Name: 물방울 배열을 사용하여 방사성 화학 반응의 최적화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-12T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: 배우세요 물방울 배열을 이용한 방사성 화학 반응 고속 최적화 방법입니다. 단일 칩에서 16개 병렬 반응을 수행하여 시약 소모를 100분의 1로 줄이고 Fallypride 합성 조건을 효율적으로 최적화할 수 있습니다.

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우리는 UCLA 생물 의학 사이클로트론 시설과 박사 로저 슬라빅과 박사 주세페 칼루치 관대 이러한 연구에 대한[18F] 불소를 제공하고 칩 제조를위한 장비와 UCLA 나노 랩을 제공 감사드립니다.

주의: 이 프로토콜은 방사성 물질의 처리를 포함합니다. 필요한 교육 및 개인 보호 장비 및 조직의 방사선 안전 사무소의 승인 없이는 실험을 수행해서는 안 됩니다. 실험은 방사능 차폐 뒤에 수행되어야하며, 바람직하게는 환기 된 열세포에서 수행되어야합니다.
1. 다중 반응 칩의 제조
참고: 다중 반응 마이크로 드롭렛 칩의 배치는 표준 포토리소그래피 기술을 사용하여 4"실리콘 웨이퍼에서 제조되며, 이전에 는10 (그림 1). 이 절차는 반응 사이트의 4 x 4 배열각각 7 칩을 생성합니다.
<ol><li>실리콘 웨이퍼를 스핀 코터 척에 배치하여 중앙에 배치합니다. 30s(500rpm/s 램프)에 대한 1000rpm에서 이송 파이펫과 코트 웨이퍼로 웨이퍼 의 중앙에 폴리테트라플루오로틸렌 용액을 3mL로 증정한다.</li>
	<li>코팅을 고화시키기 위해 웨이퍼를 160°C 핫플레이트에 10분 간 배치한 다음 245°C 핫플레이트로 10분 간 옮김합니다.</li>
	<li>질소 대기 하에서 3.5 시간 동안 340 °C에서 고온 오븐에서 코팅을 한 다음 10 °C / min 램프에서 70 °C로 냉각됩니다.</li>
	<li>실리콘 웨이퍼를 스핀 코터 척에 배치하여 중앙에 배치합니다. 이송 파이펫을 사용하여 웨이퍼 의 중앙에 2 mL의 포지티브 포토 저항을 붓고 30 s (1000 rpm / s 램프)에 대한 3000 rpm에서 코팅을 수행합니다.</li>
	<li>115°C 핫플레이트에서 웨이퍼의 부드러운 베이킹을 3분간 수행하여 포토레지스트를 고성화한다.</li>
	<li>웨이퍼와 포토마스크를 마스크 라이너에 설치하고 하드 컨택 모드에서 12mW/cm2 램프 강도 및 356 nm 파장에서 14s 노출을 수행합니다. 이 단계는 반응 부위가 투명하고 불투명한 색상의 다른 모든 영역과 함께, 즉, 16 반응 칩의 4 카피의 4 "직경 패턴, 즉, 4 "직경 패턴을 포함하는 투명 마스크를 사용합니다.</li>
	<li>20mL의 포토레지스트 개발자 용액을 유리 용기에 넣고 3분 동안 약간의 동요를 통해 노출된 패턴을 개발하여 웨이퍼를 잠급한다.</li>
	<li>웨이퍼를 20mL의 DI 워터가 있는 유리 용기에 약간의 교반으로 3분간 침수하여 개발 용액을 씻어내라. 질소 총으로 웨이퍼를 건조시십시오.</li>
	<li>30s 노출, 100 mTorr 압력, 200W 전력 및 50 sccm 산소 흐름 : 다음과 같은 조건하에서 산소 플라즈마와 반응 이온 에칭 (RIE)을 통해 노출 된 폴리테트라 플루오로에틸렌 영역을 제거합니다.</li>
	<li>실리콘 웨이퍼 커터를 사용하여 웨이퍼를 개별 칩(웨이퍼 당 총 7개)으로 주사위.</li>
	<li>각 칩을 아세톤에 1분 간 담그고 포토레지스트를 제거한 다음 이소프로파놀을 1분 동안 제거합니다. 마지막으로, 질소 총으로 각 칩을 건조.</li>
	<li>드라이 칩을 유리 용기에 넣고 알루미늄 호일로 덮어 보관하십시오.</li>
</ol>2. 최적화 연구 계획
참고: 본 프로토콜에서, 방사성 약제의 합성[18F]fallypride는 고처리량 최적화를 예시하는 예로 사용된다(도2). 단일 칩을 사용하면, 16개의 동시 반응이 다양한 전구체 농도(8개의 상이한 농도, n=2는 각각 복제)로 수행될 수 있다. 조건은 그림 3A의반응 사이트에 매핑됩니다. 다른 반응 매개 변수(예: 반응 용매, 반응 부피, TBAHCO3의 양 등) 또는 기타 방사성 의약품을 최적화하기 위해 이 프로토콜을 조정할 수 있습니다.
<ol><li>다양할 반응 매개 변수, 사용할 특정 값 및 복제 수를 선택합니다.</li>
	<li>실험을 수행하는 데 필요한 칩 수를 계산합니다.</li>
	<li>각 칩에 대해, 시약 준비와 물방울 반응을 수행하는 데 도움이 각 반응 부위에서 반응 조건이 사용되는지도를 준비합니다.</li>
</ol>3.[18F]의 방사합성 최적화를 위한 시약 및 재료 준비[18F][fallypride]]
참고:[18F]fallypride(도 2)의액적 기반 방사성 합성은[18F]불소 및 위상 전달 촉매(TBAHCO3)를반응 부위에 첨가한 후 가열하여 물을 증발시키고 건조잔류를 남기는 것으로 시작됩니다. 다음으로, 반응 용매(thexyl 알코올 및 아세토나이트)의 전구체(tosyl-fallypride)의 액적액을 첨가하고 가열하여 방사선 불화 반응을 수행한다. 마지막으로, 원유 제품은 분석을 위해 칩에서 수집됩니다. 다른 트레이서의 최적화를 수행하는 경우 시약 제제 및 합성 절차를 조정해야 합니다.
