Name: 얼룩말 피시의 난소 여포에서 여포 세포와 난소 세포의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 35 s
Description: 배우세요 얼룩말 피시 난소 여포에서 여포 세포와 난소 세포를 분리하는 방법을. 당김 유리 모세관을 사용하여 손상을 최소화하고 다양한 발달 단계에서 효율적인 분리가 가능합니다. 이 기술은 1차 배양, 유전자 발현 분석, 체외 수정 등의 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 연구 작업은 중국 국립 자연과학 재단[32060170, 31601205 및 31560334]에 의해 지원되었으며, 중국 장학위원회가 지원하는 장학금 프로젝트와 담수 생태 및 생명공학 국가 핵심 연구소 기금 [2020FB05]에 의해 지원되었습니다.

어류 실험에서 수행되는 모든 절차는 노스웨스트 사범 대학의 동물 실험 윤리 위원회의 규정에 따라 수행됩니다.
1. 준비
<ol><li>마리<ol>
<li>4-6cm의 몸 길이와 성인 여성 얼룩말 피시를 사용 하십시오. 참고 : 우리는 현지 시장에서 제브라피시를 사용했습니다.</li>
		<li>제브라피쉬를 14h 광및 10시간 암울한 사이클로 순환된 물 시스템에 약 28°C로 보관하십시오.</li>
		<li>새로 부화 소금물 새우와 함께 매일 두 번 물고기를 공급합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>뽑아낸 유리 모세관<ol>
<li>15cm 의 유리 모세관을 사용하여 머리를 알코올 버너에 넣고 가열하십시오. 유리 모세관의 한쪽 끝을 손으로 잡고 다른 쪽 끝을 집게로 잡습니다.</li>
		<li>5-10초를 가열한 후, 알코올 버너의 불에 탄 유리는 빨간색과 부드러워집니다. 필요한 직경으로 모세관을 열수 있도록 집게로 유리 모세관의 머리를 스트레칭합니다. 참고: 직경은 모낭 직경에 따라 달라집니다: previtellogenic (PV; 직경 약 0.30 mm), 초기 vitellogenic (EV; 직경 약 0.40 mm), midvitellogenic (MV; 직경 약 0.50 mm), 늦은 비텔로겐성 (LV; 직경 약 0.60 mm) 및 전체 성숙 (F5 직경)</li>
		<li>유리 모세관의 개구부를 적절한 직경으로 스트레칭하여 분리 된 여포의 크기가 약간 작습니다. 난소 여포의 크기보다 훨씬 큰 개구부를 가진 유리 모세관은 분리를 수행할 수 없습니다, 그러나 훨씬 작은 것들은 분리하는 동안 여포를 깰 것입니다. 유리 모세관의 스트레칭을 여러 번 연습하십시오. 참고 : 가열 시간은 유리 모세관의 크기에 따라 달라집니다. 알코올 버너의 불에 유리 모세관을 직접 스트레칭하지 마십시오. 유리 모세관을 깨뜨릴 것입니다.</li>
		<li>앰플 커터로 유리 모세관을 자르고 집게로 유리 모세관을 부러뜨려 매끄러운 절개를 얻습니다. 참고: 유리 모세관의 날카롭거나 부러진 개구부로 여포가 손상됩니다.</li>
		<li>30cm 플라스틱 튜브를 사용하여 한쪽 끝에 필터 요소로 1mL 파이펫 팁을 삽입하고 파이펫 끝에 당겨진 유리 모세관을 삽입하고 다른 쪽 끝에 200 μL 파이펫 팁을 연결합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 다른 단계에서 제브라피피 피낭과 여포 세포의 분리
<ol><li>제브라피시 난소의 해부<ol>
<li>얼음 양동이를 슬러리 얼음으로 가득 4/5로 채우고 슬러리 얼음이 떠있게하기에 충분한 생선 물을 추가하십시오. 2-5분 간 기다렸다가 수온을 확인하고 온도가 2-4°C 사이인지 확인하십시오.</li>
		<li>물고기가 아가미 움직임을 멈출 때까지 적어도 2-5 분 동안 얼음 물에 물고기를 배치하여 성인 여성을 마취시합니다. 죽음을 보장하기 위해 날카로운 가위를 사용하여 척수를 끊어 물고기를 참수.</li>
		<li>물고기는 집게로 해부 접시에 놓습니다.</li>
		<li>해부 가위를 사용하여 다음과 같이 잘라냅니다. 클로카에서 복부의 중간선을 따라 아가미로 해부한다. 클로카 의 뒷면에서 잘라. 전방 끝에서 등쪽으로 잘라냅니다. 신체의 한쪽에 있는 피부와 근육을 부드럽게 제거합니다. 내부 장기를 노출하고 집게로 전체 난소를 꺼낸다.</li>
		<li>즉시 난소를 60% 라이보비츠의 L-15(L-15) 배지가 들어 있는 100mm 배양 접시에 부드럽게 넣습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>난소 여포의 격리 참고 : 우리가 채택 한 스테이징 시스템은 셀만 외4의원래 정의를 기반으로합니다.<ol>
<li>이전에 설명된 바와 같이 미세 한 개의 포셉을 사용하여 다른 단계의 여포를 수동으로분리합니다.</li>
		<li>PV, EV, MV, LV 및 FG 단계의 난소 여포를 다음 단계로 그룹화합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>난소 여포에서 여포 세포와 난소 세포의 분리<ol>
<li>난소 여포를 다른 단계에 넣고 60% L-15 배지를 함유한 깨끗한 페트리 접시에 넣습니다.</li>
		<li>1.2 단계에서 당겨진 유리 모세관을 사용하여 여포를 유리 모세관 2-3cm로 빨아 내어 날려 버리세요. 참고: 유리 모세 혈관의 개구름이 적절한 경우 여포를 한 번 흡입하여 난낭과 분리할 수 있습니다.<ol>
<li>여포 세포 층이 난소에 단단히 부착되면 완전한 분리를 달성하기 위해 2-3 번 반복하십시오. 여포를 손상시킬 작은 모세관을 통해 여포를 강요하는 여러 번의 시도를 피하십시오. 참고: 흡입 및 불기 과정에서 여포 층이 낙상되어 난소에서 분리되고, 마지막으로 여포 세포와 탈모낭이 분리된다(도1).</li>
		</ol>
</li>
		<li>비누드하지만 그대로 난귀를 풀고 추가 에세이를 위해 살아남은 황토를 수집합니다.</li>
		<li>여포 세포가 그대로 여포에서 분리되었는지 여부를 조사하기 위해, 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)로 그대로 여포와 분리 된 난귀세포를 얼룩.<ol>
<li>샘플을 실온(RT)에서 4% 버퍼링한 파라포름알데히드로 1시간 동안 수정합니다. PBS로 여러 번 씻으시면 됩니다.</li>
			<li>30 분 동안 RT에서 DAPI에 의해 얼룩. PBS로 여러 번 씻겨. 형광 현미경으로 보고 사진 (예를 들어, 라이카 DFC7000 T).</li>
		</ol>
</li>
		<li>완성된 분리를 확인하기 위해, 4°C에서 4% 완충 된 파라포름알데히드에 그대로 여포및 분리 된 난모를 고정하고 - 25 °C에서 조직 동결 배지 (예를 들어, 라이카)를 포함한다.<ol>
<li>마이크로토메의 고정 된 조직을 잘라 유리 슬라이드에 장착합니다.</li>
			<li>PBS의 섹션을 세척하고 DAPI로 세포 핵을 시각화합니다. 형광 현미경으로 보고 사진.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 체외 성숙 (IVM) 및 체외 수정 (IVF)
참고 : IVF의 IVM의 절차는 사소한 수정 11,12,13이전에설명된 바와 같이 따랐다.
<ol><li>성인 제브라피쉬 암컷의 난소 해부 전에 신선한 성숙 배지(+DHP 배지)를 준비하십시오. 신선한 성숙 매체를 준비하려면 라이보비츠의 L-15 배지 인 pH 9.0의 9 mL을 15 mL 원문 튜브에 추가하십시오. 17α-20β-dihydroxy-4 pregnen-3-one(DHP), dH2O의 490 μL, 10% 소 세럼 알부민(BSA)의 500 μL을 추가합니다.</li>
	<li>행크의 솔루션과 E3 솔루션을 미리 준비합니다. Baars 외14에의해 설명 된 행크스의 솔루션을 준비합니다. 준비 E3 매체: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2,0.33 mM MgSO4,1-5% 메틸렌 블루.</li>
	<li>단계 2에서와 같이 얼룩말 피시 난소의 해부와 난소 여포의 격리를 수행합니다.</li>
	<li>전체 성장 단계 여포를 수집하고 미숙한 난모로 사용합니다. 각 성인 여성 얼룩말 물고기에 대 한, 적어도 150-200 전체 성장 단계 여포 격리 될 수 있습니다. IVM에 대한 손상되지 않고 건강한 여포를 선택합니다.</li>
	<li>12웰 플레이트에 +DHP 배지로 전체 재배 단계 여포를 배양하여 주기적으로 검사하여 난모세포가 그대로 유지되도록 합니다. 파스퇴르 파이펫으로 리싱 난모를 제거합니다. 참고: 난모세포 성숙시, 난모세포는 점진적으로 반투명하게 됩니다. 난모세포의 대부분은 2 시간 동안 DHP의 치료 후 반투명된다. 이것은 전송된 광 광학을 가진 해부 현미경의 밑에 관찰될 수 있습니다.</li>
	<li>단계 2.3에 설명된 대로 각 성숙한 난피세포에서 가장 바깥쪽 여포 세포를 제거한다.</li>
	<li>비누드 난우두질을 배양 배지 몇 방울로 페트리 접시에 옮기고 수정을 진행합니다.</li>
	<li>행크스용액 500μL에서 적어도 3명의 남성으로부터 해부된 고환을 사용하여 신선한 정자 용액을 준비한다. 최대 2-3 시간 동안 수정의 효능을 유지할 수있는 얼음에 정자 용액을 넣습니다.</li>
	<li>페트리 접시에 100 μL의 정자 용액을 넣고, 소멸되고 성숙한 난모세포에 넣습니다. 부드럽게 계란 사이에 정자 용액을 추가하고 피펫 팁을 사용하여 정자와 계란을 함께 소용돌이.</li>
	<li>즉시 E3 배지 용액 1mL을 추가하여 계란을 활성화하고 파이펫 팁을 사용하여 계란과 정자를 부드럽게 소용돌이시습니다.</li>
	<li>약 1 분 후 수정 후 (mpf), E3 중간 용액으로 접시를 홍수. 전체 초리온 확장은 10-15 mpf 내에서 관찰 될 수있다.</li>
	<li>35-45 mpf 사이, 2 세포 단계로 대칭 분열을 겪고 있는 배아를 선택하, 따라서 수정된다. 세포 분열을 겪고 있지 않은 배아를 제거합니다.</li>
	<li>배아는 10cm 플레이트당 80개의 배아의 한계를 가진 28°C에서 페트리 접시에서 발전하도록 허용합니다. 배아 발달을 보고 촬영합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Clelland, E., Peng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine%2Fparacrine+control+of+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Endocrine/paracrine control of zebrafish development.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 312, 42-52 (2009).</li>
