을 건조시십시오. 3-5 일 동안 저장 인광판 화면으로 카세트에 보관하십시오. 참고: 말린 젤을 선별하는 대안은 전기 블로팅을 통해 니트로셀룰로오스 막으로 단백질을 전달하여 그 이후에 이를 선별하는 것입니다. 그것은 강한 신호와 선명한 밴드를 초래한다.</li>
	<li>인산화기의 화면을 스캔합니다. 참고: 인광 화상 진찰에 대한 대안으로, 엑스레이 필름은 또한 신호를 드러내기 위하여 이용될 수 있습니다.</li>
</ol>

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</ol>

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유전자 발현의 조사는 현대 생명 과학에 있는 중앙 부분을 차지합니다. 이 복잡한 프로세스에 대한 통찰력을 제공하는 수많은 방법이 개발되었습니다. 여기서, 우리는 베이커의 효모 S. cerevisiae 미토콘드리아에서 단백질 생합성에 접근하는 것을 허용하는 방법을 설명했습니다. 그것은 일반적으로 연구된 돌연변이의 결과에 접근하기 위하여 돌연변이 효모 긴장대 미토콘드리아에 있는 mRNAs의 번역 효율성을 비교하기 위하여 이용됩니다. 이것은 미토콘드리아8,11,12,13에영향을 미칠 것을 건의한 돌연변이를 가진 효모 세포의 미토콘드리아 기능을 연구할 때 연구원이 수행하는 기본적인 실험의 한개이다. 그것은 수시로 산소 소비 비율 및 미토콘드리아 막 잠재력의 측정과 결합됩니다. 그러나, 제공하는...

미토콘드리아는 진핵 세포의 대사에 깊이 관여하는 세포기관입니다. 그들의 전자 전송 사슬은 여러 생화학 경로에 사용되는 주요 에너지 통화 인 ATP로 세포를 공급합니다. 게다가, 그들은 석 면에 관여, 지방산과 헴 합성, 그리고 다른 프로세스. 미토콘드리아의 기능 장애는 인간 질환 1의 잘 알려진소스이다. 그것은 세포기관2의구조 또는 조절 성분을 코딩하는 핵 또는 미토콘드리아 유전자에 있는 돌연변이에서 유래할 수 있습니다. 베이커의 효모 사카로미세스 세레비시아는 여러 가지 이유로 미토콘드리아 유전자 발현을 연구하는 우수한 모델 유기체입니다. 첫째, 그들의 게놈은 완전히 시퀀스3,잘 음부, 데이터의 큰 합계는 이 유기체로 실행된 조사의 긴 역사 덕분에 문학에서 이미 유효합니다. 둘째, 핵 게놈을 가진 조작은 그들의 빠른 성장 속도와 고도로 효율적인 상동성 재조합 시스템 때문에 상대적으로 빠르고 쉽습니다. 셋째, 제빵사의 효모 S. cerevisiae는 미토콘드리아 게놈으로 조작이 개발되는 몇 안되는 유기체 중 하나입니다. 마지막으로, 제빵사의 효모는 발효 탄소 공급원을 함유하는 미디어에서 성장할 수 있기 때문에 호흡기 결함이 있는 돌연변이를 격리하고 연구할 수 있는 에어로브-혐기성 자극 유기체입니다.
우리는 번역 수준4에서제빵사 효모 S. cerevisiae의 미토콘드리아 유전자 발현을 연구하는 방법을 설명합니다. 그것의 주요 원칙은 여러 관찰에서 온다. 첫째, 효모 미토콘드리아 게놈은 8개의 단백질만 인코딩합니다: 시토크롬 c 산화제의 3개의 서브유닛(Cox1p, Cox2p, 및 Cox3p), ATP synthase의 3개의 하위 단위(Atp6p, Atp8p 및 Atp9p), 유비퀴놀-시토크롬 c 옥시도레덕타제 효소, 사이토크롬 b(Cytb), 및 미토콘드리아 리보소말 단백질 Var1p5의서브유닛. 이 숫자는 작고, 그들 모두는 적절한 조건에서 단일 젤에 전기 전광에 의해 분리 될 수있다. 둘째, 미토콘드리아 리보솜은 진핵6이아닌 원핵계 클래스에 속하며, 따라서 항생제에 대한 민감성은 효모 세포질 및 미토콘드리아 리보좀에 대해 다릅니다. 그것은 세포혈증 번역의 억제를 허용, 라벨 아미노산(35S-메티오닌)가 미토콘드리아 번역 제품에만 통합 될 때 조건을 제공. 그 결과, 이 실험은 미토콘드리아 단백질합성 드 노보에 아미노산 의 혼입 속도에 대한 정보를 제공하여 8개 제품에 대한 미토콘드리아 번역의 전반적인 효율을 반영합니다.