<ol><li>1:1 부피 혼합물로 염실 알코올 및 아세토나이트로 구성된 반응 용매의 스톡 용액을 준비한다. 볼륨이 계획된 희석 계열을 만들기에 충분한지 확인합니다. 이 예제 최적화에서는 ~30 μL이 충분합니다.</li>
	<li>탐사할 최대 농도(77mMM)를 사용하여 반응 용매에 전구체(tosyl-fallypride)의 30 μL 스톡 용액을 준비한다. 볼륨이 계획된 실험을 수행하기에 충분한지 확인합니다. 이 예제 최적화에서는 ~30 μL이 충분합니다.</li>
	<li>전구체 스톡 용액 및 반응 용매에서, 전구체 용액의 상이한 농도를 준비하기 위해 2배 직렬 희석을 수행한다. 각 희석의 양이 각 조건에 대해 원하는 복제 수를 수행하기에 충분한지 확인합니다. 이 예최적화에서는 각 농도의 ~15 μL이 충분합니다.</li>
	<li>마이크로센심분리기 튜브를 준비하여 영구 마커를 사용하여 각 조반응 제품을 수집하여 각 튜브에 고유한 숫자를 표시합니다. 마이크로센트심분리기 튜브의 총 수가 복제 횟수(8 x 2 = 16)를 곱한 조건 수와 일치하는지 확인합니다.</li>
	<li>9:1 메탄올:DI 수(v/v)로 구성된 수집 용액(10mL)의 재고를 준비한다. Aliquot 50 μL각각에 16개의 추가 라벨이 부착된 미세센심분리기 튜브(칩의 반응 부위당 1개).</li>
	<li>[18F]불소 스톡 용액을 500 μL 마이크로센시드후지 튜브에 75mM TBAHCO3 솔루션(56 μL)과 140μL까지 혼합하여 [18F]불소/[18O]H2O(~260MBq[7mCi])를 혼합하여 준비한다. 이 용액의 8 μL은 각 반응 부위(~15MBq [0.40 mCi] 활성 및 TBAHCO3의240nmol을 포함)에 로드됩니다.</li>
</ol>4.[18F]의 병렬 합성및 다른 전구체 농도
참고: 칩은 피드백을 위해 내부 열전대 신호를 사용하여 온오프 온도 컨트롤러를 사용하여 제어되는 25mm x 25mm 세라믹 히터로 구성된 가열 플랫폼(이전에 설명된13개과같이 제작)에서 작동됩니다. 히터 표면 온도는 열 화상 진찰을 사용하여 보정되었습니다. 이러한 플랫폼을 사용할 수없는 경우, 핫 플레이트 의 쌍을 사용할 수 있습니다 (105 ° C에서 하나 와 110 ° C에서 하나).
<ol><li>부하 [18F] 불소 스톡 솔루션(위상 전달 촉매).<ol>
<li>마이크로피펫을 사용하여 다중 반응 칩의 첫 번째 반응 지점에[18F] 불소 스톡 용액의 8 μL 방울을 적재합니다. 용량 교정기에 배치하여 칩의 활성을 측정하고 측정이 수행되는 시간을 기록합니다.</li>
		<li>용량 교정기에서 칩을 제거한 다음 제2 반응 지점에[18F] 불소 스톡 용액의 8 μL 액수를 적재합니다. 용량 교정기에 다시 배치하여 칩의 활성을 측정하고 측정이 수행되는 시간을 기록합니다.</li>
		<li>칩의 다른 모든 반응 사이트에 대해 반복합니다.</li>
		<li>방사성 동위원소를 적재하고 해당 부위가 로드되기 전에 이전 측정(decay-corrected)을 빼낸 후 활동 측정을 받아 반응 스팟당 적재된 활성을 계산합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>히터에 다중 반응 칩을 정렬합니다.<ol>
<li>세라믹 히터 위에 얇은 열 페이스트를 추가합니다.</li>
		<li>조심스럽게 물방울의 유출을 방지하기 위해 핀셋을 사용하여 히터의 상단에 칩을 배치, 히터의 참조 모서리와 칩의 참조 모서리를 정렬 (도 3B에도시된 바와 같이). 칩은 히터를 소량으로 오버행합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>[18F]불소 및 위상 전달 촉매를 건조시십시오.<ol>
<li>[18F]불소 및 TBHACO3의건조잔류를 남기도록 방울을 증발시키기 위해 대조군 프로그램에서 히터를 105°C로 설정하여칩을 1분동안 가열한다. 1분 후 히터를 끄고 제어 프로그램을 통해 냉각 팬을 켜서 칩을 식힙니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>전구체 솔루션을 추가합니다.<ol>
<li>마이크로 피펫을 사용하여 첫 번째 반응 부위에 말린 잔류물 위에 6 μL 의 전구체를 추가합니다.</li>
		<li>칩의 다른 모든 반응 사이트에 대해 반복합니다. 최적화 계획을 사용하여 각 반응 부위에 사용되는 희석 계열의 농도를 결정합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>불소 반응을 수행합니다.<ol>
<li>각 칩을 110°C로 7분 동안 가열하여 방부성 반응을 수행한다. 그 후 히터를 끄고 제어 프로그램을 통해 냉각 팬을 켜서 칩을 식힙니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>반응 사이트에서 원유 제품을 수집합니다.<ol>
<li>마이크로피펫을 통해 지정된 미세원심분리기 튜브로부터 10μL의 수집 용액을 추가하여 첫 번째 반응 부위에서 원유 제품을 수집합니다. 5s를 기다린 후, 마이크로파이프(동일한 팁이 설치된)를 사용하여 희석된 원유 제품을 흡인하고 해당 표지된 마이크로센트심리분리기 튜브로 옮길 수 있습니다.</li>
		<li>모든 작업에 대해 동일한 파이펫 팁을 사용하여 이 프로세스를 총 4회 반복합니다.</li>
