Name: 소설 인간 오르가노피 망막 문화 기술의 특성화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: 학습하세요 인간 오르가노피 망막 문화 기술을 사용하여 망막, RPE-맥락막, 겨막을 보존하는 삼중층 외식편을 만드는 방법을. 이 프로토콜은 망막 질환 연구와 신약 개발에 활용됩니다.

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저자는 눈 조직의 관대 한 기부자와 뉴질랜드 국립 안과 은행의 팀에게 그들의 지원에 감사드립니다. 이 작품은 모리스와 필리스 페이켈 트러스트와 오클랜드 의학 연구 재단 (1117015)의 프로젝트 보조금에 의해 재정적으로 지원되었다. IDR의 이사직은 부캐넌 자선 재단의 지원을 받고 있습니다. CK의 장학금은 뉴질랜드 검안사 교육 연구 기금(CC36812)에서 제공하며, HHL의 장학금은 부캐넌 자선 재단에서 제공합니다.

인간 기증자 눈 컵은 이식을 위한 각막 절제에 따라 뉴질랜드 국립 안과 은행에서 얻었으며 북부 B 건강 및 장애 윤리위원회 (NTX/06/19/CPD/AM07)의 승인을 받았습니다.
참고: 배양은 멸균 조직 배양 조건을 보장하기 위해 Class II 생물 안전 캐비닛에서 수행해야 합니다. 조직은 상당한 망막 무결성 손실을 피하기 위해 24 시간 사후 평가 내에서 배양되어야합니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62046/62046fig02.jpg"> 그림 2: 샌드위치 망막 내출기 의 절차를 보여주는 이미지. 절제 준비를 위해, 하나의 날카로운 팁과 하나의 무딘 끝으로 해부 가위를 사용, 무딘 끝은 절개 하는 동안 조직 손상을 줄이기 위해 세계의 내부를 향하고. 또한 무딘 끝이있는 집게를 사용하여 처리 중에 안구 조직을 긁는 것을 방지하십시오. 외과 가위를 사용하여, 무딘 끝이 내부를 향하고, 홍채와 렌즈(A-C)를제거하기 위해 림두스를 따라 잘라. ONH는 열린 안자(D)를 똑바로들여다보면 위치할 수 있습니다. 무딘 팁과 집게를 사용하여, 지구를 안정화하기 위해 clera를 개최(E). ONH를 향해 두 개의 깊은 절개를 만들어 서 두 개의 반으로 수직으로 지구를 분할하지만 ONH를 통과하지 않습니다. 수평 자오선(G)을따라 이것을 반복합니다. 클era에 무딘 집게를 바르고 클로버 모양(H-K)에부드럽게 지구를 엽니 다. 접힌 망막을 부드럽게 하기 위해 유리체를 조심스럽게 조작하기 위해 집게를 사용하되, 유리체가 망막에 예인선으로 직접 망막을 만지지 는않는다(I). 망막 분리 또는 접기를 일으키는 경우 유리체를 제거합니다(그림 2에 표시되지 않음을 투명 유리체가 사진에 잘 캡처되지 않음). 망막이 평평한 영역을 찾아 외과 트레핀(L)을사용하여 망막 이출을 추출합니다. 클era에 집게를 적용하고, 망막 각질을 미리 준비된 배양배지(M,N)로조심스럽게 이송한다. 전체 샌드위치 는 무게로 인해 우물의 바닥으로 가라 앉혀야하므로 각 각 절제는 매체(O)에잠급니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62046/62046fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
1. 안컵에서 샌드위치 망막 이출
<ol><li>홍채와 렌즈를 제거합니다.<ol>
<li>아이컵을 페트리 접시 안에 놓고, 아이리스와 렌즈가 위쪽으로 향하고 시신경 헤드(ONH)가 페트리접시(그림 2A)에닿습니다.</li>