<li>Ge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrafollicular+paracrine+communication+in+the+zebrafish+ovary%3A+the+state+of+the+art+of+an+emerging+model+for+the+study+of+vertebrate+folliculogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Intrafollicular paracrine communication in the zebrafish ovary: the state of the art of an emerging model for the study of vertebrate folliculogenesis.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 237, 1-10 (2005).</li>
<li>Li, J., Ge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+for+studying+ovarian+development%3A+Recent+advances+from+targeted+gene+knockout+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model for studying ovarian development: Recent advances from targeted gene knockout studies.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 507, 1-19 (2020).</li>
<li>Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+oocyte+development+in+the+zebrafish%2C+Brachydanio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio.</a> Journal of Morphology. 218, 203-224 (1993).</li>
<li>Matzuk, M. M., Burns, K. H., Viveiros, M. M., Eppig, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+communication+in+the+mammalian+ovary%3A+oocytes+carry+the+conversation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Intercellular communication in the mammalian ovary: oocytes carry the conversation.</a> Science. 296, 2178-2180 (2002).</li>
<li>Liu, L., Ge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+differentiation+factor+9+and+its+spatiotemporal+expression+and+regulation+in+the+zebrafish+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Growth differentiation factor 9 and its spatiotemporal expression and regulation in the zebrafish ovary.</a> Biology of Reproduction. 76, 294-302 (2007).</li>
<li>Zhou, R., Tsang, A. H., Lau, S. W., Ge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide+%28PACAP%29+and+its+receptors+in+the+zebrafish+ovary%3A+evidence+for+potentially+dual+roles+of+PACAP+in+controlling+final+oocyte+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) and its receptors in the zebrafish ovary: evidence for potentially dual roles of PACAP in controlling final oocyte maturation.</a> Biology of Reproduction. 85, 615-625 (2011).</li>
<li>Li, J., Liu, Z., Wang, D., Cheng, C. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-like+growth+factor+3+is+involved+in+oocyte+maturation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Insulin-like growth factor 3 is involved in oocyte maturation in zebrafish.</a> Biology of Reproduction. 84, 476-486 (2011).</li>
<li>Pang, Y., Thomas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+G+protein-coupled+estrogen+receptor+1%2C+GPER%2C+in+inhibition+of+oocyte+maturation+by+endogenous+estrogens+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Role of G protein-coupled estrogen receptor 1, GPER, in inhibition of oocyte maturation by endogenous estrogens in zebrafish.</a> Developmental Biology. 342, 194-206 (2010).</li>
<li>Peyton, C., Thomas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+epidermal+growth+factor+receptor+signaling+in+estrogen+inhibition+of+oocyte+maturation+mediated+through+the+G+protein-coupled+estrogen+receptor+%28Gper%29+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Involvement of epidermal growth factor receptor signaling in estrogen inhibition of oocyte maturation mediated through the G protein-coupled estrogen receptor (Gper) in zebrafish (Danio rerio).</a> Biology of Reproduction. 85, 42-50 (2011).</li>
<li>Welch, E. L., Eno, C. C., Nair, S., Lindeman, R. E., F, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+manipulation+of+maternal+gene+products+using+in+vitro+oocyte+maturation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Functional manipulation of maternal gene products using in vitro oocyte maturation in zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e55213(2017).</li>
<li>Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+oocyte+culture-based+manipulation+of+zebrafish+maternal+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes.</a> Developmental Dynamics. 242, 44-52 (2013).</li>
<li>Seki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+reliable+in+vitro+maturation+system+for+zebrafish+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Development of a reliable in vitro maturation system for zebrafish oocytes.</a> Reproduction. 135, 285-292 (2008).</li>
<li>Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ploidy+manipulation+of+zebrafish+embryos+with+heat+shock+2+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Ploidy manipulation of zebrafish embryos with heat shock 2 treatment.</a> Journal of Visualized Experiments. , e54492(2016).</li>
<li>Xie, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+based+on+in+vitro+oocyte+injection+to+improve+CRISPR%2FCas9+gene+editing+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A novel technique based on in vitro oocyte injection to improve CRISPR/Cas9 gene editing in zebrafish.</a> Scientific Reports. 6, 34555(2016).</li>
<li>Li, J., Bai, L., Liu, Z., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+roles+of+PDE9a+in+meiotic+maturation+of+zebrafish+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Dual roles of PDE9a in meiotic maturation of zebrafish oocytes.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2020).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