		<li>칩의 다른 모든 반응 사이트에 대한 수집 프로세스를 반복합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 반응 성능과 최적의 조건을 결정하기 위한 합성 분석
<ol><li>칩의 첫 번째 반응에 대해 "수집 효율"을 결정합니다.<ol>
<li>마이크로원심분리기 튜브를 투여량 교정기에 제1 반응 지점의 수집된 원유 생성물로 배치하여 활성을 측정한다. 측정의 측정 및 시간을 기록합니다.</li>
		<li>수집된 원유 제품의 활성을 동일한 반응 부위에 대해 측정된 시작 활성으로 나누어 수집 효율을 계산합니다(활동 값을 동일한 시간점으로 점치 시정).</li>
		<li>칩의 다른 모든 반응 사이트에 대해 반복합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>수집된 각 원유 제품의 조성(불소 효율)을 분석합니다. 참고: 짧은 시간에 모든 시료를 실용화하기 위해, 불소 효율은 이전에 설명된 고처리량 무선-박층 크로마토그래피(radio-TLC)접근법(14)을사용하여 분석된다. 이 기술은 단일 TLC 플레이트에서 나란히(5mm 피치, 스팟당 0.5 μL)를 나란히 관찰한 다음, 함께 개발하고, Cerenkov 이미징14,15를사용하여 판독을 함께 수행함으로써 최대 8개의 샘플을 병렬로 처리할 수 있게 한다. 16개의 병렬 반응으로 예제 최적화를 위해서는 2개의 TLC 플레이트가 필요합니다. 또 다른 옵션은 분리, 세척 및 평형시간이 분석될 수 있는 시료의 수를 제한할 수 있지만 분석을 위해 무선 고성능 액체 크로마토그래피(radio-HPLC)를 사용하는 것입니다.<ol>
<li>각 TLC 플레이트(50mm x 60mm)에 대해 연필로 50mm 가장자리(아래쪽)에서 15mm 떨어진 곳에서 선을 그리고 다른 선은 같은 가장자리에서 50mm 떨어진 곳에 있습니다. 첫 번째 줄은 원선입니다. 두 번째는 용매 최전선입니다. 8개의 "차선"에 대한 샘플 스포팅 위치를 정의하기 위해 5mm 간격으로 원단을 따라 작은 "X"를 그립니다.</li>
		<li>마이크로 피펫을 사용하여 첫 번째 원유 제품의 0.5 μL을 첫 번째 차선의 "X"의 TLC 플레이트로 전송합니다. 추가 원유 제품(TLC 플레이트당 최대 8개)을 반복합니다. TLC 플레이트에서 원유 제품 반점이 건조할 때까지 기다립니다.</li>
		<li>각 TLC 플레이트에 대해, 용매 전면이 용매 최전선에 도달할 때까지 25m NH4HCO2에서 60% MeCN의 이동단계를 사용하여 1% TEA(v/v)를 사용하여 개발한다. TLC 플레이트의 용매가 건조할 때까지 기다린 다음 유리 현미경 슬라이드(76.2mm x 50.8mm, 두께 1mm)로 덮습니다.</li>
		<li>5 분 노출을 위해 Cerenkov 이미징 시스템에 플레이트를 배치하여 각 TLC 플레이트의 방사능 이미지를 가져옵니다. 표준 이미지 보정(어두운 전류 빼기, 평평한 필드 보정, 중앙분리대 필터링 및 배경 빼기)을 수행합니다.</li>
		<li>제1 TLC 플레이트의 첫 번째 차선에 대한 관심 영역(ROI) 분석을 사용합니다. 차선에 보이는 각 대역 주위의 영역을 그립니다. 이 소프트웨어는 모든 영역(대역)의 총 통합 강도에 비해 각 영역(대역)의 통합 강도의 분수를 계산합니다.</li>
		<li>이 모바일 단계를 사용하면 표시된 보존 계수에서 다음 밴드가 예상됩니다: Rf = 0.0: 반응되지 않음[18F] 불소; Rf = 0.9:[18F]fallypride; Rf = 0.94: 사이드 제품. [18F]fallypride 대역에서 활동의 분수로 불소 효율을 결정합니다.</li>
		<li>모든 TLC 플레이트의 다른 모든 차선에 대해 이 분석을 반복합니다. 참고: Cerenkov 이미징 챔버를 사용할 수 없는 경우 생체 내 광학 이미징 시스템의 작은 동물(전임상)을 사용하여 TLC 플레이트를 이미지화할 수 있습니다. 또는 2차원 TLC 스캐너를 사용할 수 있습니다. 또는 1차원 TLC 스캐너만 사용할 수 있는 경우 TLC 플레이트는 가위로 절단하여(차선당 1개) 스트립으로 절단하고 각 스트립을 개별적으로 스캔하여 분석할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>각 반응 부위에 대한 원유 방사성 화학 수율(원유 RCY)을 결정합니다.<ol>
<li>내수 효율을 배합하여 수집 효율을 곱하여 최초의 원유 제품에 대한 원유 RCY를 결정합니다.</li>
		<li>다른 모든 반응 사이트에 대해 반복합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>결과 분석<ol>
<li>복제 실험에 대한 집계 값은 평균 및 표준 편차로 집계됩니다.</li>
		<li>수집 효율, 불소 효율 및 원유 RCY를 다양한 매개 변수의 함수로 플롯(이 예에서 전구체 농도).</li>
		<li>원하는 기준에 따라 최적의 조건을 선택합니다. 일반적으로 이것은 최대 원유 RCY입니다. 또한 그래프의 경사가 상대적으로 평평한 지역에서 점이 선택되는 경우가 많으며, 이는 매개 변수의 작은 변화에 민감하지 않음을 나타내므로 보다 강력한 프로토콜을 제공합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