<table><tbody><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>시그마-알드리치</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>아크릴아미드</td><td>시그마-알드리치</td><td>A9099</td><td></td></tr><tr><td>과황산암모늄</td><td>시그마-알드리치</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>세균학 한천</td><td>시그마-알드리치</td><td>A5306&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>바이오웨이브 세포 밀도계 CO8000</td><td>BIOCHROM US BE</td><td>80-3000-45</td><td></td></tr><tr><td>브랜드 표준 일회용 큐벳</td><td>시그마-알드리치</td><td>Z330361</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>시그마-알드리치</td><td>288306&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>시클로헥시미드</td><td>시그마-알드리치</td><td>C1988&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-갈락토스</td><td>시그마-알드리치</td><td>G5388&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-포도</td>당 <td>시그마-알드리치</td><td>G7021&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>디지털 블록 히터</td><td>Thermo Scientific</td><td>88870001</td><td></td></tr><tr><td>EasyTag L-[35S]-메티오닌, 500&micro; Ci (18.5MBq), 안정화된 수용액</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG709A500UC</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5425</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-864-457</td><td></td></tr><tr><td>GE 저장 인광 스크린</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE29-0171-33</td><td></td></tr><tr><td>L-메티오닌</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9625&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>시그마-알드리치</td><td>34860&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-Tetramethylethylenediamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>N,N&prime;-메틸렌비스아크릴아미드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7279</td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>고기에서 추출한 펩톤, 세균학</td><td>Millipore</td><td>91249&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>페닐 메탄 설포닐 플루오라이드</td><td>시그마-알드리치</td><td>P7626&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 660nm 단백질 분석 키트</td><td>Thermo Scientific</td><td>22662</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac 기본 전원 공급 장치</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>Protean II xi cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1651802</td><td></td></tr><tr><td>Streptomyces alboniger의 Puromycin dihydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>Storm 865 인광 이미저</td><td>GE 헬스케어</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trizma 베이스</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93352&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>진공 가열 젤 건조기</td><td>클리버 사이버, 과학</td>적인 <td>CSL-GDVH</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>시그마-알드리치</td><td>Y1625&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

베이커효모사카로미세스 세레비시아에 미토콘드리아 게놈 발현 제품의 라벨링 및 시각화

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

미토콘드리아는 호기성 호흡이 가능한 진핵세포의 필수 세포입니다. 그(것)들은 원형 게놈 및 유전자 발현 장치를 포함합니다. 제빵사의 효모의 미토콘드리아 게놈은 8가지 단백질을 인코딩합니다: 시토크롬 c 산화제의 3개의 서브유닛(Cox1p, Cox2p, 및 Cox3p), ATP synthase의 3개의 하위 단위(Atp6p, Atp8p 및 Atp9p), 유비퀴놀-시토크롬 c 옥시도레덕타제 효소, 사이토크롬 b(Cytb), 및 미토콘드리아 리보소말 단백질 Var1p의 서브유닛. 여기서 설명된 방법의 목적은 이러한 단백질을 35S메티오닌으로 구체적으로 라벨링하고, 전기포고에 의해 분리하고 신호를 화면에 이산밴드로 시각화하는 것이다. 절차는 몇 가지 단계를 포함한다. 첫째, 효모 세포는 후기 로와산성장 단계에 도달할 때까지 갈라토스 함유 배지에서 배양된다. 다음으로, 사이클로헤시미드 치료는 세포질 번역을 차단하고 미토콘드리아 번역 제품에만 35S 메티오닌을 통합할 수 있습니다. 그런 다음, 모든 단백질은 효모 세포에서 추출되고 폴리 아크릴라미드 젤 전기 포광에 의해 분리됩니다. 마지막으로, 젤은 저장 인광판으로 건조되고 배양됩니다. 화면은 밴드를 드러내는 인산화기에서 스캔됩니다. 이 방법은 미토콘드리아 유전자 발현 결함을 연구하는 데 유용한 야생형대 돌연변이 효모 균주의 미토콘드리아내 단일 폴리펩타이드의 생합성 율을 비교하기 위해 적용될 수 있다. 이 프로토콜은 모든 효모 미토콘드리아 mRNAs의 번역 속도에 대한 귀중한 정보를 제공합니다. 그러나 적절한 결론을 내리기 위해서는 여러 가지 제어 및 추가 실험이 필요합니다.