		<li>집게(도2B)를사용하여 팔다리에서 눈컵을 꾸준히 잡으라.</li>
		<li>홍채와 렌즈를 분리하여 작은 컷을 바깥쪽 가장자리를 따라 둘레로절단하여(도 2A).</li>
		<li>홍채와 렌즈를 조심스럽게 제거합니다. 조작 중 망막을 방해하지 마십시오(도 2C). 참고: 렌즈는 조눌 섬유를 통해 섬모 본체에 부착될 때 아이컵에 속하지 않습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>아이컵을 평평하게 합니다.<ol>
<li>아이컵이 여전히 똑바로 앉아 있는 가운데 ONH를 식별합니다. 이것은 밝은 백색 광원(그림 2D)으로더 쉽습니다.</li>
		<li>ONH(그림2E)를향해 네 개의 사분면에서 절개합니다. 페트리 접시를 회전하여 취급이 용이합니다. ONH를 잘라하지 마십시오.</li>
		<li>눈컵을 조심스럽게 펴고 펴주세요(그림2E).</li>
		<li>망막 무결성을 방해하지 않도록 망막 대신 에 집게를 적용하십시오. 참고: 주변 망막 분리 및 접는 것은 피할 수 없는, 넘쳐 흐르는 유리체의 무게는 망막에 당길 것입니다. 이 지역에서는 유리체를 제거하여 더 이상 망막 접기를 방지합니다. RPE-choroid및 clera 위에 망막을 안정시키기 위하여 잔류 유리체를 남겨두는 것을 기억하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>샌드위치 망막 이출을 수집합니다.<ol>
<li>망막 주름이없는 부위에 망막에 외과 트레핀을 놓습니다(도 2F).</li>
		<li>균열 소리를 생성해야 clera를 관통하기 위해 열심히 누르기.</li>
		<li>트레핀을 180° 비틀어 망막 퇴치가 이제 나머지 조직으로부터 분리되도록 스클레라가 완전히 침투되었는지 확인합니다.</li>
		<li>스클레라에서 집게를 적용하고 샌드위치 망막 을 배양 배지(도2G-I)로옮긴다.</li>
		<li>각 사분면의 주변 망막에서 2-3 샌드위치 망막 이출을 가져옵니다. 참고 : 샌드위치 망막 이절은 때때로 트레핀의 개구부에 갇힐 수 있습니다. 집게를 사용하여, 부드럽게 clera의 기지의 작은 부분을 애타게. 이것은 블레이드가 무딘 때 더 자주 발생하고 망막의 손실을 일으킬 수 있습니다(도 3A-C).</li>
		<li>블레이드가 쉽게 무딘되기 때문에 1-2 망막 이절을 절단 한 후 새로운 트레핀을 사용(그림 3C)<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62046/62046fig03.jpg"> 그림 3: 문제 해결. 추출 과정에서 망막 식소는 외과트레핀(A)의개구부에서 갇힐 수 있다. 망막(B)을만지지 않고, 점막의 기저부로부터 티슈를 부드럽게 애타게 한다. 이것은 수술 트레핀이 블레이드가 쉽게 무딘 될 수 있기 때문에 두 개 이상의 망막 이절을 추출하는 데 사용되는 경우 더 자주 발생할 수 있습니다(C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62046/62046fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
</li>
	</ol></li>
	<li>망막 이양을 배양합니다.<ol>
<li>덜벡코의 변형된 이글 중영양 혼합물 F-12(DMEM-F12)와 1x 항생제 및 항진균 혼합물(AA, 100x 스톡)을 함유한 배양 배지를 준비한다.</li>
		<li>추출하기 전에 24웰 플레이트의 우물에 500 μL의 배지를 놓고 인큐베이터에 평형화하십시오. 이것은 나중에 망막을 빠질 수 있는 매체를 추가하기 때문에 중요합니다.</li>
