Name: 생물학적 조직 샘플의 직렬 블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사(SBF-SEM) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: 학습하세요 생물학적 조직 샘플의 직렬 블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사(SBF-SEM) 기법을 통해 3차원 조직 초미세 구조를 정밀하게 관찰하는 방법을 배우세요. 이 프로토콜은 고해상도 3D 데이터셋 생성에 필수적입니다.

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샘 핸런 박사, 에블린 브라운, 마가렛 곤도 박사의 뛰어난 기술 지원에 감사드립니다. 이 연구는 국립 보건원 (NIH) R01 EY-018239 및 P30 EY007551 (국립 안과 연구소)에 의해 부분적으로 지원되었으며, 부분적으로 NIH 1R15 HD084262-01 (국립 아동 건강 및 인간 발달 연구소)에 의해 지원되었습니다.

저자는 공개 할 것이 없습니다.

이 방법 논문의 목적은 우리의 실험실이 안정적으로 고해상도 직렬 전자 현미경 이미지를 캡처 할 수 있도록 조직 준비 및 이미징 방법론을 강조하고, SBF-SEM 이미징을 수행 할 때 발생할 수있는 잠재적 인 함정뿐만 아니라이 결과로 이어지는 중요한 단계를 지적하는 것입니다. 이 프로토콜을 사용하여 성공하려면 조직의 적절한 고정, 시료에 중금속의 함침, 충전을 줄이기 위한 포함 수지수정, 이미지를 수집하는 데 사용되는 현미경 및 이미징 설정에 대한 이해가 필요합니다. 격언, "품질, 품질 아웃"SBF-SEM 이미징에 적합한 공리입니다. SBF-SEM의 목표는 종종 초구조적 세부 사항의 감사 또는 정량화이기 때문에 조직 왜곡이 발생하지 않도록 고정 전략에 추가주의를 기울여야 합니다. 조직이 시료 준비의 어느 시점에서왜곡되는 경우 (즉, 팽창, 수축, 또는 세포 형태의 중단을 겪는다), 다음 조직 재구성 및 양자화는 정확한 데이터를 산출하지 않습니다. 또한 잘못된 이미징 설정을 사용하면 SBF-SEM 이미징이 파괴적인 과정이기 때문에...