전술한 프로토콜에 따라, 우리는 두 가지 S. 세레비시아균에서 미토콘드리아 번역 제품을 할당: 야생 형(WT)및 AIM23 유전자의 돌연변이 베어링 삭제(AIM23Δ),인코딩 미토콘드리아 번역 개시 인자 3(표 1)8. 미토콘드리아 번역 제품은 SDS-PAAG9에서 방사성 라벨을 부착하고 분리시켰다. 샘플은 포화 전에 2.5 분마다 수집하여 시간 과정(그림 1A)을구축했습니다. 젤은 5일박람회(도 1A)를거쳐 염색, 건조, 스크리닝하였다.
성공적인 실험의 경우, 그림은 표준 패턴4에따라 할당된 8개의 밴드를 보여줍니다. 그러나, 개별 밴드의 강도는 변형 및 실험 조건에 따라 매우 가변적일 수 있다...

베이커의 효모 미토콘드리아 게놈은 8개의 폴리펩티드를 인코딩합니다. 현재 프로토콜의 목표는 모든 프로토콜에 레이블을 지정한 다음 별도의 대역으로 시각화하는 것입니다.

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

미토콘드리아는 호기성 호흡을 할 수 있는 진핵세포의 필수 세포입니다. 그들의 기능 장애는 인간 질병의 잘 알려진 소스. 베이커의 효모 미토콘드리아는 8개의 단백질을 인코딩하는 원형 게놈을 포함합니다.본 비디오에서는, 우리는 번역 제품의 방사성 라벨링 및 겔 전기포고에 의한 후속 분리를 통해 효모 미토콘드리아에서 단백질 생합성을 분석하는 데 사용되는 프로토콜을 설명했습니다. 절차에는 몇 가지 주요 단계가 포함됩니다. 적절한 매체와 신선한 접시에 냉동 재고 문화에서 효모를 줄입니다.24~48시간 동안 배양인을 30도에서 30도로 넣습니다. 15 밀리리터 튜브에서 신선한 줄무늬에서 매체의 두 밀리리터에 이러한 문화를 접종하고 30도에서 200 RPM에서 하룻밤 교반을 배양. 600 나노미터의 파장에서 배양의 광학 밀도를 측정합니다.실온에서 30초 동안 9, 000G에서 멸균 튜브 팔레트 효모 셀에서 0.2 흡수장치에 해당하는 부피를 복용하십시오. 이 상체를 폐기하십시오. 5 초 동안 소용돌이를 통해 멸균 수의 0.5 밀리리터로 세포를 씻으시면.실온에서 30초 동안 9, 000 G의 Pallette 효모 세포. 상부체를 폐기합니다. 신선한 닦아 한천 매체의 두 밀리리터에 세포를 희석.광학 밀도가 1.5에서 1.9값으로 1.5에서 1.9로 도달할 때까지 200 RPM 및 30도에서 가져온 인큐베이션 엣지. 마이크로 원심분리기 튜브의 하나의 광학 장치에 해당하는 배양 량을 전송합니다. 튜브를 3000 G에서 1분 동안 회전시합니다.상부체를 폐기합니다. 5 초 동안 소용돌이를 통해 멸균 수의 0.5 밀리리터로 세포를 씻으시면. 실온에서 30초 동안 9, 000 G의 Pallette 효모 세포는 상피셀을 폐기합니다.멸균 번역 버퍼의 0.5 밀리리터에서 효모 세포를 다시 중단합니다. 서스펜션을 15 밀리리터 튜브에 놓습니다. 세포 현탁액에 사이클로헨시미드를 200 RPM 및 30도에서 5분 동안 밀리리터 인큐베이터당 0.2 밀리그램의 최종 농도까지 세포 현탁액에 추가하여 세포 변환을 억제합니다.S35 메티오닌의 S35 메티오닌의 25 ~30 마이크로큐리에서 25 ~ 30 마이크로큐리를 세포 현탁액에 넣고 200 RPM 및 30도에서 30분 동안 에큐베이트합니다. 라벨이 부착되지 않은 차가운 메티오닌과 보리미신을 추가하여 200 RPM과 30도에서 10분 동안 라벨이 붙는 인큐베이터를 중지합니다. 30초 동안 9, 000G에서 원심분리로 효모 세포를 수집합니다.5 초 동안 소용돌이를 통해 멸균 수의 0.5 밀리리터로 세포를 씻으시면. 실온에서 30초 동안 9, 000 G의 Pallette 효모 세포. 상부체를 폐기합니다.