캘리포니아 대학의 리젠트는 반 댐 박사가 발명한 Sofie, Inc.에 기술을 허가했으며 라이센스 거래의 일환으로 Sofie, Inc.의 지분을 차지했습니다. 반 담 박사는 Sofie, Inc.의 설립자이자 컨설턴트입니다. 나머지 저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다. 이 작품은 국립 암 연구소 (R33 240201)에 의해 부분적으로 지원되었다.

종래의 방사선화학 시스템의 한계로 인해 하루에 하나 또는 소수의 반응만 허용하고 데이터 포인트당 상당한 양의 시약을 소비하므로 전체 반응 매개 변수 공간의 극히 일부만 실제로 탐색할 수 있으며, 여러 번의 결과는 반복없이 보고됩니다(n=1). 기존의 시스템에 비해, 이 다중 반응 물방울 방합성 플랫폼은 방사성 합성 조건에 대한 보다 포괄적이고 엄격한 연구를 수행하는 동시에 전구체의 시간과 양을 거의 소비하지 않으며 제품 수율 및 측면 제품 형성에 영향을 미치는 매개 변수에 대한 새로운 통찰력을 가능하게합니다. 이 정보는 가장 높은 제품 수율 또는 가장 강력한 합성을 초래하는 조건을 선택하는 데 사용할 수 있습니다. 낮은 전구체 소비는 소량의 전구체만 사용할 수 있거나 전구체가 비쌀 때 새로운 방사선 추적기의 초기 발달에 특히 유용할 수 있습니다. 칩의 개방적 특성은 파이펫을 통한 빠른 합성 시간과 접근 용이성에 기여하지만, 휘발성 분자의 상당한 손실로 이어질 수 있으며 휘발성 전구체, 중간체 또는 제품이 있는 방사성 의약품의 합...