우리는 여기에 제브라피시 난소 여포에서 여포 세포와 난모세포의 간단하고 신속한 분리를위한 새로운 방법을 설명합니다. 이 방법은 종래의 방법에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 이들 중 1 차는 단일 및 외부 조작이 필요하므로 고효율 및 효과로 분리의 용이성을 크게 증가시다. 이 점은 현미경 해부학에 좋지 않은 연구원에 대한 적용성을 증가시킵니다. 우리의 경험에 따르면, 하나는 성공적으로 유리 모세관을 사용하여 5-10 s 내에서 완전히 성장 된 단계 여포에서 여포 세포와 난모세포를 분리 할 수 있습니다. 그러나, 적어도 30-60 s는 집게를 사용하여 이 분리를 하기 위하여 필요합니다. 더 중요한 것은, 일반적으로 유리 모세관에 의해 분리된 탈모세포의 적어도 20%는 자발적인 난소 세포 성숙을 겪을 수 있다. 대조적으로, 디누드 난초의 1%를 초과하지 않는 것은 집게를 사용하여 자발적인 난모세포 성숙을 겪을 수 있습니다. 따라서, 유리 모세관을 이용한 새로운 방법의 효율성과 효과는 이전에 확립된 방법보다 더 낫다. 둘째, 이 방법...