직렬 블록 얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사 (SBF-SEM)는 1981 년 레이튼에 의해 처음 설명되었으며 수지에 내장 된 조직의 얇은 섹션을 절단하고 이미지 할 수있는 내장 된 마이크로 토메로 보강 된 스캐닝 전자 현미경을 만들었습니다. 불행하게도, 기술적 제한은 생물학적 조직과 같은 비전도성 샘플이 허용 할 수없는 수준의 충전 (조직 샘플 내의 전자 축적)을 축적함에 따라 전도성 샘플에 의한 사용을제한하였다. 증발된 탄소 감소 조직 충전으로 컷 사이에 블록 페이스를 코팅하는 동안, 이 크게 증가된 이미징 수집 시간과 이미지 저장은 당시 컴퓨터 기술이 장치에 의해 생성된 큰 파일 크기를 관리하기에 충분하지 못했기 때문에 문제가 남아 있었다. 이 방법론은 2004년 덴크와 호르스트만이 가변 압력 챔버2를장착한 SBF-SEM을 사용하여 재검토되었다. 이를 통해 시료 내의 충전을 줄이는 이미징 챔버에 수증기를 도입하여 이미지 해상도의 손실에도 불구하고 비전도성 시료의 이미징을 실현할 수 있었습니다. 조직 제제 및 이미징 방법의 추가 개선은 이제 높은 진공을 사용하여 이미징을 허용하고, SBF-SEM 이미징은 더 이상 충전3,4,5,6,7,8,9를방출하기 위해 수증기에 의존하지 않는다. SBF-SEM은 최근 몇 년 동안 사용이 기하급수적으로 증가하는 반면, 적절한 조직 준비 및 이미징 매개 변수와 같은 기술적 측면은 이 이미징 양식의 성공을 위해 가장 중요합니다.
SBF-SEM은 3-5 nm10,11의작은 평면 해상도로 수천 개의 연속 등록 전자 현미경 이미지의 자동화 된 컬렉션을 허용합니다. 중금속으로 함침되고 수지에 내장된 조직은 다이아몬드 나이프가 장착된 초미세토메를 함유한 주사 전자 현미경(SEM) 내에 배치됩니다. 평평한 표면은 다이아몬드 칼로 절단되고, 칼은 후퇴하고, 블록의 표면은 조직 울트라 구조의 이미지를 만들기 위해 전자 빔이있는 래스터 패턴으로 스캔됩니다. 그런 다음 블록은 z축에서 지정된 양(예: 100 nm)을 제기하고"z-step"이라고 하며 프로세스가 반복되기 전에 새 표면이 절단됩니다. 이러한 방식으로 조직의 절단으로 3차원(3D) 이미지 블록이 생성된다. 이 이미징 시스템은 장치의 자동화된 특성으로부터 더 많은 이점을 누릴 수 있으므로 이미징 프로세스 중에 현미경을 방치하고 하루 만에 수백 개의 이미지를 자동화하여 수집할 수 있습니다.