양전자 방출 단층 촬영 (PET) 방사성 의약품널리 생체 내 생화학 프로세스및 연구 질병에서 특정 모니터링및 새로운 약물과 치료의 개발을위한 연구 도구로 사용된다. 더욱이, PET는 질병을 진단하거나 준비하는 중요한 도구이며, 치료1,2,3에대한 환자의 반응을 모니터링한다. PET 방사성 동위원소(예: 불소-18라벨방사성의약품의 경우 110분) 및 방사선 위험의 짧은 반감기로 인해 이 화합물은 방사선 차폐 뒤에 작동하는 특수 자동화 시스템을 사용하여 제조되며 사용하기 직전에 준비해야 합니다.
방사성 의약품을 합성하는 데 사용되는 현재 시스템은 생산 비용을 공유하기 위해 많은 개별 용량으로 나누어 큰 배치를 생성하도록 설계되었습니다. 현재 시스템은[18F] FDG와 같은 널리 사용되는 방사성 추적기의 생산에 적합하지만 (다중 환자 스캔 및 연구 실험은 하루에 예약 될 수 있기 때문에), 이러한 시스템은 초기 단계 개발 중 새로운 방사선 추적기의 생산에 낭비 될 수 있습니다, 또는 덜 일반적으로 사용되는 방사선 추적기. 종래의 시스템이 사용하는 부체는 일반적으로 1-5 mL 범위에서, 반응은 1-10 mg 범위에서 전구체 양을 필요로한다. 더욱이, 종래의 방사성합성기를 사용하는 것은 일반적으로 최적화 연구 중에 번거롭다. 장비 비용 외에도 방사성 동위원소와 시약의 비용은 여러 배치의 생산을 요구하는 연구에 매우 상당한 도움이 될 수 있습니다. 이것은, 예를 들면, 새로운 방사선 추적자를 위한 합성 프로토콜의 최적화 도중 초기 생체 내 화상 진찰 연구 결과에 대한 충분한 수율 및 신뢰성을 달성하기 위하여 생길 수 있습니다.
미세 유체 기술은 기존의시스템4,5,6에비해 몇 가지 장점을 활용하기 위해 방사선 화학에 점점 더 사용되고있다. 1-10 μL 반응량7,8,9를기반으로 하는 미세 유체 플랫폼은 시약 부적 및 고가의 전구체 소비량과 짧은 반응 시간을 크게 감소시켰다. 이러한 감소는 비용 절감, 더 빠른 가열 및 증발 단계, 더 짧고 간단한 다운스트림 정제, 전반적인 "친환경" 화학 공정10,생산된 방사선추적기(11)의더 높은 어금니 활성으로 이어진다. 이러한 개선은 각 합성의 시약 비용을 낮춤으로써 보다 광범위한 최적화 연구를 수행하는 것이 더 실용적입니다. 하루 만에 방사성 동위원소의 단일 배치에서 여러 실험을 수행하 여 추가 이점을 얻을 수 있습니다. 예를 들어, "발견 모드"에서 작동하는 미세 유체 흐름 화학 방사성 합성기는 각각 10대의 μL 반응부피(12)만을사용하여 수십 개의 반응을 순차적으로 수행할 수 있다.
이러한 장점에서 영감을 얻은 마이크로볼륨 반응이 패턴 테플론 코팅을 사용하여 생성된 실리콘 표면의 표면 장력 트랩 배열에 국한되는 다중 반응 액적 어레이 칩이 개발되었습니다. 이 칩은 1-20 μL 스케일에서 여러 반응을 동시에 수행할 수 있게 하여 하루에 10개의 서로 다른 반응 조건을 탐색할 수 있으며, 각각 여러 개의 복제를 수행할 수 있습니다. 이 논문에서는 신속하고 저비용 방사선 화학 최적화를 수행하기 위한 이 새로운 고처리량 접근법의 유용성을 입증합니다. 다중 반응 물방울 칩을 사용하면 시약 농도 및 반응 용매의 영향을 편리하게 탐색할 수 있으며 여러 칩을 사용하면 반응 온도와 시간을 연구할 수 있으며, 매우 적은 양의 전구체를 소비할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>2,3- 디메틸 -2- 부탄올 (테 실 알코올)</td> <td>시그마 - 알드리치</td><td>594-60-5</td><td>98 %</td></tr> <tr><td>아세톤</td><td>KMG 화학 물질</td><td></td><td>클린 룸 LP 등급</td></tr><tr><td>포름산 암모늄 (NH4 < / > HCO < > 2)</td> <td>시그마 알드리치</td><td>540-69-2</td><td>97 %</td></tr> <tr><td>무수 아세토 니트릴 (MeCN)</td> <td>시그마 - 알드리치</td><td>75-05-8</td><td>99.80 %</td></tr><tr><td>세라믹 히터</td><td>Watlow</td><td>Utramic CER-1-01-0093</td><td>25 mm x 25 mm</td></tr><tr><td>Cerenkov 이미징 챔버</td><td>맞춤 제작</td><td></td><td>TLC 플레이트 판독에 사용할 수 있는 다른 기기: 생체 내 소형 광학 이미징 시스템, 2D 라디오-TLC 스캐너, 1D 라디오-TLC 스캐너</td></tr><tr><td>DI water</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7732-18-5</td><td></td></tr><tr><td>일회용 전송 피펫, 3 mL</td><td>Falcon</td><td>13-680-50</td><td></td></tr><tr><td>용량 교정기</td><td>Capintec, Inc.</td><td>CRC-25 PET</td><td></td></tr><tr><td>Fallypride</td><td>ABX 고급 생화학 화합물</td><td>1560.0010.000</td><td>Fallypride 참조 표준, >95%</td></tr><tr><td>[18F]fluoride in [18O]H2O</td><td>UCLA Ahmanson Biomedical Cyclotron Facility</td><td></td><td>반감기가 짧기 때문에 지역 방사선 화학 실험실 또는 상업용 방사선 약국</td></tr><tr><td>에서 얻어야 합니다.유리 커버 플레이트(76.2mm x 50.8mm x 1mm 두께)</td><td>C& Scientific</td><td>6101</td><td></td></tr><tr><td>Headway 스핀 코팅기</td><td>Headway Research, Inc.</td><td>PWM50-PS-R790 Sipinner 시스템</td><td>PWM50-컨트롤 박스, PS-모터, R790-bowl</td></tr><tr><td>고온 오븐</td><td>Carbolite</td><td>HTCR 6 28</td><td></td></tr><tr><td>Hot plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>Super-Nuova HP133425</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol (IPA)</td><td>KMG Chemicals</td><td></td><td>Cleanroom LP grade</td></tr><tr><td>Mask aligner</td><td>Karl Suss</td><td>MA/BA6</td><td></td></tr><tr><td>Methanol (MeOH)</td><td>시그마-알드리치</td><td>67-56-1</td><td>&ge; 99.9%</td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>0030 123.301</td><td>500 &micro; L, 무색, 폴리프로필렌</td></tr><tr><td>마이크로피펫(0.5-10 &마이크로; L)</td><td>Labnet</td><td>BioPette P3940-10</td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫 (100-1000 &마이크로; L)</td><td>Labnet</td><td>BioPette P3940-1000</td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫 (10-100 &마이크로; L)</td><td>Labnet</td><td>BioPette P3940-100</td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫 팁(0.1-10 &마이크로; L)</td><td>USA Scientific Inc 팁</td><td>11113810</td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫 팁(2-200 &마이크로; L)</td><td>BrandTech</td><td>13-889-143</td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫 팁(50-1000 &마이크로; L)</td><td>BrandTech</td><td>13-889-145</td><td></td></tr><tr><td>포토레지스트 현상</td>액 <td>MicroChem</td><td>MEGAPOSIT MF-26A</td><td></td></tr><tr><td>포지티브 포토레지스트</td><td>MicroChem</td><td>MEGAPOSIT 220-7.0</td><td></td></tr><tr><td>반응성 이온 에칭기 (RIE)</td><td>Oxford Instruments</td><td>Plasma Lab 80 Plus</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 웨이퍼 커터</td><td>Euro Tool</td><td>CSCB-431.00</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 웨이퍼; 4" 지름</td><td>실리콘 밸리 마이크로일렉트로닉스 Inc.&nbsp;</td><td>0017227-048</td><td>P 형, 붕소 도핑, 두께 525 & 플러스 mn; 25 & 마이크로; m</td></tr><tr><td>테프론 AF 2400</td><td>케무어&nbsp;</td><td>D14896765</td><td>1% 고체</td></tr><tr><td>테트라부틸암모늄 바이카보네이트(TBAHCO3)</td><td>ABX Advanced Biochemical Compounds</td><td>808</td><td>에탄올로 안정화된 수용액, 0.075M</td></tr><tr><td>테마 전도성 페이스트</td><td>OMEGA</td><td>OT-201-2</td><td></td></tr><tr><td>TLC 플레이트</td><td>Merck KGaA</td><td>1.05554.0001</td><td>실리카겔 60 F254, 50mm x 60mm, 알루미늄 후면</td></tr><tr><td>Tosyl-fallypride</td><td>ABX Advanced Biochemical Compounds</td><td>1550.004.000</td><td>Fallypride 전구체, >90%</td></tr><tr><td>Trimethylamine (TEA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75-50-3</td><td>&ge; 99%</td></tr><tr><td>핀셋</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-07387-08</td><td>스테인리스 스틸, 파인 팁</td></tr></tbody></table>