팔레트와 소용돌이에 75 마이크로리터의 용액 을 5~10초 간 추가합니다. pH 6.8로 0.5 어어 트리버퍼의 500 마이크로리터를 추가합니다. pH 6.8.소용돌이가 짧게. 샘플에 메탄올 600 마이크로리터를 추가합니다. 5 초 동안 소용돌이.샘플에 150 마이크로리터의 클로로폼을 추가합니다. 5 초 동안 소용돌이. 12, 000 G.에서 2 분 동안 샘플을 원심 분리하여 샘플러로 오파페이스를 조심스럽게 폐기하십시오.샘플에 메탄올 600 마이크로리터를 추가합니다. 튜브를 여러 번 반전시켜 조심스럽게 섞는다. 원심분리기 샘플은 12, 000 G.에서 2분 동안 시료를 폐기합니다.80도에서 2분간 파렛을 공기가 건조시다. Laemmli 샘플 버퍼의 60 마이크로 리터에 침전 된 단백질을 녹입니다. 샘플을 14도에서 10분간 가열합니다.17.5%의 Laemmli SDS 폴리아크라이글라미드 젤을 생성합니다. 주머니에 각 샘플의 15 마이크로 리터를로드합니다. 파란 염료가 젤 림프의 약 65 %에 도달 할 때까지 차가운 방에서 젤을 실행합니다.구마티 스티글 블루로 젤을 염색하고 로딩 컨트롤에 필요한 스캔이나 사진을 만듭니다. 젤 건조기에서 젤을 건조시십시오. 3~5일 동안 보관 형인 스크린으로 카세트에 보관하십시오.인광 선상에서 화면을 스캔합니다. 위에서 설명한 프로토콜에 따라, 우리는 두 개의 사카로미세스 세레비시아균에서 미토콘드리아 번역 제품을 할당했습니다. 미토콘드리아 번역 개시 인자 3을 인코딩하는 Aim23 유전자의 야생 유형 및 돌연변이 변이체 삭제.미토콘드리아 번역 제품은 이미 폴리아크릴아미드 겔에서 적극적으로 표지되고 분리되었다. 샘플은 채도 가 되기 전에 2분 반마다 수집되어 시간 과정을 구축했습니다. 젤은 5일 박람회 후 염색, 건조 및 스크리닝되었다.성공적인 실험의 경우, 그림은 표준 패턴에 따라 할당 된 8 개의 밴드를 보여줍니다. 그러나, 개별 밴드의 강도는 변형 및 실험 조건에 따라 매우 가변적일 수 있다. 각 밴드는 하나의 번역 제품에 해당합니다.데이터는 야생 모형에 나타나는 모든 제품이 이 돌연변이에서 보이기 때문에 돌연변이 균주가 미토콘드리아 단백질 합성이 가능하다는 것을 건의합니다. 그러나, 밴드의 강도는 야생 유형과 다르며, 이는 Aim23의 이러한 삭제가 미토콘드리아 유전자 발현에 영향을 미친다는 것을 의미합니다. 쿠마시 블루 얼룩으로 양조하였고 로딩 컨트롤역할을 합니다.이미지 G 또는 Image Quan 소프트웨어를 사용하여 균주 또는 실험 조건 간의 차이점을 식별하기 위해 데이터를 정량화할 수 있습니다. 이를 위해, 모든 제품에 대응하는 신호의 비율은 총 신호로 계산된다. 평균 값 및 표준 편차는 적어도 세 번의 독립적인 실험에서 계산됩니다.인계된 합성 단백질의 운동학은 지난 해의 실험에서 연구됩니다. 샘플은 차가운 메티오닌과 보리마이신에 의해 라벨링 반응이 중단된 후 표시된 시점에서 수집됩니다. 이 제어는 제품의 안정성을 추정하기 위해 필요합니다.항 포린 을 가진 면역 염색은 1개의 항체를 가진 로딩 통제입니다. 우리는 효모 미토콘드리아에서 단백질 생합성을 연구하는 데 자주 사용되는 방법을 설명했습니다. 이 프로토콜은 비교적 간단하고 빠르게 수행할 수 있습니다.동시에, 매우 유리한 4 개의 효모 미토콘드리아 mRNAs의 번역 속도에 대한 귀중한 정보를 얻을 수 있습니다. 그러나, 그것은 추가 실험을 필요로 하는 몇 가지 제한이 있으며 단백질과 mRNA의이 주간 수준에 거짓말. 미토콘드리아 번역 시스템에서 이러한 기능에 대한 정보를 제공할 수 있지만 메커니즘을 발견하기 위해 보다 진보된 기술을 사용해야 합니다.