		<li>샌드위치 망막은 37°C에서 최대 72h의 가습된 5%CO2 인큐베이터에서 1.4.2단계로 제조된 배지로 배양한다.</li>
		<li>DR-like 변경을 유도하기 위하여는, Cyt, TNF-α (10 ng/mL) 및 IL-1β (10 ng/mL)와 32.5 mM HG의 조합으로 DMEM-F12를 포함하는 매체에 있는 배양 망막 이식합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 샌드위치 망막 이출의 파라핀 포함
<ol><li>샌드위치 망막 이출을 수정합니다.<ol>
<li>샌드위치 망막 이절을 10% 포르말린에 24시간 이상 담가 두어 두드시면 됩니다.</li>
		<li>포르말린 용액을 제거하고 샌드위치 망막 이출을 조직 패드와 카세트로 부드럽게 옮길 수 있습니다.</li>
		<li>샌드위치 망막 이출을 70% 에탄올에 담가 24시간 이상 담가 둡니다.</li>
		<li>파라핀이 내장된 망막이 블록에 흘러들어갑니다.</li>
		<li>파라핀 임베디드 망막 조직을 마이크로토메를 사용하여 5 μm 두께의 섹션으로 자르고 유리 슬라이드에 장착하십시오. 이미징까지 실온에서 보관하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>섹션을 분리합니다.<ol>
<li>섹션에 70% 자일렌을 5분 동안 담그면 됩니다.</li>
		<li>섹션에 100% 자일렌을 5분 동안 담그면 됩니다.</li>
		<li>섹션의 70%를 5분 동안 재수화합니다.</li>
		<li>섹션의 100% 에탄올을 5분 동안 재수화합니다.</li>
		<li>흐르는 수돗물 아래에서 10분 동안 섹션을 씻으시면 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. H&amp;E, IHC 및 마그네틱 루미넥스 분석체를 사용한 특성화
<ol><li>H&amp;E 염색 프로토콜<ol>
<li>2.2 단계를 사용하여 섹션을 분리합니다.</li>
		<li>수돗물로 섹션을 5분 동안 수분처리합니다.</li>
		<li>길의 2 헤마톡슬린 용액의 섹션을 5분 동안 얼룩지게 합니다.</li>
		<li>흐르는 수돗물 아래에서 섹션을 철저히 씻어 과도한 얼룩을 제거합니다.</li>
		<li>1% 산성 알코올에 두 번 섹션을 찍어 차별화합니다.</li>
		<li>흐르는 수돗물 아래에서 섹션을 빠르게 씻으시면 됩니다.</li>
		<li>1% 탄산리튬(10 mg/mL)에 6번 찍어 서 섹션블루를 얼룩지게 합니다.</li>
		<li>여분의 푸른 얼룩을 제거하기 위해 5 분 동안 흐르는 수돗물 에서 섹션을 철저히 씻으십시오.</li>
		<li>1% eosin에 섹션을 10 번 찍어.</li>
		<li>여분의 얼룩을 제거하기 위해 수돗물 에서 섹션을 신속하게 씻으시면됩니다.</li>
		<li>100% 에탄올에 10번 찍어 단면을 탈수합니다. 두 번 이 작업을 수행합니다.</li>
		<li>70% 자일렌에 10번 담그세요.</li>
		<li>100% 자일렌에 10번 담그세요.</li>
		<li>디부틸프탈레이트 폴리스티렌 자일렌(DPX) 마운팅 매체를 사용하여 커버슬립을 장착합니다.</li>
		<li>가벼운 현미경을 사용하여 이미지를 가져 가라.</li>
	</ol>
</li>
	<li>IHC 라벨링 프로토콜'<ol>
<li>2.2 단계를 사용하여 섹션을 분리합니다.</li>