물방울 배열을 사용하여 방사성 화학 반응의 최적화

Optimization of Radiochemical Reactions using Droplet Arrays

현재 자동화된 방사성 합성기는 방사성 의약품의 대규모 임상 배치를 생성하도록 설계되었습니다. 각 데이터 포인트는 상당한 시약 소비를 수반하기 때문에 반응 최적화 또는 새로운 방사성 의약품 개발에 적합하지 않으며, 장치의 오염은 다음 사용 전에 방사성 붕괴에 대한 시간이 필요합니다. 이러한 한계를 해결하기 위해, 패턴 폴리테트라플루오로틸렌 코팅 실리콘 "칩"에 표면 장력 트랩 내에 각각 좁혀진 소형 물방울 기반 반응의 배열을 수행하기위한 플랫폼이 개발되었다. 이 칩은 시약 농도, 반응 용매, 반응 온도 및 시간을 포함한 반응 매개 변수의 신속하고 편리한 연구를 가능하게합니다. 이 플랫폼은 기존의 방사성 합성기를 사용하는 데 몇 달이 걸리는 대신 최소한의 시약 소비로 며칠 만에 수백 개의 반응을 완료할 수 있습니다.

이 방법을 설명하기 위해 대표적인 실험이 수행되었습니다. 16개의 반응을 이용하여, 방사성약제의 최적화 연구 [18F]fallypride는 반응 용액으로 서술알콜에서 다양한 전구체 농도(77, 39, 19, 9.6, 4.8, 2.4, 1.2 및 0.6mMMM)에 의해 수행되었다: MeCN(1:1, v/v). 반응은 7 분 동안 110 °C에서 수행되었다. 수집 효율, 샘플 조성(즉,[18F]fallypride제품, 미반응[18F]불소및 사이드 제품)의 비율은 표 1에 표로 분류되고 도 4에그래픽으로 요약된다.
연구 결과에 따르면 불소 효율([18F]fallypride의 비율)은 전구체 농도가 증가함에 따라 증가하고, 나머지...

이 방법은 시약의 나노몰 양을 사용하여 방사성 의약품의 신속하고 경제적 최적화를 위해 액적 화학 반응을 기반으로 하는 새로운 고처리량 방법론의 사용을 설명합니다.

Current automated radiosynthesizers are designed to produce large clinical batches of radiopharmaceuticals. They are not well suited for reaction ...