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연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

GFP - 퓨전 단백질은 널리 공촛점 현미경에 의해 organelles을 시각화하는 데 사용됩니다. 그러나, organelles의 형태에 영향을 변이에 대한 검사는 일반적으로 개별적인 돌연변이 유발이 필요하며 시간이 소요됩니다. 여기, 우리는 동시에 효모 거의 5000이 아닌 필수적인 유전자에 organelle - GFP 표식을 통합하는 방법을 보여줍니다.

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단일 효모 세포에서 MAPK 유도 표현의 시간적 정량화

여기에 설명 된 프로토콜 4-thiouracil으로 표시 하는 효 모 세포에서 정화 하는 새로 합성된 mRNA의 게놈 넓은 정량화를 기반으로 합니다. 이 방법은 mRNA 합성 mRNA 감퇴에서 연결을 측정할 수 있게 그리고, 따라서, RNA 중 합 효소 II 전사의 정확한 측정을 제공 합니다.

Saccharomyces cerevisiae 4-thiouracil와의 정량화로 대사 새로 합성 mRNA로 RNA 중 합 효소 II 활동에 대 한 프록시

이 프로토콜은 시판되는 DNA 젤 얼룩이 있는 미토콘드리아 핵종의 특정 라벨링, 초고해상도 구조조명 현미경(SR-SIM)에 의한 라이브 라벨링 세포의 타임랩스 시리즈 획득, 핵운동의 자동 추적을 설명합니다.

시간 경과 구조화 조명 현미경 검사법에 대한 미토콘드리아 핵의 특정 라벨링

최근 진행에도 불구하고 많은 효모 미토콘드리아 단백질은 여전히 완전히 알려지지 않은 기능으로 남아 있습니다. 이 프로토콜은 분자 기능의 해명에 대한 기본이었던 단백질의 제출국국화를 결정하는 간단하고 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.

신진 효모 사카로미세스 세레비시아에 제출 단백질 지역화 평가

과산화수소 (H 2 O2)는 산화 손상의 원인이자 신호 분자입니다. 이 프로토콜은 살아있는 효모에서 유전적으로 인코딩된 비율계량 바이오센서인 미토콘드리아 표적 HyPer7(mtHyPer7)을 사용하여 미토콘드리아H2O2를 측정하는 방법을 설명합니다. 무료로 제공되는 소프트웨어를 사용하여 이미징 조건을 최적화하고 정량적 세포 및 세포 내 분석을 수행하는 방법을 자세히 설명합니다.

살아있는 효모 세포에서 미토콘드리아 과산화물을 위한 비율계량 바이오센서인 mtHyPer7의 이미징

이 연구는 생물학적 방법을 사용하여 효모 미토콘드리아를 형질전환하는 방법을 설명합니다. 또한 형질전환체를 선택하고 정제하는 방법과 미토콘드리아 게놈 내의 표적 위치에 원하는 돌연변이를 도입하는 방법을 보여줍니다.

베이커의 미토콘드리아 변환

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베이커효모사카로미세스 세레비시아에 미토콘드리아 게놈 발현 제품의 라벨링 및 시각화

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