Zebrafish는 척추 동물 발달 및 생리학연구를 위한 주요 모형 유기체입니다. 제브라피쉬는 난소발달1,2,3의분자 메커니즘을 연구하는 좋은 모델이 될 수 있다. 난소 발달의 많은 특징은 물고기에서 포유류1,2로진화하는 동안 많이 보존된다. 다른 척추동물과 유사하게, 제브라피시 성인은 비동기 난소를 가지고 있으며, 모든 발달 단계4의난소 여포를 함유하고 있다. 여포는 난소의 기본 생식 요소입니다. 여포는 여포 세포에게 불린 체세포의 하나 또는 여러 층으로 포위되는 oocyte로 이루어져 있습니다. 여포의 발달은 난모세포와 여포 세포5사이의 양방향 통신에 의존한다. 여포 세포 원발문화, 유전자 발현 분석, 난소 성숙도 및 체외 수정과 같은 다른 연구 목적을 위해 난소 여포에서 여포와 난모세포를 분리하는 것이 중요합니다.
전통적인 분리 방법은 집게 및 효소소화6,7,8,9,10에의한 기계적분리를포함한다. 그러나, 집게에 의한 기계적 분리는 시간이 많이 걸리고 힘들다. 또한 분리 시 난소에 높은 손상을 입힙니다. 효소 소화 방법은 조작이 간단하고 짧은 시간이 필요하지만, 치료 시간과 효소 농도를 검증해야 하며, 고립된 난모세포의 무결성과 생존율은 이상적이지 않다. 따라서, 우리는 당겨진 유리 모세관 관을 사용하여 다른 발달 단계에서 두 구획을 분리하는 간단한 방법을 설립했다.

