면역 형광을 사용하여 제브라피시 배아 심장에서 PM2.5-유도 된 DNA 손상을 감지합니다.
2021년 2월 15일
이 프로토콜은 면역 형광 분석기를 사용하여 제브라피시 배아의 해부 된 심장에서 PM2.5-유도 된 DNA 손상을 감지합니다.
이 방법은 제브라피시 심장에서 표적 단백질의 발현을 정확하고 쉽게 검출하는 데 사용할 수 있습니다. 표적 단백질의 변화는 면역 형광을 측정하여 직접 검출됩니다. 텍스트 원고에 설명된 바와 같이 제브라피시 배아 수집 및 치료를 수행합니다.
72 시간 후 수정, 유리 슬라이드에 배아를 전송하고 스테레오 현미경으로 관찰. 심근 부종, 변경 된 반복 및 감소 된 크기와 같은 심장 기형을 기록하십시오. 기형 비율을 계산하고 터키의 다중 비교 테스트 다음에 ANOVA를 사용하여 그룹 간의 차이를 분석합니다.
밀리리터 MS222당 0.6밀리그램으로 배아를 마취한 후 30초 동안 하트비트를 기록하고 Image J 소프트웨어를 사용하여 심박수를 정량화합니다. 스테레오 현미경 의 밑에 일회용 주사기 바늘로 얼룩말 물고기 배아에서 조심스럽게 심혼을 해부합니다. 소수성 장벽 펜을 사용하여 깨끗한 유리 슬라이드에 원을 그립니다.
PBS의 1.25 마이크로리터에 4%의 파라포름알데히드50마이크로리터를 추가한 다음, 해부된 3개의 하트를 하나의 소수성 장벽 원에 넣고 실온에서 20분 동안 배양합니다. 현미경의 밑에 용액을 데크로하고 적어도 5 분 동안 실온에서 샘플을 건조. PBST에서 슬라이드를 세 번 세척당 5분간 세척합니다.
50 마이크로리터의 BSA를 PBST 1, 000 마이크로리터에 추가하여 5%BSA 용액을 확보하고, 비특이적 항체 결합을 차단하기 위해 습한 챔버에서 슬라이드를 1시간 동안 배양한다. 액액을 데수수고 PBS로 시료를 세척당 5분간 3회 세척합니다. 8-하이드록시데옥시구아노신에 대한 마우스 단일클론 항체 2개와 PBST의 296마이크로리터에서 감마-H2AX에 대한 토끼 폴리클론 항체 2개의 마이크로리터를 희석하여 1차 항체 칵테일 용액을 확보하였다.
심장 샘플을 1차 항체 칵테일 용액 50마이크로리터로 실내 온도에서 최소 1시간 또는 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 가습된 챔버에 배양합니다. 용액을 데수제하고 세척당 5분 동안 PBST로 샘플을 세 번 세척합니다. FITC 표지염소 이차 항체 1개와 Psy-3 염소 항토끼 이차 항체 1개를 PBST 의 500 마이크로리터에 희석하여 이차 항체 칵테일 용액을 확보한다.
어둠 속에서 실온에서 1 시간 동안 이차 항체와 샘플을 배양. 액액을 데수수고 PBS로 시료를 세척당 5분간 3회 세척합니다. 핵 염색을 위해 샘플에 DAPI 20 마이크로리터를 추가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다.
슬라이드에 커버 슬립을 바르고 매니큐어로 밀봉하여 건조와 움직임을 방지합니다. 형광 현미경의 밑에 견본을 심상하고 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 심부지역의 형광 신호를 정량화합니다. DMSO 제어 샘플의 평균을 사용하여 상대적 변화를 계산하고 데이터의 통계적 유의여부를 결정합니다.
항산화제의 부재 또는 존재시 PM 2.5에 노출된 배아, N-아세틸-L-시스테인 또는 NAC는 심장 기형의 존재를 평가하였다. PM 2.5로부터EOM은 DMSO 대조군 처리 된 심장에 비해 심근 부종, 변경 된 반복 및 감소 된 크기와 같은 심장 성각 발생에 상당한 증가를 요합니다. 심박수는 또한 EOM에 드러난 태아에서 현저하게 감소했습니다.