현재 자동화된 무선 신디사이저는 FDG와 같이 널리 사용되는 방사성 의약품의 큰 배치를 생성하도록 설계되었습니다. 하루에 가능한 합성물의 제한된 수와 상대적으로 높은 시약 소비로 인해 이러한 시스템은 합성 최적화 연구를 수행하는 데 적합하지 않습니다. 이 기술을 사용하면 최대 16개의 동시 반응을 병렬로 수행하여 처리량이 크게 증가하고 시약 소비량은 백 배 감소된다.또한, 병렬로 반응을 수행함으로써 연구를 완료하려면 방사성 동위 원소의 공정한 배치가 필요합니다. 처리량이 증가하면 기존 계측기의 사용에 비해 각각 복제수가 많은 반응 조건을 보다 폭넓게 탐색할 수 있습니다. 이 프로토콜은 fallypride의 합성에서 전구체 농도의 최적화를 보여주지만, 기술은 그밖 조건 및 그밖 방사선 약제들을 낙관하기 위하여 이용될 수 있습니다.표준 포토리소그래피 기술을 사용하여 4인치 실리콘 웨이퍼에서 다중 반응 마이크로 드롭렛 칩을 제작하는 것으로 시작합니다. 본 프로토콜에서, 전구체 농도의 높은 처리량 최적화는 방사성 제약 Fallypride의 합성으로 입증된다. 16개의 동시 반응은 단일 칩에서 수행될 수 있다.비교할 조건은 반응 사이트에 매핑됩니다. 부피 혼합물에 의해 일대일로 식용 알코올 및 아세토닐릴로 구성된 반응 용매의 스톡 용액을 준비한다. 볼륨이 계획된 희석 계열을 만들기에 충분한지 확인합니다.탐사할 최대 농도로 반응 용매에 전구체의 30마이크로리터 스톡 솔루션을 준비한다. 전구체 스톡 용액 및 반응 용매로부터 전구체 용액의 상이한 농도를 준비하기 위해 마이크로 센드심분리기 튜브 세트에서 2회 연속 희석을 수행한다. 또 다른 마이크로센심심분리기 튜브 세트를 준비하여 각 조질 반응 제품을 수집하여 영구 마커를 사용하여 각 튜브에 고유한 숫자로 라벨을 부착합니다.마이크로센트심분리기 튜브의 총 수가 복제 수를 곱한 조건 수와 일치하는지 확인합니다. 9-1 메탄올로 구성된 10밀리리터 의 수집 용액을 탈온화물에 준비합니다. Aliquot 50 마이크로리터각각의 추가 세트로 16 마이크로 센심 분리기 튜브가 수집 용액으로 표시되어 있습니다.불소 고드 소스의 약 7 밀리퍼리를 75 밀리머 테트라부티람모늄 중탄산염56 마이크로리터와 혼합하고 최대 140 마이크로리터의 DI 워터와 희석하여 불소 재고 솔루션을 준비하십시오. 마이크로피펫을 사용하여 다중 반응 칩의 첫 번째 반응 지점에 불소 스톡 솔루션 8개의 마이크로리터 액수를 적재합니다. 용량 교정기에 배치하여 칩의 활성을 측정하고 측정이 수행되는 시간을 기록합니다.용량 교정기에서 칩을 제거하고 두 번째 반응 지점에 불소 스톡 용액의 8 개의 마이크로 리터 방울을적재한다. 칩의 활동을 측정하고 측정이 수행되는 시간을 기록합니다. 다른 모든 반응 사이트에 대해 이 프로세스를 반복합니다.방사성 동위원소를 적재하고 해당 부위가 로드되기 전에 이전 측정을 빼낸 후 활동 측정을 통해 반응 스팟당 적재된 활성을 계산합니다. 히터의 다중 반응 칩을 정렬하려면 세라믹 히터 위에 얇은 열 페이스트를 추가합니다. 칩의 기준 모서리와 히터의 기준 모서리를 정렬하는 핀셋을 사용하여 히터 위에 칩을 조심스럽게 배치합니다.칩은 히터를 소량으로 오버행해야 합니다. 제어 프로그램에서 히터를 섭씨 105도로 설정하여 1분간 칩을 가열하여 물방울을 증발시키고, 플루오라이드와 테트라부틸람모늄 중탄산염의 말린 잔류물을 남깁니다. 그런 다음 히터를 섭씨 30도로 설정하고 제어 프로그램을 사용하여 냉각 팬을 켜서 칩을 냉각시켰습니다.마이크로 피펫을 사용하여, 첫 번째 반응 부위에 말린 잔류물 위에 fallypride 전구체6 마이크로리터 용액을 추가합니다. 칩의 다른 모든 반응 사이트에 대해 반복합니다. 최적화 계획을 사용하여 각 반응 부위에 사용되는 희석 계열의 농도를 결정합니다.제어 프로그램을 사용하여 7분간 칩을 섭씨 110도로 가열한 다음 히터를 섭씨 30도로 설정하고 제어 프로그램을 사용하여 냉각 팬을 켜서 칩을 식힙니다. 지정된 마이크로센심분리기 튜브에서 10 마이크로리터의 수집 용액을 추가하여 첫 번째 반응 부위에서 원유 제품을 수집합니다. 5초 동안 기다린 후 희석된 원유 제품을 흡인하여 해당 수집 마이크로원심분리기 튜브로 전송합니다.이 프로세스를 동일한 파이펫 팁을 사용하여 총 4회 반복한 다음 마이크로센티립시립지 튜브를 닫습니다. 칩의 다른 모든 반응 사이트에서 원유 제품을 수집하려면 다음 단계를 반복합니다. 칩상제반응에 대한 수집 효율을 결정하기 위해, 마이크로센심분리기 튜브를 투여량 교정기에서 제1 반응 스팟의 수집된 원유 생성물로 배치하여 활성을 측정한다.측정의 측정 및 시간을 기록합니다. 수집된 각 원유 제품에 대해 이 프로세스를 반복합니다. 수집된 원유 제품의 활성을 동일한 반응 부위에 대해 측정된 시작 활성으로 나누어 수집 효율을 계산합니다.칩의 다른 모든 반응 사이트에 대해 반복합니다. 다음으로, 수집된 각 원유 제품의 조성물을 분석한다. 연필로 TLC 플레이트의 아래쪽 가장자리에서 15mm 떨어진 선을 그리고 같은 가장자리에서 50밀리미터 떨어진 다른 선을 그립니다.첫 번째 선은 원선이고 두 번째 선은 용매 최전선입니다. 8개의 작은 X를 원점에서 5mm 간격으로 그려 8개의 차선 각각에 대한 샘플 스포팅 위치를 정의합니다. 마이크로파이프를 사용하여 첫 번째 원유 제품의 0.5 마이크로리터를 첫 번째 차선X의 TLC 플레이트로 전송합니다.추가 원유 제품을 위해 이 것을 반복한 다음 반점이 마르기를 기다립니다. 용매 전면이 용매 최전선에 도달할 때까지 25 밀리머 암모늄용매암모늄의 60%의 이동 단계를 사용하여 각 TLC 플레이트를 1%TEA로 결합합니다. 그 때, 챔버에서 TLC 플레이트를 제거하고 TLC 플레이트의 용매가 건조 할 때까지 기다린 다음 Cerenkov 이미징 시스템에 TLC 플레이트를 배치하고 유리 현미경 슬라이드로 덮습니다.세렌코프 이미징 시스템을 5분 노출로 설정하여 각 TLC 플레이트의 방사능 이미지를 얻은 다음, 생성된 이미지 파일을 TLC 플레이트로 선택하고 표준 이미지 보정을 수행합니다. 첫 번째 TLC 플레이트의 첫 번째 차선에 대한 관심 영역을 사용합니다. 차선에 보이는 각 대역 주위의 영역을 그린 다음 모든 영역의 총 통합 강도에 비해 각 영역의 통합 강도의 분수를 계산합니다.Fallypride 대역에서 활동의 일부로 불소 효율을 결정합니다. 모든 TLC 플레이트의 다른 모든 차선에 대해 이 분석을 반복합니다. 이어서, 각 반응에 대해 원유 방사성화학 수율을 계산하고 전구체 농도의 함수로서 원유 방사성화학 수율을 검사하여 최적의 전구체 농도를 선택한다.방사성 제약 의 최적화 연구는 식실 알코올 아세토나이트에서 다양한 전구체 농도에 의해 수행되었다. 반응은 7 분 당 섭씨 110도에서 수행되었습니다. 수집 효율 및 샘플 조성물은 여기에 표시됩니다.전구체 농도가 증가하고 반응하지 않은 불소의 농도가 감소하면서 불소 효율이 증가했습니다. 낮은 전구체 농도에서 소량의 방사성 측면 생성물이 있었는데, 이는 더 높은 전구체 농도에서 형성되지 않았다. 수집 효율은 대부분의 조건에서 거의 정량적이었지만 낮은 전구체 농도에서 약간 떨어졌습니다.가장 높은 원유 방사성 화학 적 수율은 39 밀리머 전구체 농도로 달성되었다. 이 조건에서, 불소 효율은 96%였으며 원유 RCY는 87%였으며 관찰된 방사성 측 생성물 형성이 없었다. 칩의 반응 액적에 해당하는 반응 조건에 대한 맵 계획을 가지고 실험 중에 다시 검사할 수 있는 시약 튜브 및 제품 수집 튜브에 적절하게 라벨을 붙이는 것이 중요합니다.절차는 염기의 양, 용매의 종류, 또는 반응 부피와 같은 다른 반응 조건의 최적화에 사용될 수 있다. 그것은 또한 다른 방사성 의약품의 합성을 최적화 하는 데 사용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

Ugi 반응 빠르게 화합물의 다양한 라이브러리를 만들 수있는 편리한 방법으로 증명했다. 그것은 아민의 반응, 알데히드, 카르복실산 및 실온에서 메탄올에서 일반적으로 isonitrile을 포함한다. 이 비디오에서는, 우리는 여과 튜브와 메틀러 - 톨레도 MiniMapper 자동 액체 처리기는 시약 및 용매를 제공하기 위해 사용되었습니다 갖춘 48 슬롯 메틀러 - 톨레도 MiniBlock를 활용. 관심의 매개 변수는 농도, 용매 조성과 시약의 일부 초과되었습니다.