SBF-SEM 이미징은 주로 백산전자를 사용하여 블록 페이스의 이미지를 형성하지만, 이차 전자는 이미징프로세스(12)중에 생성된다. 이차 전자는 블록을 탈출하지 않는 백산및 1차 빔 전자와 함께 축적될 수 있으며 블록 페이스에서 국소화된 정전기장으로 이어질 수 있는 "조직 충전"을 생성할 수 있습니다. 이러한 전자 축적은 영상을 왜곡하거나 전자가 블록으로부터 배출되는 원인이 되며 백스캐터 검출기에 의해 수집된 신호에 기여하여 신호 대 잡음비(13)를감소시킬 수 있다. 조직 충전의 수준은 전자 빔 전압 또는 강도를 감소시켜 감소 할 수 있지만, 빔 거주 시간을 감소, 이 감소 신호 대 잡음 비율(14)발생. 저전압 또는 강도의 전자 빔이 사용되거나, 빔이 짧은 시간 동안 각 픽셀 공간 내에만 거주할 수 있는 경우, 백산전자가 조직에서 배출되어 전자 검출기에 의해 포획되어 신호가 약해진다. 덴크와 호르스트만은 챔버에 수증기를 도입하여 이 문제를 처리하여 심실과 블록 페이스의 전하를 이미지 해상도로 줄였습니다. 10-100 Pa의 챔버 압력으로, 전자 빔의 일부가 이미지 잡음 및 해상도 의 손실에 기여하는 산란되지만, 이것은 또한 샘플 블록2내의 전하를 중화시 챔버에서 이온을 생성한다. 시료 블록 내에서 전하를 중화하는 방법은 이미징 중에 블록 페이스에 질소의 초점 가스 주입을 사용하거나, SBF-SEM 단계에 음수 전압을 도입하여 프로브 빔-라딩 에너지를 감소시키고 수집된 신호수집 6,7,15를증가시킵니다. 블록 표면에 전하 축적을 감소시키기 위해 단계 바이어스, 챔버 압력 또는 국소화질소 주입을 도입하는 대신, 수지 믹스에 탄소를 도입하여 수지의 전도도를 높일 수 있어 더욱 공격적인 이미징설정(16)이가능하다. 다음 일반적인 프로토콜은 2010년에 발표된 Deerinck 외 프로토콜의 적응이며, 고해상도 이미지 수집3,17,18,19를 유지하면서 조직 충전을 최소화하는 데 유용하다고 판단한 조직 제제 및 이미징 방법론에 대한수정을다룹니다. 이전에 언급된 프로토콜은 조직 처리 및 중금속 함침에 초점을 맞추고 있지만, 이 프로토콜은 SBF-SEM 연구에 내재된 이미징, 데이터 분석 및 재구성 워크플로우에 대한 통찰력을 제공합니다. 우리의 실험실에서, 이 프로토콜은 성공적으로 및 각막 및 전방 세그먼트 구조를 포함하여 조직의 다양한에 성공적으로 재현적으로 적용되었습니다, 눈꺼풀, 홍엽 및 하심자 동맥, 망막 및 시신경, 심장, 폐 및 기도, 신장, 간, 크레마스터 근육, 대뇌 피질/수질, 마우스, 쥐, 토끼, 기니 피그, 물고기, 단층 및 계층화된 세포 배양, 돼지, 비인간 영장류, 인간20,21,23,23. 사소한 변화는 특정 조직 및 응용 프로그램에 가치가있을 수 있지만,이 일반적인 프로토콜은 우리의 핵심 이미징 시설의 맥락에서 매우 재현하고 유용 입증했다.