		<li>슬라이드를 10m 나트륨 구연산 버퍼가 함유한 용액에 넣고 pH 6.0에서 0.05% Tween 20을 하고 2분 동안 121°C에서 자동화된 압력 밥솥에서 항원 검색을 실행한다.</li>
		<li>인산염 완충식식염수(PBS)의 섹션을 5분 동안 세척합니다. 이 작업을 3번 수행합니다.</li>
		<li>실온에서 0.1% 트리톤 X-100 및 10% 일반 염소 세럼이 포함된 PBS를 통해 섹션을 1시간 동안 차단합니다.</li>
		<li>이차 항체(재료표)에 결합된 1차 항체를 가진 4°C에서 하룻밤 동안 구역을 배양한다.</li>
		<li>PBS에서 5 분 동안 섹션을 세척하십시오. 이 작업을 3번 수행합니다.</li>
		<li>스테인 핵을 사용 하 여 4′,6-디아미디노-2-페닐린돌 (DAPI) 2 분 동안.</li>
		<li>페이드 방지 시약을 사용하여 섹션을 세척하고 마운트합니다.</li>
		<li>매니큐어로 커버립을 밀봉합니다.</li>
		<li>공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 이미지를 가져 가라.</li>
	</ol>
</li>
	<li>마그네틱 루미넥스 분석<ol>
<li>각각 의 75 μL을 각 우물에서 24 및 72 h의 96-u-bottom 플레이트로 옮기습니다.</li>
		<li>Luminex 사이토카인 분석기를 사용하여 24 및 72h 후 IL-18, IL-6, IL-8 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF)에 대한 세포 상피성을 분석한다. 분석16을수행하기 위해 제조업체의 지침을 따르십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Louie, H. H., Shome, A., Kuo, C. Y. J., Rupenthal, I. D., Green, C. R., Mugisho, O. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin43+hemichannel+block+inhibits+NLRP3+inflammasome+activation+in+a+human+retinal+explant+model+of+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Connexin43 hemichannel block inhibits NLRP3 inflammasome activation in a human retinal explant model of diabetic retinopathy.</a> Experimental Eye Research. , (2020).</li>
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HORC는 현재 전임상 망막 연구에서 가장 임상적으로 번역 가능한 모델입니다. 시험관 내 세포 배양 모델에 비해, HORC는 동적 망막 세포 유형과 뉴런, 혈관 및 세포 외 환경과의 연결을 유지하여 그 자체에서 인간의 망막의 해부학을 더 잘 나타낼 수 있다19. 동물 모델에 비해 HORC는 동물모델(19)에서긍정적인 결과에도 불구하고 실패한 임상 시험에 기여할 수 있는 다양한 망막 세포 유형뿐만 아니라 다양한 광수용체 밀도 및 비율과 같은 종 간 변이로 인한 인간 망막 질환에 대한 약제학적 치료법을 연구하고 설계하는 데 더 유리하다. 그러나, 이전 HORC 프로토콜에서, 망막은 의도적으로 RPE-choroid 및 sclera에서 분리되었습니다. 터프 한 clera없이, 어설픈 망막은 처리하기 어렵고 망막 무결성은 직접 집게6,7,<...