병렬 합성 및 자동 액체 처리를 사용하여 Ugi 반응의 최적화

그들은 kHz에서 속도 저렴 picoliter, 자기들에게만 혈관을 생성할 수 있기 때문에 비말 기반 microfluidic 플랫폼은 높은 처리량 실험을위한 유망한 후보자 있습니다. 빠르고, 민감하고 고해상도 형광 spectroscopic 방법과의 통합을 통해 이러한 시스템 내에서 발생하는 정보의 다량은 효율적으로 추출 무력화하고 이용하실 수 있습니다.

microfluidic 비말 플랫폼 형광 검출 방법

계자 디웨팅 장치(Field-DW)의 제조 및 작동을 위한 프로토콜과 액적 내용물에 대한 전기장의 영향에 대한 예비 연구에 대해 설명합니다.

감소 물방울 표면 상호 작용을 활용하는 디지털 미세 유체에 Bioanalytes의 전송을 최적화하려면

우리는 유도 결합 플라즈마 질량 분석법 (ICPMS) 미국 이산 액적 샘플 도입 시스템을 제시한다. 그것은 90 내지 7000 Hz의 주파수로 40-60 ㎛의 크기 범위 고도로 단 분산 액 적을 생성 저렴하고 일회용 미세 유체 칩에 기초한다.

ICPMS 샘플 소개를위한 미세 유체 칩

실험실에서 드롭 반응 시스템 미세 규모에 복잡 한 반응의 다양 한 구현을 수 있습니다. 전자기 코일의 3 x 3 매트릭스의 구성 하는 자동된 개폐 플랫폼 개발 되었다 성공적으로 병합 두 10 µ L microreactors를 사용 하 고 결과 액체 구슬에서 효소 반응 함으로써 시작.

효소 Microreactors 및 그들의 전자기 작동기로 사용 하는 수성 방울

여기 선물이 주소 드롭릿 microarrays (Adm), 작은 물방울 배열 기반 메서드 단일 셀에 절대 단백질 풍부를 확인할 수 있습니다. Adm의 기능 인간 암 세포 선에서 종양 억제기 단백질 p53의 표현에이 특성을 설명 합니다.

주소 지정이 가능한 물방울 Microarrays 단일 셀에서 단백질을 계산

프로토콜의 전반적인 목표는 세포 없는 단백질 합성에 사용될 수 있는 1cm2 평면 기판에 1백만 개 이상의 주문, 균일, 안정 및 생체 호환 펨토리터 물방울을 준비하는 것입니다.

단일 DNA 분자에서 대규모 병렬 단백질 합성을 위한 펨토리터 물방울 배열

우리는 1500 배양 장치, 향상된 연동 펌프의 배열및 현장 믹싱 계수로 구성된 복잡한 생명 기계에 대한 높은 처리량 연구를위한 미세 유체 시스템을 제시합니다. 미세 유체 칩은 생체 내 매우 복잡하고 역동적인 미세 환경 조건을 분석할 수 있게 해줍니다.

고처리량 미세 유체 장치를 사용하여 동적 환경 조건의 생성

물방울 분석은 분석 화학, 효소 진화 및 단일 세포 분석에 유용하지만 일반적으로 액적을 형성하기 위해 미세 유체학이 필요합니다. 여기서는 액적 저술을 수행하기 위한 미세유체없는 접근 방식인 입자 템플릿 유화제를 설명합니다.

입자 템플릿 유화제를 통해 미세 유체가 없는 물방울 분석을 가능하게 합니다.

여기에서는 수중수(water-in-oil) 에멀젼(플러그)의 조합 라이브러리를 생산하기 위한 폴리디메틸실록산(PDMS) 기반 이중층 장치의 제조를 소개합니다. 플러그 생산을 자동화하는 데 필요한 하드웨어 및 소프트웨어는 프로토콜에 자세히 설명되어 있으며 형광 플러그의 정량적 라이브러리 생산도 시연됩니다.

조합 플러그 생산을 위한 이중층 미세유체 장치

이 프로토콜은 "루프 방법"[11C]메틸화를 통해 4개의 탄소-11 방사성 추적자를 준비하는 자세한 절차를 제시합니다. [11C]ER-176을 3개의 추가 방사성 추적자([11C]MRB, [11C]mHED 및 [11C]PiB)에 대한 데이터와 함께 합성하는 절차를 설명합니다. 루프 방법은 전통적인 반응 용기 [11C] 메틸화에 대한 증가된 방사성 화학적 수율로 효율적인 합성을 제공합니다.

Enhancing Efficiency and Radiolabeling Yields of Carbon-11 Radioligands for clinical research with the loop method(루프 방법을 사용한 임상 연구를 위한 탄소-11 방사성 리간드의 효율성 및 방사성 표지 수율 향상)

배우세요 물방울 배열을 이용한 방사성 화학 반응 고속 최적화 방법입니다. 단일 칩에서 16개 병렬 반응을 수행하여 시약 소모를 100분의 1로 줄이고 Fallypride 합성 조건을 효율적으로 최적화할 수 있습니다.

물방울 배열을 사용하여 방사성 화학 반응의 최적화

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