<table><tbody><tr><td>17&alpha;,20&beta;-DHP</td><td>케이맨</td><td>16146-5(5mg)</td><td></td></tr><tr><td>24웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>앰플 커터</td><td>AS ONE</td><td>5-124-22 1봉(100개)</td><td></td></tr><tr><td>무수 Na2HPO4</td><td>Kaixin Chemical</td><td>500g</td><td></td></tr><tr><td>염수 새우</td><td>Hongjie</td><td>250g</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Beichen Fangzheng</td><td>500 g</td><td></td></tr><tr><td>배양 접시</td><td>Biosharp</td><td>BS-90-D (10PCS/PK)</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Solarbio</td><td>S2110 (25mL)</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>ZEISS</td><td>Stemi 305</td><td></td></tr><tr><td>해부 겸</td>자 <td>VETUS</td><td>HRC30</td><td></td></tr><tr><td>해부 가위</td><td>Kefu</td><td>160 mm&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>형광 실체현미경&nbsp;</td><td>라이카</td><td>M205C</td><td></td></tr><tr><td>유리 모세관</td><td>IWAKI</td><td>IK-PAS-5P (200 pcs/PACK)</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Solarbio</td><td>C0031 (1 mg)</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Beichen Fangzheng</td><td>500 g</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Kaixin Chemical</td><td>500 g</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz' s L-15 medium</td><td>Gibco</td><td>41300-039 (10&times; 1L)</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&bull; 7H2O</td><td>Beichen Fangzheng</td><td>500g</td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫 팁</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Beichen Fangzheng</td><td>500g</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Beichen Fangzheng</td><td>500g</td><td></td></tr><tr><td>Penicilia-streptomycia</td><td>Gibco</td><td>#15140122(100mL)</td><td></td></tr><tr><td>실체현미경</td><td>ZEISS</td><td>디스커버.v20</td><td></td></tr></tbody></table>