망막은 들어오는 빛 에너지를 전기 신호로 변환하는 고도로 전문화된 안구 구조로, 이는 시각적 지각을 위해 뇌에 의해 처리됩니다. 인간 망막은 2개의 시냅스와 3개의 핵층1(도 1)으로 구성된 독특한 라멜라구조로 고도로 조직된 세포 모형의 다이나믹 범위를 포함합니다. 망막 항상성 신경 망막 세포 사이 복잡 한 연결에 의해 유지, 혈관, 신경, 결합 조직 및 RPE1. 정교한 망막 해부학 및 생리학으로 인해 많은 망막 질환의 메커니즘은 여전히2,3,4,5로제대로 이해되지 않습니다. 망막 질환을 더 잘 연구하기 위해 HORC 모델은6,7,8,9로개발되었습니다. 동물 연구 와 체 외 배양에 비해, HORC 모델은 동적 세포 환경과 장소에서 복잡 한 신경 혈관 상호 작용을 유지 하기 때문에 유리, 임상 번역에 대 한 좋은 모델을 제공.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62046/62046fig01.jpg"> 그림 1: 인간의 눈의 후방 안구 구조. 후방에 전방, 망막 층은 다음과 같습니다: 신경 섬유 층 (NFL), 신경절 세포 층 (GCL), 내부 플렉시폼 층 (IPL), 내부 핵 층 (INL), 외부 플렉시폼 층 (OPL), 외부 핵 층 (ONL), 광수용체 내부 세그먼트 (IS), 및 광수용체 외부 층 (OS). 망막 내의 세포는 신경절 세포 (파란색), 막시음 세포 (노란색), 양극성 세포 (빨간색), 수평 세포 (보라색), 막대 광수용체 (분홍색) 및 콘 광수용체 (녹색)를 포함한다. 유리체는 망막에 앞쪽에 위치하고 있습니다. RPE, 브루흐의 막, 코로이드 및 clera는 망막의 후방에 위치하고 있습니다. 표시된 이미지는 망막의 회로도 표현일 뿐이며 각 층 내의 세포/망막 연결의 비율은 생체 내 설정을 나타내지 않을 수 있다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62046/62046fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
이전에 특징지어진 HORC 프로토콜6,7,8,9는 외과 트레핀을 사용하여 기본 RPE-choroid 및 clera로부터 망막을 분리하는 것을 관련시켰습니다. 그러나 이러한 기본 구조에 의해 제공되는 지원없이, 반투명 망막은 어설프게되고, 처리하기 어렵고 집게와 같은 도구는 쉽게 무결성을 방해 할 수 있습니다. 더욱이, RPE 없이 배양에서 망막을 분리하는 것은 신경절 세포 세포 멸각증 및 광수용체 변성을 유발하는 것으로 나타났다10,11,12. 따라서 망막 무결성의 손실을 최소화하고 생체 내 환경을 더 잘 모방하는 대체 HORC 프로토콜이 유용할 것입니다. 이것은 사지 병 기계장치를 공부할 때 특히 중요합니다, 절제 처리 도중 물리적 상해는 유물을 소개할 수 있기 때문에. 따라서, 이 연구의 목적은 퇴치 처리 및 문화 동안 망막 무결성을 보호하기 위해 RPE-choroid 및 clera를 포함하는 새로운 HORC 모델을 개발하는 것이었습니다.
이러한 목표를 달성하기 위해 잔류 유리체와 기본 RPE-choroid 및 clera 사이에 망막 이출이 "끼워"추출되었습니다. 샌드위치 이병대에서 유리체는 망막 분리 및 접이식을 방지하기 위해 망막 아래로 무게가 있는 반면, 터프하고 섬유질 적인 스클레라는 구조적 지지와 집게의 접점 역할을 합니다. 더욱이, 동물 모델은 배양에서 RPE를 유지하는 것이 망막 변성 및 신경교 증식을 방지할 수 있음을 보여주었으며, 저산소증 및염증(10,11,12)과같은 위험 신호에 뮐러 세포의 반응이다.
모델을 특성화하기 위해, 샌드위치 망막 축출은 헤마톡실린과 에오신(H&amp;E)으로 염색되어 해부학적 구조및 면역조직화학(IHC)을 평가하였다. 말기 탈옥뉴클레오디딜 트랜스포메이션 dUTP 닉 엔드 라벨링(TUNEL, 아팝토틱 세포 마커), 글리아 피브릴레산성 단백질(GFAP, 망막 염증 및 뮐러 세포 활성화 마커), 뮐러 세포 무결성의 마커인 비멘틴을 함유한 라벨링. 이 모델이 분자 질환 징후를 개발하도록 유도될 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 이 세포는 항염증성 사이토카인(Cyt), 인터류킨-1β(IL-1β) 및 종양 괴사 인자-α(TNF-α)를 가진 고혈당(HG)에 노출되었다, 당뇨병 성 망막증(DR)을 모방한 배양환경, 15세포 모두에서 당뇨병 성 망막증(DR)을 모방한배양환경,13. 루미넥스 아사약은 DR 모델에 사용되어 배양 배지로 방출되는 사이토카인을 측정하였다.