<table><tbody><tr><td>1/16 x 3/8 알루미늄 리벳</td><td>산업용 리벳 및 패스너 (주)</td><td>6N37RFLAP/1100</td><td>시편 핀으로 사용됩니다.</td></tr><tr><td>2.5mm 일자 드라이버</td><td>Wiha 품질 도구</td><td>27225</td><td></td></tr><tr><td>아세톤</td><td>전자 현미경 과학</td><td>RT 10000</td><td>은 페인트를 희석하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>아스파르트산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8949</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>FisherScientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>전도성 은 페인트</td><td>Ted Pella</td><td>16062</td><td></td></tr><tr><td>Denton Desk-II 진공 스퍼터링 장치 표준 금박 대상이 장착된</td><td>Denton Vacuum</td><td>N/A</td><td>이것은 저자가 사용하는 금 스퍼터링 장치이며 대안이 허용됩니다.</td></tr><tr><td>양날 면도기</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-949-411</td><td></td></tr><tr><td>Embed 812</td><td>전자 현미경 과학</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>Gatan 3View2 Tescan Mira3 전계 방출 SEM</td><td>Gatan & 테스캔</td><td>N/A</td><td>저자가 사용하는 SBF-SEM 장치이며, 대체 장치도 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>유리 껍질 바이알, 0.5 DRAM (1.8 ml)</td><td>전자 현미경 과학</td><td>72630-05</td><td></td></tr><tr><td>글루테알데히드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>16320</td><td></td></tr><tr><td>고릴라 슈퍼 글루 - 영향 터프</td><td>NA</td><td></td><td>NA 텍스트에서 시아노아크릴레이트 접착제로 언급됨.</td></tr><tr><td>Ketjen Black</td><td>HM Royal</td><td>EC-600JD</td><td>텍스트에서 카본 블랙으로 언급됩니다.</td></tr><tr><td>KOH</td><td>FisherScientific</td><td>18-605-593</td><td></td></tr><tr><td>납 질산</td>염 <td>Fisher Scientific</td><td>L62-100</td><td></td></tr><tr><td>마이크로파</td><td>Pelco</td><td>BioWave Pro</td><td>이것은 저자가 사용하는 마이크로파이며, 대체품은 허용됩니다.</td></tr><tr><td>오스뮴 테트록사이드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>201030</td><td></td></tr><tr><td>칼륨 페로시아나이드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9387</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 임베딩 몰드</td><td>Ted Pella</td><td>10504</td><td></td></tr><tr><td>소듐 카코딜레이트 트리하이드레이트</td><td>전자 현미경 과학</td><td>12300</td><td></td></tr><tr><td>Samco Transfer Pipette</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>202</td><td>표본 핀을 만드는 데 사용됩니다. 저장 튜브.</td></tr><tr><td>스위스 패턴 바늘 파일</td><td>전자 현미경 과학</td><td>62115</td><td></td></tr><tr><td>티오 카르 히드 라지드</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>223220</td><td></td></tr><tr><td>우라닐 아세테이</td>트 <td>Polysciences, Inc.</td><td>21447-25</td><td></td></tr><tr><td>Reconstruction Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amira Software</td><td>Thermo Scientific</td><td>N/A</td><td>그림 5-7 및 9에 있는 재구성을 만드는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>피지(피지는 Just ImageJ)</td><td>ImageJ.net</td><td>N/A</td><td>TrakEM2를 피지에 추가하여 수동 세분화를 지원할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Microscopy Image Browser (MIB)</td><td>University of Helsinki, Institute of Biotechnology</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Reconstuct Software</td><td>Neural Systems Lab</td><td>해당 없음</td><td></td></tr><tr><td>SuRVoS 워크벤치</td><td>Diamond Light Source & 노팅엄 대학교</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>SyGlass</td><td>IstoVisio, Inc.</td><td>N/A</td><td>가상 현실 및 히스토그램 기반 재구성 방법에서 재구성을 허용합니다.</td></tr></tbody></table>