얼룩말 피시의 난소 여포에서 여포 세포와 난소 세포의 분리

Separation of Follicular Cells and Oocytes in Ovarian Follicles of Zebrafish

Zebrafish는 척추동물의 난소 발달을 연구하기에 이상적인 모델이 되었습니다. 여포는 난소와 주변 여포 세포로 구성된 난소의 기본 단위입니다. 여포 세포의 1차 배양, 유전자 발현 분석, 난낭 성숙및 체외 수정 등과 같은 다양한 연구 목적을 위해 여포 세포와 난미세포를 분리하는 것이 중요합니다. 종래의 방법은 집게를 사용하여 두 구획을 분리하는데, 이는 힘들고 시간이 많이 걸리며 난소세포에 높은 손상을 줍니다. 여기서, 우리는 당겨진 유리 모세관을 사용하여 두 구획을 분리하는 간단한 방법을 확립했습니다. 스테레오 현미경의 밑에, oocytes 및 여포 세포는 뽑아낸 미세 유리 모세관에서 파이펫으로 쉽게 분리될 수 있습니다 (직경은 여포 직경에 달려 있습니다). 종래의 방법에 비해, 이 새로운 방법은 난모세포와 여포 세포를 분리하는 데 있어서 고효율을 가지며 난모세포에 대한 손상이 낮습니다. 더 중요한 것은, 이 방법은 사전 vitellogenesis 단계에서를 포함하여 초기 단계 여포에 적용될 수 있습니다. 따라서, 이 간단한 방법은 제브라피시의 여포 세포 및 난모세포를 분리하는 데 사용될 수 있다.

이 방법은 제브라피시에서 난소 여포 발달의 다른 단계에서 여포 세포와 난모세포를 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 도 1은 모세관 유리 튜브를 사용하여 난소 여포로부터 얼룩말 피낭 및 여포 세포의 분리를나타낸다(도 1). 여포 세포가 그대로 여포로부터 분리되었는지 여부를 조사하기 위해, 태양광 단계에서 FG 단계로의 여포의 상이한 단계에서 분비및 분리된 난투는 30분 동안 37°C에서 DAPI(50 μg/mL)로 염색하였다. 여포 세포의 핵은 DAPI에 의해 얼룩질 수 있다. DAPI의 파란색 신호는 그대로 여포에서 관찰되었지만 난소세포(그림 2)는제거되지 않았습니다. 이것은 여포의 난모세포 및 여포 세포가 이 방법에 의해 깨끗하게 분리될 수 있다는 것을 나타냅니다. 명확한 분리를 더 확인하기 위해, 그대로 여포와 분리 된 난모세포는 조직학적 섹션으로 절단되었다. DAP...

여기서는 제브라피시 난소 여포에 여포 세포와 난소 세포를 분리하는 간단한 방법을 제시하여 제브라피시의 난소 발달에 대한 조사를 용이하게 합니다.

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of ...