<table><tbody><tr><td>일회용 생검 펀치 (5mm)</td><td>Integra York PA Inc., USA</td><td>21909-142</td><td>이 기사에서는 외과용 트레핀 이라고 함</td></tr><tr><td>인간 재조합 IL-1&beta;</td><td>Peprotech, 미국</td><td>200-01B</td><td>작업 농도: 10 ng/mL</td></tr><tr><td>인간 재조합&nbsp; TNF-a</td><td>Peprotech, 미국</td><td>300-01A</td><td>작업 농도: 10 ng/mL</td></tr><tr><td>DAPI (1 &micro; g/mL)</td><td>Sigma Aldrich, 독일</td><td>#D9542</td><td>핵 얼룩. 작동 희석 1:1000</td></tr><tr><td>DMEM/F-12, GlutaMAX supplement</td><td>Gibco, Thermofisher, Scientific Inc., USA</td><td>10565018</td><td>Dulbecco' s Modified Eagle 배지 영양 혼합물 F-12는 1&times를 함유합니다. 항생제와 항진균제 혼합물 (AA, 100&times; stock)</td></tr><tr><td>Fine Scissors - Sharp-Blunt</td><td>Fine Science Tools (F.S.T)</td><td>14028-10</td><td>팁: Sharp-Blunt, 절삭날: 27mm, 길이: 10cm, 합금/재질: 스테인리스강, 톱니 모양: 아니오, 팁 모양: Straight</td></tr><tr><td>Graefe Forceps</td><td>Fine Science Tools (F.S.T)</td><td>11050-10</td><td>길이:10cm, 팁 모양: 스트레이트, 팁: 톱니형, 팁 너비: 0.8mm, 팁 치수:0.8 x 0.7mm, 합금/재질: 스테인리스 스틸</td></tr><tr><td>마우스 단클론 GFAP-Cy3</td><td>Sigma Aldrich, 독일</td><td>#C9205</td><td>Cy3에 접합된 1차 항체. 작동 희석 1:1000.</td></tr><tr><td>마우스 단클론 Vimentin-Cy3</td><td>Sigma Aldrich, 독일</td><td>#C9080</td><td>Cy3에 접합된 1차 항체. 작업 희석 1:50.</td></tr><tr><td>토끼 다클론 TUNEL (In situ cell death Detection Kit, Fluorescein)</td><td>Sigma Aldrich, Germany</td><td>#11684795910</td><td>Fluorescein-dUTP에 접합된 1차 항체. 효소 완충액을 가진 작동 희석 1:10.</td></tr></tbody></table>

소설 인간 오르가노피 망막 문화 기술의 특성화

Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

이전 인간 organotypic 망막 문화 (HORC) 모델은 분리 된 망막을 활용; 그러나 망막 색소 상피-코로이드(RPE-choroid) 및 스클레라에 의해 부여된 구조적 지지없이 연약한 망막의 무결성은 쉽게 손상될 수 있다. 이 연구의 목적은 망막, RPE-choroid 및 clera가 함유 된 새로운 HORC 모델을 개발하여 망막 퇴치를 배양 할 때 망막 무결성을 유지하는 것이었습니다.
홍채와 렌즈를 제거하기 위해 림두를 따라 둘레로 절단 한 후, 4 개의 깊은 절개는 안컵을 평평하게하기 위해 만들어졌다. 이전 HORC 프로토콜과는 달리, 트레핀은 망막뿐만 아니라 RPE-choroid 및 clera를 통해 절단하는 데 사용되었다. 결과 삼중층 이절은 72시간 동안 배양되었다. 헤마톡시린과 에오신 염색(H&E)은 해부학적 구조와 망막 박출을 평가하는 데 사용되었고, 세포 무결성 및 망막 염증을 위한 면역 조직화학(IHC)을 더욱 특징으로 하였다. 질병 유도의 가능성을 확인하기 위해, 이질은 당뇨병 성 망막병증 (DR)을 모방하기 위해 높은 포도당 (HG) 및 프로 염증 성 사이토카인 (Cyt)에 노출되었다. 루미넥스 자기 비드 분석은 배양 배지로 방출된 DR 관련 사이토카인을 측정하는 데 사용되었습니다.