생물학적 조직 샘플의 직렬 블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사(sbf-sem)

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

직렬 블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사(SBF-SEM)는 수백~수천 개의 연속 등록 초구조 이미지를 수집하여 조직 미세 해부학의 전례 없는 3차원 뷰를 제공합니다. SBF-SEM은 최근 몇 년 동안 사용이 기하급수적으로 증가하는 반면, 적절한 조직 준비 및 이미징 매개 변수와 같은 기술적 측면은 이 이미징 양식의 성공을 위해 가장 중요합니다. 이 이미징 시스템은 장치의 자동화된 특성의 이점을 통해 이미징 프로세스 중에 현미경을 방치하고 하루에 수백 개의 이미지를 자동화하여 수집할 수 있습니다. 그러나, 적절 한 조직 준비 없이 세포 울트라 구조 잘못 되 거나 오해의 소지가 결론 그려질 수 있습니다 같은 방식으로 변경할 수 있습니다. 또한 수지 임베디드 생물학적 샘플의 블록 페이스를 스캔하여 이미지가 생성되며, 이는 종종 해결해야 할 과제와 고려 사항을 제시합니다. "조직 충전"으로 알려진 이미징 중 블록 내의 전자가 축적되면 대비가 상실되고 세포 구조를 감상할 수 없습니다. 더욱이, 전자 빔 강도/전압을 증가하거나 빔 스캐닝 속도가 감소하면 이미지 해상도를 높일 수 있지만, 이는 또한 수지 블록을 손상시키고 이미징 시리즈에서 후속 이미지를 왜곡하는 불행한 부작용을 가질 수 있다. 여기서 우리는 세포 초구조를 보존하고 조직 충전을 감소시키는 생물학적 조직 샘플의 준비를 위한 일상적인 프로토콜을 제시합니다. 또한 티슈 블록에 최소한의 손상을 입히면서 고품질 의 시리얼 이미지를 빠르게 획득하기 위한 이미징 고려 사항을 제공합니다.

마우스 각막 이 프로토콜은 마우스 각막에 광범위하게 적용되었습니다. SBF-SEM 이미징을 사용하여 엘라스틴이 없는 마이크로피브릴 번들(EFMBs)의 네트워크를 사용하여 성인용 마우스 각막 내에 존재하는 것으로 나타났다. 이전에는 이 네트워크가 배아와 조기 산후 발달 중에만 존재한다고 믿었습니다. SBF-SEM은 각막 전체에 걸쳐 광범위한 EFMB 네트워크를 공개했으며, 개별 섬유는 단면에서 측정할 때 직경이 100-200 nm인 것으로 나타났습니다. 또한 이 EFMB 네트워크는 각질 세포와 밀접하게 연관된 섬유와 함께 각질 세포표면(그림 5)의얕은 질 내로 구성된 것으로 나타났습니다. 성인 각막에서 EFMB 섬유의 발견은 면역금 표지 전송 전자 현미경 검사법 (TEM), 형광 및 공초점 연구를 주도하여 이네트워크(23)의특성을 더욱 이해하였다.
이...