이 절차의 전반적인 목표는 제브라피시의 난소 여포에서 여포 세포와 Oocytes를 분리하는 것입니다. 여포는 난소의 기본 단위이며, 이는 난소와 주변 여포 세포로 구성됩니다. 여포 세포의 1 차 적인 캡처를 포함 하 여 잘 연구 정책에 대 한 여포 세포와 외부 구획을 분리 하는 넓은 도구이며 유전자 발현에 상승, 모든 채도 및 체 외 수정.최근 Zebrafish는 닛산의 강력한 모델이 되었으며, 이는 이미 개발의 제어를 연구하고 있습니다. 여기서, 우리는 간단한 방법을 제시하므로, 제브라피시에서 이미 개발의 조사를 용이하게 할 제브라 피쉬 여포의 여포 세포와 난모세포를 분리하여 상업적, 질량 또는 여포 세포에 대한 두 개의 분리및 스핀의 모든 면은 미로가 있는 포스트를 사용하고 있으며, 시간이 많이 걸리고 외부에 높은 손상을 입었다. 여기서, 우리는 순수한 암초 아래 타멜라 비율을 사용하여 두 개의 별도의 구획또는 부품 안경타멜라 속도에 간단한 방법을 설립했습니다.우리의 메트로 범위, 외부와 여포 세포 모두 쉽게 뽑아 유리 모세관을 입력하여 조작 할 수 있습니다. 첫째, 시인 유리 모세관을 준비합니다. 알코올 버너에 유리 모세관의 머리를 명중.유리 모세관을 레이브 카드 직경으로 스트레칭하려면 4면을 사용합니다. 둘째, 성인 여성 물고기에서 과다 모독, 난소 여포를 난소에서 분리. 마지막으로 난소 여포에서 여포 세포와 오키테를 분리하기 위해 설문 조사 유리 모세관을 사용합니다.유리 모세관, 날카로운 용기, 충분한 커터, 알코올 버너 및 집게를 준비합니다. 알코올 버너를 거짓말, 모세관 한 잔을 집에 가져 와서 알코올 버너의 불에 유리 모세관의 한쪽 끝을 가열. 집게를 사용하여 유리 모세관의 또 다른 끝을 잡고 유리 모세관을 빠르고 부드럽게 강조합니다.날카로운 용기에 유리 폐기물을 넣습니다. 유리와 함께 수영장에 충분한 커터 그렛치를 사용합니다. 그런 다음 부드럽게 집게에 의해 분해하여 포트 눈의 매끄러운 개구부를 만들어 신속하게 알코올 버너에 유리 모세관의 끝을 여러 번 구울 하고 충분한 커터로 오픈 엔드를 문지릅니다.재배 된 물 시스템에서 어조를 가져 가라. 그리고 이제 물고기가 길의 움직임을 멈출 때까지 적어도 2 ~ 5 분 동안 얼음 물에 물고기를 배치하여 성인 여성을 묶습니다. 얼음 상자에서 물고기를 꺼내 수건으로 남은 물 물고기 몸을 제거하고 4 세트로 D 섹션 접시에 물고기를 놓습니다.물고기는 죽음을

separation-follicular-cells-oocytes-ovarian-follicles

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 프로토콜은 제브라피시 배아에서 단일 세포를 분리하고, 관심 세포를 농축하고, 미세유체 기반 단세포 다중 시스템에서 제브라피시 세포를 포획하고, 단일 세포에서 유전자 발현을 평가하는 방법을 설명합니다.

분리 및 Zebrafish의 배아에서 단일 세포의 특성

모체 유전자 산물의 조작에 사용 제브라 난자의 체외 성숙에 최적화 프로토콜은 여기에 제시된다.

사용 모성 유전자 제품의 기능 조작<em&gt; 체외</em제브라 피쉬&gt; 난자의 성숙

여기서 우리는 제브라 피쉬 섹스의 분화 및 유지 보수의 조사를 용이하게 애벌레 제브라 피쉬의 성선 조직을 분리하기위한 프로토콜을 제시한다.