NAC의 추가 감쇠 EOM 유도 심장 결함. 면역형광 분석은 EOM 처리된 조직에서 DNA 손상의 정도를 평가하기 위하여 이용되었습니다. 8-하이드록시데옥시구아노신과 감마-H2AX 발현의 수준은 EOM으로 치료된 제브라피시 배아의 심장에서 크게 증가하여 각각 산화 DNA 손상과 DNA 이중 가닥 파손의 증가를 나타낸다.
EOM 유도 된 DNA 손상은 NAC 보충에 의해 부분적으로 중화되었다. 이 프로토콜을 시도 할 때, 제브라피쉬 심장이 슬라이드를 벗겨 낼 수 있기 때문에 PBS로 샘플을 세척 할 때주의하십시오.
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개요
본 프로토콜에서는 면역형광 분석법을 사용하여 제브라피쉬 배아의 적출된 심장에서 PM 2.5로 인해 유도된 DNA 손상을 검출합니다. 이 방법을 통해 제브라피쉬 심장에서 표적 단백질의 발현을 정확하게 검출할 수 있습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 발생생물학
- 독성학
배경
- 면역형광법은 단백질 발현을 시각화하는 강력한 기술입니다.
- 제브라피시 배아는 발달 과정을 연구하는 데 유용한 모델입니다.
- PM 2.5 노출은 DNA 손상을 포함하여 다양한 건강 문제를 일으키는 것으로 알려져 있습니다.
- 환경 독소가 발달에 미치는 영향을 이해하는 것은 공중 보건에 매우 중요합니다.
연구 목적
- PM 2.5가 제브라피쉬 심장의 DNA 무결성에 미치는 영향을 평가합니다.
- 단백질 발현의 변화를 감지하기 위해 면역형광법을 활용합니다.
- 제브라피쉬 배아의 심장 기형을 평가하기 위한 신뢰할 수 있는 방법을 수립합니다.
사용된 방법
- 제브라피쉬 배아의 수집 및 처리.
- 표적 단백질 검출을 위한 면역형광 분석.
- 수정 후 72시간째에 실체 현미경을 이용한 배아 관찰.
- 일원 분산 분석(one way ANOVA) 및 Turkey의 다중 비교 검정을 이용한 통계 분석.
주요 결과
- PM 2.5 노출로 인한 제브라피시 심장의 DNA 손상 검출.
- 심낭 부종 및 루핑 이상과 같은 심장 기형 확인.
- 각 처리군별 기형 발생률 정량화.
- 분석을 통해 확인된 결과의 통계적 유의성.
결론
- PM 2.5 노출은 제브라피시 심장에 상당한 DNA 손상을 유발합니다.
- 면역형광 분석법은 단백질 발현 변화를 연구하는 데 효과적입니다.
- 이 모델은 환경 독성 및 발달 생물학에 관한 추가 연구에 활용될 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
본 면역형광 프로토콜은 발달 단계의 심장 독성 예측 모델인 제브라피시 배아 심장에서 DNA 손상 바이오마커를 정량화함으로써 환경 독성 물질의 기전적 위험 제거를 가능하게 합니다. 이 분석법은 PM2.5 노출을 산화 스트레스 및 DNA 이중 가닥 절단 경로와 연결하여 타겟 검증 및 표현형 스크리닝 워크플로우를 지원합니다. 또한 초기 발굴 단계의 위험 평가를 위한 중개 바이오마커 데이터를 제공하여 화학 물질 라이브러리의 포트폴리오 선별을 돕습니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 표적 검증
- 과학적 가치: 8-OHdG 및 γH2AX를 산화적 DNA 손상 및 이중 가닥 절단의 기전적 판독값으로 검출하여 치료 가설을 검증합니다.
- 운영적 가치: 심장 조직 내 경로 활성화를 명확히 하는 정량적 면역형광 판독값을 통해 생물학적 리스크 감소를 가능하게 합니다.