H&E 염색은 기본 RPE-choroid 및 clera와 망막 에 있는 뚜렷한 망막 라멜라 및 소형 핵을 드러내고, 근본적인 구조물이 없는 망막은 감소된 두께 및 가혹한 핵 손실을 나타내었다. IHC 결과는 세포 질과 망막 염증의 부재뿐만 아니라 보존 뮐러 세포 무결성을 나타냈다. Luminex assays는 24시간 기준수준에 비해 HG + Cyt에 노출된 망막 이식에서 DR-관련 프로 염증 성 사이토카인의 분비를 현저히 증가시켰습니다.
우리는 성공적으로 개발 하 고 망막 무결성 세포사멸 또는 망막 염증 없이 보존 하는 새로운 HORC 프로토콜을 특징으로. 더욱이, HG + Cyt에 망막 이질을 노출할 때 DR 관련 프로 염증성 바이오마커의 유도된 분비는 이 모형이 임상적으로 전도성 망막 질병 연구 결과에 사용될 수 있었다는 것을 건의합니다.

망막 무결성은 이 HORC 모델에 보존되었습니다. 망막 무결성은 배양 샌드위치 망막 이분야에서 보존되었지만 인접한 구조물없이 배양된 망막에서 손실되었습니다. H&amp;E는 문화에서 72시간 이후에 단면 샌드위치 망막 의 구조적 무결성을 검사하기 위해 실시되었습니다. 샌드위치 망막 이출은 INL 및 ONL(도 4A)에서컴팩트 한 핵을 가진 GCL에서 ONL에 대한 뚜렷한 라멜라 구조를 보존하는 무결성과 뚜렷한 라멜라 구조를 보였다. 그러나, 망막 무결성이 동일한 샘플의 가장자리에서 발견되었으며, 망막은 기본 RPE-choroid 및 clera로부터 분리되어 INL 및 ONL(그림4B)에서핵의 감소된 망막 두께 및 분리 손실을 나타냈다.
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이 연구는 절제 처리 중 망막 무결성을 손상시키는 것을 방지하는 새로운 인간 organotypic 망막 문화 (HORC) 모형을 개발하는 것을 목표로 합니다. 이것은 과대 유리체와 근본적인 망막 안료 상피 코로이드 (RPE-choroid) 및 clera로 망막을 배양해서 달성됩니다.

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal ...