애벌레 Zebrafish의 생식소 조직의 해부

전후 난포 생성에 대한 연구를 발전시키기 위해서는 단일 난소에서 난포를 분리하는 효율적인 방법이 필요합니다. 여기에 제시된 것은 조직 초퍼와 균질화를 사용하여 소 난소에서 난포를 분리하기위한 간소화 된 기계적 프로토콜입니다. 이 방법은 단일 난소에서 많은 수의 생존 가능한 전방 난포를 수집 할 수있게합니다.

단편화, 균질화 및 연속 여과의 조합을 사용하여 소 난소에서 작은 전방 난포의 분리

이 프로토콜은 과립세포 세포가 없는 제브라피시에서 깨끗한 I기 난모세포를 신속하게 분리하기 위한 수정된 절차를 설명하여 난모세포별 연구를 위한 편리한 방법을 제공합니다.

과립 세포가 없는 제브라피시에서 Stage I 난모세포의 신속한 분리

여기에서는 조류 배란 전 여포에서 난황, 과립층 세포 및 테카 세포를 분리하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 이러한 정밀한 취급을 통해 생식 기능에서 이러한 층의 역할에 대한 중요한 조사를 수행할 수 있으며, 농업 수확량 및 생물 의학적 통찰력을 향상시키기 위해 여포 발달, 호르몬 조절 및 질병 연구에 대한 이해를 돕습니다.

다운스트림 응용을 위한 조류 배란 전 여포 granulosa 및 Theca 세포층 분리

이 프로토콜은 신생아 마우스와 사춘기 쥐에서 개별 난소에서 난소를 사용하여, 마우스 난소 조직의 주요 문화 / 공동 문화를 설명합니다. 배양 기술은 난소에 외인성 제제의 효과의 조사를 가능하게하여 생리 고도로 개발을 지원하고, 난포 사이의 상호 작용.

문화 공동 문화 마우스의 난소와 난소

이 연구에서는 제브라피시 유충에 대해 EBD(Evans Blue Dye) 분석을 수행하는 간단한 방법을 설명합니다.  이 기술은 골격근 무결성의 특성화와 근이영양증의 제브라피시 모델을 묘사하기 위한 강력한 도구이며 새로운 치료법 개발을 위한 귀중한 방법입니다.

에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

우리는 유전자 발현 및 콜라겐 분해 활성을 평가하기 위해 쥐 서혜부(피하) 및 성선주위(내장) 지방 조직 저장소에서 기질 혈관 분획(SVF)을 분리하는 데 필요한 기술을 제시합니다. 이 방법에는 면역자기 세포 분리를 사용하여 Sca1고지방 유래 줄기세포(ASC)를 농축하는 것이 포함됩니다.

지방 창고 별 SCA1의 면역 자기 분리<sup&gt; 높은</sup&gt; 지방이 유래 줄기 세포 (의 ASC)

이 원고는 형태 학적 및 생화학 적으로 말의 난 모세포를 특성화하기위한 실험적 접근법을 기술한다. 특히, 본 연구는 초음파 유도 난자 채취 (OPU)에 의한 미성숙 및 성숙한 난 모세포를 수집하는 방법과 염색체 분리, 스핀들 형태, 전 세계 히스톤 아세틸 화 및 mRNA 발현을 조사하는 방법을 설명한다.

말의 난 모세포에서의 염색체 분리, 히스톤 아세틸 화 및 스핀들 형태의 분석

배우세요 얼룩말 피시 난소 여포에서 여포 세포와 난소 세포를 분리하는 방법을. 당김 유리 모세관을 사용하여 손상을 최소화하고 다양한 발달 단계에서 효율적인 분리가 가능합니다. 이 기술은 1차 배양, 유전자 발현 분석, 체외 수정 등의 연구에 활용됩니다.

얼룩말 피시의 난소 여포에서 여포 세포와 난소 세포의 분리

더 많은 동영상 탐색