이 프로토콜은 강력한 3D 이미징 기술인 직렬 블록-페이스 스캐닝 전자 현미경 검사(SBF-SEM)를 사용하는 일상적인 방법을 간략하게 설명합니다. SBF-SEM의 성공적인 적용은 적절한 고정 및 조직 염색 기술뿐만 아니라 이미징 설정을 신중하게 고려합니다. 이 프로토콜에는 이 프로세스 전체에 대한 실용적인 고려 사항이 포함되어 있습니다.

생물학적 조직 샘플의 직렬 블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사(SBF-SEM)

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...

직렬 블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사는 3차원 조직 울트라 구조의 전례없는 보기를 제공하고, 이전에 불가능하거나 추구하기가 매우 어려운 질문의 호스트에 응답 할 수 있습니다. 이 기술을 통해 최소한의 조직 충전 및 아티팩트를 사용하여 3차원 데이터 집합을 빠르고 재현가능한 생산할 수 있습니다. 그리고 중요한 것은 매일 수천 개의 이미지를 자동으로 캡처 할 수 있습니다.표준 전송 전자 현미경 검사법은 우수한 세포 울트라 구조를 제공합니다. 그러나 이러한 이미지는 3차원 컨텍스트가 부족하며 해석하기가 어려울 수 있습니다. 직렬 블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사는 복잡한 프로세스의 해석을 허용하는 3차원 컨텍스트를 제공합니다.이 프로토콜은 신뢰할 수 있고 재현 가능하지만 특정 단계는 정밀도가 필요하며 이 방법론의 성공에 매우 중요합니다. 이 비디오에서는 이러한 중요한 단계를 자세히 보여 줍니다. 0.1 의 어금니 나트륨 cacodylate 버퍼에 샘플을 고정 한 후, 포함 2.5% 글루타랄데히드, 2 밀리몰라 칼슘 염화 칼슘, 샘플은 2 밀리미터 큐브보다 큰 블록으로 절단하고, 2 밀리알라 칼슘 클로라이드를 포함하는 0.1 어금니 질화 완충제로 세척한다.조직은 오스뮴 페로시아니드, 티오카르보히드라지드 및 오스뮴 테트리옥사이드로 순차적으로 염색됩니다. 오스뮴 테트산화물 인큐베이션 후, 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 1%수성 우라골 아세테이트로 조직을 치료하십시오. 다음날 아침, 0.066 그램의 납 질산용액을 0.03 의 아파르트 산 용액의 10 밀리리터에 녹이고, 월튼의 납 아스파트액의 pH를 5.5로 조정하기 위해 하나의 정상 수산화 칼륨을 사용합니다.오븐에서 용액을 데운 후, 실온, 이중 증류수에서 세척당 3분 동안 티슈를 5회 세척한 후, 조직을 60°C로 옮기고 월튼의 납 인산액을 섭씨 60도에서 30분 동안 데워버링합니다. 인큐베이션이 끝나면 조직을 씻고 차가운 아세톤 시리즈에서 탈수한 다음 실온 아세톤에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 회전 플랫폼에 4시간 동안 아세톤에 하드 혼합 수지의 1:3 비율로 조직을 배치한 다음 회전 플랫폼에서 아세톤 용액에 대한 수지의 1:1 비율로 8시간 또는 하룻밤 사이에 침투한 다음, 회전 플랫폼에서 3:1 비율로 재톤을 아세톤에 침투합니다.다음 아침, 새로운 100%수지에서 4-8시간, 하룻밤 1회, 회전하는 플랫폼의 실온에서 4시간 동안 침투합니다. 다음 아침, 수지가 분말로 포화 될 때까지 소량의 수지와 탄소 검은 색 분말을 혼합하기 위해 나무 막대기를 사용하지만 여전히 유체이며 거칠지 않습니다. 레지던스는 두꺼운 잉크를 닮아야하며, 눈에 보이는 덩어리없이 천천히 물방울이 실리콘 고무 금형에 조직 샘플을 배치하고 수지 블록 내의 샘플 방향을 나중에 참조하기위한 이미지를 캡처 할 수 있어야합니다.시료가 제자리에 있을 때, 실리콘 몰드 의 끝에 있는 탄소 흑색 포화 수지의 조직을 커버하고, 수지의 반대쪽 끝에 곰팡이에 실험 및 조직 세부 사항을 나타내는 라벨을 부착한다. 그런 다음 금형을 섭씨 65도 오븐에 약 1시간 동안 경사로 놓습니다. 탄소 검정 주입 된 수지가 충분히 경화되면 오븐에서 금형을 제거하고 빈 우물로 시작하여 금형의 나머지 부분을 투명 수지로 채우고 라벨이 그대로 유지되는 것을 주의하십시오.