이 기술은 모든 망막 층과 세포 유형을 앉아서 보존하여 동물 및 체외 모델에 비해 임상적으로 더 관련성이 있습니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 건강하고 병들인 망막을 비교할 때 필수적인 조직 취급 도중 망막 무결성 중단을 최소화한다는 것입니다. 망막 질환은 특정 조건하에서 조직을 배양하여 모방 될 수 있습니다.이것은 새로운 약 치료의 시험을 허용합니다. 해부 및 샘플 수집 절차는 복잡합니다. 따라서 시각적 데모는 독자가 서면 프로토콜을 이해하고 절차를 성공적으로 수행하는 데 매우 중요합니다.절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 2 학년 박사 과정 학생 인 Charisse Kuo가 될 것입니다. 덜벡코의 변형된 이글 중간/영양 혼합물 F-12및 항생제 및 항균제 혼합물을 1회 포함하는 배양 배지를 준비한다. 첫째, 500 마이크로리터의 매질을 24웰 플레이트에 놓고 가습된 인큐베이터에서 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 상응한다.엑셀추출 전에 미디어를 준비하면 후속 첨가 시 망막이 해소되는 것을 방지할 수 있습니다. 망막 이출을 추출하기 위해, 아이리스와 렌즈가 위쪽으로 향하고 ONH가 페트리 접시에 닿는 페트리 접시에 안컵을 놓는 것으로 시작합니다. 집게를 사용하여 림푸스에서 안컵을 안정적으로 잡고 홍채와 렌즈를 분리하여 팔다리의 바깥쪽 가장자리를 따라 둘레작은 상처를 줄수 있습니다.홍채와 렌즈를 조심스럽게 제거하여 망막을 방해하지 않도록하십시오. 밝은 백색 광원을 사용하여 ONH를 식별하고 4개의 사분면에서 페트리 접시를 회전시키는 ONH를 향해 절개하여 취급이 용이합니다. 조심스럽게 안컵을 펴고 평평하게 펴주세요.망막 무결성을 방해하지 않도록 망막 대신 에 집게를 적용합니다. 인큐베이터에서 준비된 미디어를 포함하는 플레이트를 제거합니다. 망막 주름없이 지역의 망막에 외과 트레핀을 놓고 페트리 접시를 돌파할 때 균열 소리를 생성해야하는 clera를 관통하기 위해 열심히 누르는다.트레핀을 회전하여 망막 퇴치가 시료의 나머지 부분과 분리되도록 스클레라가 완전히 침투되었는지 확인합니다. 클era에서 집게를 적용하고 샌드위치 망막 을 배양 매체로 옮기. 수집된 샌드위치 망막은 가습된 5%의 이산화탄소 인큐베이터에서 최대 72시간 동안 섭씨 37도에서 이출됩니다.헤마톡슬린과 에신 염색은 샌드위치 망막 이절이 GCL에서 ONL에 이르는 뚜렷한 라멜라 구조와 내부 및 외부 핵 층의 소형 핵을 가진 뚜렷한 라멜라 구조를 보존하는 것으로 나타났다. 망막 무결성을 중단한 망막 무결성은 INL 및 ONL에서 감소된 망막 두께 및 핵 손실을 보여주는 근본적인 RPE choroid 및 clera에서 분리된 동일한 견본의 가장자리에서 찾아냈습니다. 세포 세포 세포 멸망증을 표시하는 TUNEL 양성 세포 핵은 기초 조건에서 배양된 망막 이병에서 발견되지 않았으며 72시간 후에도 지속적인 세포 활력을 입증했습니다.GFAP 라벨링은 신경교 섬유증없이 GCL및 IPL로 제한되었다, ONL로 GFAP의 확장 된 발현으로 식별 될 병리학의 표시. Vimentin은 신경절 세포 층에서 외부 핵 층으로 높게 표현되었으며, 정상적인 망막 조직에서 볼 수 있듯이 보존된 뮬러 세포 무결성을 보여 주었습니다. 루미넥스 자기 분석은 IL-18, VEGF, IL-6 및 IL-8 수준이 24시간 후에 높은 포도당 및 프로 염증성 사이토카인에서 샌드위치 망막 박종 배양에서 기준선보다 현저히 증가하는 것으로 나타났다.후 72 시간, IL-18 및 VEGF 수준 크게 증가 남아, 하지만 IL-6 및 IL-8 수준에서 중요 한 차이 발견 되었다. 이 절차를 수행 할 때, 충분한 잔류 유리체를 두고, 이는 RP choroid에서 분리하고 문화 매체에 떠 있지 않도록 아래로 망막의 무게를 둡니다. 배양된 망막은 면역히스토케와 히스토론을 사용하여 더욱 특징지어질 수 있으며, 배양 배지로 방출되는 염증성 사이토카인은 루미넥스 자기 분석기를 사용하여 측정될 수 있다.이 모델은 동물 및 체외 모델에 비해 임상적으로 더 이상 번역할 수 있으며, 이는 망막 질환에 대한 새로운 치료 약물의 효능을 테스트하는 데 더 적합합니다.

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