- 예측적 가치: PM2.5로 유도된 바이오마커 변화와 심장 기형 표현형 간의 상관관계를 분석하여 타겟 신뢰도를 지원합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: 면역형광 기반의 단백질 발현 검출을 통해 유전독성 화합물의 후속 스크리닝을 위한 검증된 제브라피쉬 심장 조직을 준비합니다.
- 운영적 가치: 절제된 심장의 형광 신호를 ImageJ로 분석하여 표준화되고 재현 가능한 정량적 결과물을 제공합니다.
- 확장 가능 가치: 질병 관련 시스템에서 환경 화학 물질로 유도된 단백질 발현 변화를 평가하기 위해 해당 플랫폼을 재사용할 수 있게 합니다.
중개 및 전임상 연구
- 과학적 가치: 심장 발달 경로가 보존된 모델인 제브라피시 배아 심장에서 DNA 손상을 검출함으로써 질병과의 관련성을 입증함.
- 운영적 가치: PM2.5로 유도된 심장 독성에 대한 기전적 통찰력을 제공하여, 발견 단계부터 전임상 검증까지의 중개 연구 연속성을 보장함.
- 위험 조정 발전: 항산화제(예: NAC) 병용 처리를 통한 DNA 손상 완화를 정량화함으로써 go/no-go 결정에 필요한 정보를 제공함.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 방법은 타겟 검증부터 리드 화합물 발굴에 이르는 발견 연속체 과정에 부합하며, 초기 단계의 스크리닝 캠페인에서 예측 신뢰도를 뒷받침하는 기전적 판독 값을 제공합니다.
- 발견 생물학: 환경 독성 물질 노출에 반응하는 DNA 손상 바이오마커를 정량화함으로써 가설 검증 및 경로 규명을 지원합니다.
- 스크리닝: 제브라피시 심장에서의 표준화된 면역형광 염색 및 ImageJ 기반 형광 정량화를 통해 분석 준비 상태와 정량적 결과물을 제공합니다.
- 분석: 조건 간 비교 및 히트 검증을 가능하게 하는 통계적 결과물(예: 상대적 형광 변화, ANOVA 유도 유의성)을 생성합니다.
- 중개 연구: 인간 심장 독성 평가와 관련된 발달 경로를 가진 제브라피시 모델을 사용하여 전임상 연속성을 연결합니다.
- 기업적 재활용: 척추동물 심장 모델에서 유전독성 가능성을 확인하기 위해 다양한 화학 라이브러리를 스크리닝할 수 있는 재사용 가능한 역량을 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 발달 독성 스크리닝에서 DNA 손상 경로의 기전적 위험 제거를 통해 예측 신뢰도를 제공합니다.
- 운용적 가치: 소수성 장벽과 형광 현미경을 이용한 고정된 해부, 염색 및 이미징 프로토콜을 통해 표준화와 재현성을 보장합니다.
- 전략적 가치: 바이오마커 변화를 표현형 결과와 연결함으로써 go/no-go 결정을 개선하고, 독성학 프로그램의 후기 단계 생물학적 위험을 줄입니다.
- 포트폴리오 영향: 발달 중인 심장 모델에서 DNA 손상 가능성을 기반으로 화합물의 위험 조정 우선순위 지정이 가능해집니다.
실행 시 고려 사항
- 제브라피쉬 배아 취급, 심장 해부 및 면역형광 기법에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 신호 정량화 및 통계 분석을 위해 형광 현미경과 ImageJ 소프트웨어를 사용합니다.
- 조직 손실을 방지하기 위해 해부 시점, 항체 반응 및 세척 절차에 대한 팀 간 표준화가 필수적입니다.
- 해당 분석법을 다른 제브라피쉬 조직이나 질환 모델로 확장할 때 적응 방안에 대한 고려가 필요합니다.
- 세척 과정 중 심장 조직이 떨어져 나갈 수 있는 실무적 제한 사항이 있으므로, 원문 자료에 명시된 바와 같이 PBS 취급 시 주의가 필요합니다.
