포유류 정자 세포의 원형질막을 가로지르는 전기 전류 기록

패치클램프 기법을 이용한 정자 세포의 전기 활동을 기록하는 것은 다양한 정자 이온 채널을 식별하고 분자 수준에서 정자 전기생리학을 이해하는 데 중요한 역할을 해왔습니다. 이 방법은 이온 채널의 전기생리학적 및 약리학적 지문을 측정하는 데 탁월하며, 이온 채널 식별에 가장 신뢰할 수 있는 도구입니다. 남성 생식력에 있어 이온 채널과 전기성 수송체의 생리학적 중요성을 고려할 때, 이 기술은 불임을 초래하는 특정 정자 결함을 이해하는 데 강력한 도구입니다.

마이크로피펫 제작의 경우, 외경 1.5mm, 내경 0.86mm, 내부 필라멘트를 가진 붕규산 유리 모세관부터 시작합니다. 파이어 폴리싱 전에는 피펫 팁의 내경이 약 2마이크로미터 정도 되도록 하고, 적절한 연마 후에는 0.5마이크로미터로 줄여야 합니다. 기준 전극 주변 환경을 안정적으로 유지하기 위해 한천 브리지를 조립하세요.

작은 분젠 버너 불 아래에서 구부려서 L자형 유리 모세관을 만들어 식히세요. 1% 아가로스 용액을 1몰 염화칼륨에 넣어 전자레인지에 가열해 아가로스가 녹아 용액이 투명해질 때까지 가열합니다. L자형 유리 모세관에 방울을 조심스럽게 채워 기포를 피하고 실온까지 식히세요.

또는 L자형 유리 모세관을 녹인 아가로스에 담그게 할 수도 있습니다. 용기를 여러 번 돌리고 전자레인지에 다시 가열해 아가로스가 끓으면 한천 다리에서 공기 방울이 배출됩니다. 가위로 쥐의 하복부를 열어 두 개의 부고고를 모두 제거하세요.

이들을 35밀리미터 세포 배양 접시에 넣고, 고염수 또는 HS 용액을 실온으로 예열한 상태로 채워 넣으세요. 부고지디미데스를 HS 용액이 포함된 새로운 세포 배양 접시로 옮기고 잔류 지방을 철저히 제거합니다. 부고간을 15번 메스날로 캡, 코퍼스, 꼬리로 분리합니다.

각 부고환의 코퍼스를 HS 용액이 포함된 새로운 세포 배양 접시로 옮깁니다. 부고지 고립된 부위에는 뾰족한 번호 11 메스날로 여러 번 절개하세요. 여러 번 절개한 부고환 부위를 1.5밀리리터 마이크로 원심분리관에 1.5밀리리터 HS 용액을 넣어 옮깁니다.

Superfine Dumont Type 5A 겸자를 사용해 부고환에서 정자를 잠시 흔들어 용액에 넣습니다. 그 후 부고지디미디를 버리고 튜브를 실온에 10분간 두세요. 고체 물질이 튜브 바닥에 침전될 때까지 기다립니다.

그 후 상청액을 또 다른 1.5밀리리터 마이크로 원심분리관으로 옮깁니다. 600배 배율로 세포질 방울을 가진 적합한 정자를 찾으세요. 세포질 방울이 타원형이고 약간 길쭉한 방추 모양을 가지도록 하세요.

정자가 부분적으로 고정되지만, 세포질 방울과 나머지 편모세포는 편모 박동과 함께 계속 움직이는 정자(운동성 정액)를 선택한다. 정자의 머리가 덮개 슬립에 느슨하게 부착되어 있는지 확인하세요. 적절한 형태를 가진 정자를 시각적으로 선택한 후, 마이크로피펫에 피펫 용액을 채우고 피펫 홀더에 고정합니다.

피펫 팁을 이물질로부터 깨끗하게 유지하기 위해 U-튜브 모양 어셈블리를 사용해 피펫에 양압을 가하세요. 피펫을 내리고 끝을 욕조 용액에 담그세요. 세포를 명확히 시각화하기 위해 피펫 팁을 세포질 방울 위에 위치시켜 팁 입구가 방울 쪽으로 대각선으로 정렬되도록 합니다.

피펫 끝을 빠르게 방울 쪽으로 내리어 같은 초점면에 맞추세요. 피펫 끝이 드롭에 닿는 순간, 피펫에 음압을 가해 피펫의 일부를 팁 안으로 이동시키고 기가옴 씰을 형성합니다. 그 다음 정자를 덮개 슬립에서 들어 올려.

증폭기의 보상 모드를 사용해 스트레이 커패시턴스 과도를 보상한 후 전체 셀 모드로 전환합니다. 1밀리초 동안 점진적으로 증가하는 전압 펄스와 매우 약한 흡입력을 결합하여 전체 셀 모드로 전환하는 브레이크인을 수행합니다. 각 브레이크인 전압 펄스를 적용한 후, 멤브레인 테스트 도구를 실행하여 더 큰 정전 용량 전환이 나타나는지 확인합니다.

더 큰 정전용량 과도성을 맞춰 전체 셀의 정전용량과 접근 저항을 결정합니다. 성공적인 침입 후에는 다양한 화합물을 포함한 다양한 욕조 용액을 적용하거나 전압 단계 또는 전압 램프 프로토콜을 이용한 채널 활동 측정과 같은 계획된 전셀 패치클램프 실험을 진행하세요. CatSper 기록은 패치 피펫과 포유류 정자의 세포질 방울 사이에 높은 저항성 밀봉을 형성하여 수행되었습니다.

세슘 전체 세포 CatSper 전류 밀도는 꼬리형 야생형 신경세포와 CatSper 결핍 꼬리 신경 정자 세포에서 기록되었습니다. 서로 다른 종의 정자는 형태와 내부 조절 경로에서 다양합니다. 영장류와 인간 정자는 유사한 CatSper 채널 특성과 조절을 보였습니다.

흥미롭게도, CatSper의 프로게스테론 활성화는 영장류 정자에서만 독특한 것으로 보입니다. 멧돼지, 황소, 설치류의 정자는 CatSper 전류에 프로게스테론 자극으로 인한 변화를 보이지 않았습니다. 황소와 멧돼지 정자에서는 기저 CatSper 채널 활동도 검출 가능한 한계 이하였으며, 이는 칼슘 유입과 그에 따른 과활성화가 다른 채널이나 수송체에 의해 유발되었거나, CatSper 채널 활성화를 위해 다른 자연 자극제가 필요함을 시사합니다.

작고 매끄럽고 균일하며 과도하게 부풀지 않은 세포질 방울은 패치 클램프에 가장 적합합니다. 아주 작고 한쪽 부풀어 오른 완전히 투명한 세포질 방울은 약하거나 밀봉이 없어지기 때문에 피하는 것이 좋습니다. 이 기법은 자연 발현 시스템 내 특정 공기 통로를 상세히 연구할 수 있게 하며, 성공은 고품질의 가변 정자 세포, 순수 영역, 기본 지적 생리학 기술, 인내심, 그리고 무엇보다도 끈기에 달려 있습니다.