시료가 투명한 수지로 덮여있을 때 실리콘 몰드을 경사가 아닌 섭씨 65도 오븐에 다시 넣고 48 시간 동안 금형을 제거하십시오. 이미징을 위해 블록을 준비하려면 수지 임베디드 시편을 미세토메 척에 놓고 테이퍼 엔드가 척에서 약 5~6밀리미터 튀어나와 놓습니다. 시편을 세트 나사로 제자리에 고정하고 시편을 열램프 아래에 놓습니다.몇 분 후, 척을 스테레오 현미경 홀더에 넣고, 조직이 보일 때까지 블록 면에 평행하게 얇은 섹션을 만들기 위해 새로운 양날면도날을 사용하여 조직이 없는 수지의 부분에 비해 반사가 적고 과립이 됩니다. 트리밍 핀 홀더에 알루미늄 시편 핀을 고정하고 핀 의 얼굴에 여러 개의 깊고 교차 스크래치를 만들어 시편을 제자리에 고정하는 데 사용되는 접착제에 대한 더 큰 표면적을 제공합니다. 시편을 열램프 아래에 놓고 면도기를 1~2밀리미터 아래로 밀어 서 두 번째, 블록에 동등한 깊이의 수직 절단을 하기 전에, 블록이 높이에서 직경 이 약 3밀리미터되도록 조직 샘플에서 초과 수지를 다듬는다.이 초기 트리밍 후, 다시 열 램프 아래 블록을 따뜻하게하고, 하나의 부드러운 컷에서 트리밍 부분 아래 약 1 밀리미터 수지 블록의 상단을 잘라 새로운 양날 면도날을 사용합니다. 절단 알루미늄 핀을 포함하는 트리밍 핀 홀더를 스테레오현미경 리셉터클에 넣고, 눈에 보이는 반월 상연을 형성하지 않고 핀을 완전히 덮도록 핀 면에 얇은 층의 시아노아크라일트 접착제를 적용합니다. 집게를 사용하여 트리밍된 조직 블록을 시편 핀 면 중앙에 몇 초 동안 누르고 접착제가 몇 분 동안 설정되도록 합니다.접착제가 철저히 건조되면 수지 블록의 제기 된 부분에 조직을 찾아 내고 양날 면도기를 사용하여 조직 샘플을 포함하는 수지의 제기 된 부분을 1 평방 밀리미터 이하의 영역으로 다듬습니다. 천천히 조심스럽게, 가능한 한 많은 과잉 수지를 제거하고 블록을 한 차원으로 약간 더 길게 두고, 최종 금속 파일을 사용하여 핀의 가장자리를 향해 조직 샘플을 포함하는 제기 된 부분의 외부 영역에서 과도한 수지를 각도로 합니다. 준비된 시료에서 수지 입자와 먼지를 제거한 후 얇은 은페인트와 금스퍼터링을 전체 시료 블록 표면에 적용합니다.코팅 후 블록 페이스 표면에서 여분의 실버 페인트를 다듬고, 적절한 라벨이 부착된 맞춤형 전송 파이펫 튜브의 구근 끝에 장착및 트리밍 블록을 배치합니다. SBF-SEM 이미징을 사용하여 성인 마우스 각막 내에서 엘라스틴이 없는 마이크로피브릴 번들 네트워크가 확인되었습니다. 이 네트워크는 각질 세포와 밀접하게 연관된 섬유와 함께 뚜렷한 층으로 구성되며, 심지어 각질 세포 표면의 얕은 질 내에 누워 있습니다.이 프로토콜의 응용 프로그램은 기질 상피 국경에서 기저 상피 세포와 융합 중앙 각막 신경의 이전에 알려지지 않은 인구의 발견으로 이어졌다. 중앙 각막의 SBF-SEM 이미징은 3D 재건을 위해 수동으로 분할될 수 있는 사지 혈관, 신경 번들 및 관련 세포의 존재를 보여줍니다. 이 이미징 절차의 일부 함정에는 너무 긴 픽셀 거주 시간을 사용하여 후속 이미지가 물결 모양과 왜곡될 수 있으며, 블록 면에서 전자의 작은 방전이 발생하여 선의 급격한 대비 변화, 칼 의 가장자리에 손상된 칼 또는 파편이 축적되어 블록 면에 칼 스크래치가 급격히 변하는 것을 포함합니다. , 확장전자빔으로부터의 유물은 샘플이 이미징 챔버에 남아 있는 동안 블록 면에 초점을 맞추고, 부적절한 조직 고정, 세포 구조 및 결합 조직의 분리로 이어지는, 조직 또는 수지 블록 내에서 다량의 충전의 결과로 영상 건너뛰기.조직 블록을 절단 할 때, 조직이 블록 내에 어디에 있는지 잘 이해하는 것이 중요합니다, 그래서 실수로 어떤 중요한 샘플 영역을 손질하지 않도록. 특정 세포 구조 또는 상호 작용의 높은 해상도 이미지가 원하는 경우, 이미징을 중단 할 수 있습니다, 현미경에서 제거 블록, 그들은 전송 전자 현미경 직렬 블록 얼굴 스캔 전자 현미경 검사전자 현미경 검사에서 볼 수있는 초미세 토메에 절단 섹션생물학적 조직의 전적으로 독특한 보기를 할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하여 품질 데이터 집합을 신속하게 획득하고 탐색할 수 있는 조직의 범위를 확장할 수 있었습니다.

serial-block-face-scanning-electron-microscopy-sbf-sem-biological

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 프로토콜은 수지 내장 뇌 조직은 전자 현미경을 스캐닝, 초점을 맞춘 이온 빔의 3 차원에 준비하고 몇 군데 수있는 방법에 대해 설명합니다.

초점을 맞춘 이온 빔은 밀링 및 뇌 조직의 전자 현미경을 스캐닝

출처: Mukherjee, K., et. al. 연속 블록면 주사 전자 현미경을 사용한 뇌 미토콘드리아의 분석.J. Vis. Exp. (2016)이 비디오는 준비 과정을 보여줍니다.  미토콘드리아 초미세 구조를 시각화하기 위해 연속 블록 페이스 주사 전자 현미경(SBFSEM)을 사용하여 마우스 뇌 조직의 이미징 및 분석을 통해 축삭 및 수지상 신경 세포 구획의 형태 및 공간 분포를 정밀하게 매핑할 수 있습니다.

 Imaging of Neuronal Mitochondria Using a Serial Block-Face Scanning Electron Microscope(직렬 블록면 주사 전자 현미경을 사용한 신경 미토콘드리아의 이미징)

여기에서는 공초점 및 직렬 블록면 주사 전자 현미경을 연결하여 고유 조직에서 특정 세포의 미세 구조를 밝히는 cocem3D 방법을 소개합니다.

특정 감각 세포의 상호 공 초점 및 3D 전자 현미경

포유류 뇌 조직에서 미토콘드리아 시각화 및 분석은 어려운 작업입니다. 여기에서는 연속 블록면 주사 전자 현미경(SBFSEM)의 3차원(3D) 재구성 분석을 사용하여 이 중요한 에너지 생성 소기관의 형태학적 및 체적 분석에 대한 통찰력을 얻는 방법을 설명합니다.

직렬 블록 얼​​굴 스캐닝 전자 현미경을 사용하여 뇌 미토콘드리아 분석

이 보고서는 두꺼운 생물학적 표본의 주사 투과 전자 단층 촬영을 수행하기 위한 샘플 준비 프로토콜과 특정 이미징 조건을 설명합니다.

주사 투과 전자 단층 촬영에 의해 준비 및 두꺼운 생물 샘플의 관측

이 프로토콜 이미징 나노 해상도 스캐닝 전자 현미경 (SEM)을 사용 하 여 조직에서 특정 셀을 대상. 가벼운 현미경 목표를 식별 하 고는 SEM.에서 계층적 방식으로 다 수 생물학 물자 수 지 포함에서 직렬 섹션의 처음 몇...

큰 볼륨 내에서 특정 세포 목표를 찾아내기를 위한 직렬 섹션의 복합 계층적 이미징

여기에 우리가 두 개의 샘플 처리 기술, 냉동 고압을 결합에 대 한 프로토콜을 현재 그리고 전자 레인지를 이용한 샘플 처리, 집중 된 이온 빔 스캐닝 전자 현미경 (SEM 거짓말)와 데이터 획득에 대 한 포함 하는 최소한의 수 지. 이 마우스 tibial 신경 샘플와 꼬마 선 충을 사용 하 여 보여 줍니다.

고압 냉동, 전자 레인지를 이용한 콘트라스트 향상, 그리고 볼륨 이미지에 대 한 포함 하는 최소한의 수 지에 의해 생물학 견본 준비

여기서, 우리는 관심 있는 지역을 표적으로 하기 위하여 직렬 블록 면 및 집중된 이온 광선 주사 전자 현미경 을 능등하게 결합하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이를 통해 3차원으로 효율적으로 검색하고 넓은 시야에서 드문 이벤트를 찾을 수 있습니다.

직렬 블록 얼굴 및 집중된 이온 빔 검사 전자 현미경 검사법을 사용하여 표적으로 한 연구 결과

직렬 블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사(SBEM)는 뮤린 해마의 수지상 척추를 이미지 및 분석하기 위해 적용된다.

수지상 척추 연구를 위한 직렬 블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사(SBEM)

기본 기술과 투과 전자 현미경에 의한 검사에 대한 생물 표본 및 나노 물질의 동결 골절 처리의 개선이 설명되어 있습니다. 이 기술은 미세 기능과 생체막의 전문을 공개 및 재료 과학 및 나노 기술 제품에 미세 수준의 차원과 공간 데이터를 얻기위한 바람직한 방법이다.

생물 전자 현미경에서 동결 골절 / 동결 에칭의 기본 기술 요소

학습하세요 생물학적 조직 샘플의 직렬 블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사(SBF-SEM) 기법을 통해 3차원 조직 초미세 구조를 정밀하게 관찰하는 방법을 배우세요. 이 프로토콜은 고해상도 3D 데이터셋 생성에 필수적입니다.

생물학적 조직 샘플의 직렬 블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사(SBF-SEM)

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