전체 마운트 면역형광 염색, 컨포칼 이미징 및 마우스 내 동방방 및 방실 결절의 3D 재구성

이 프로토콜은 특히 마우스의 부비동 노드 및 AV 노드에 대해 미세 해부, 전체 마운트 면역형광 염색 및 현미경 검사를 수행하는 데 필요한 단계를 설명합니다. 전체 마운트 방법론은 부비동 및 AV 노드의 정확한 3D 위치 파악 및 형태를 다루고 주변 조직과의 관계를 조사하는 데 유리합니다. 조직 형태는 최소한의 조직 탈수와 물리적 파열만으로 상당히 보존됩니다.

먼저 27 게이지 바늘로 바늘을 좌심실에 조심스럽게 밀어 넣고 5-10밀리리터의 얼음처럼 차가운 PBS를 부드럽게 주입하여 심장을 배부르게 하여 정점 부위에 심장을 뚫습니다. 핀셋을 사용하여 심장을 조심스럽게 들어 올리고 큰 혈관을 잘라 심장을 제거합니다. 해부 현미경으로 얼음처럼 차가운 PBS로 채워진 해부 접시에 심장을 넣습니다.

심장의 방향을 결정한 후 심장의 앞면이 접시의 바닥에 오도록 심장을 돌립니다. 정점과 심방 부속물을 통해 작은 핀을 해부 접시 바닥에 있는 아가로스에 넣어 심장을 고정시킵니다. 가는 핀셋과 가위를 사용하여 상대정맥과 하대정맥 주위의 비심장 조직을 조심스럽게 제거합니다.

강간 영역을 노출시키려면 마이크로 가위로 심실과 심방 사이의 홈과 평행하게 절단하여 대부분의 심실을 제거합니다. 고정 및 탈수를 위해 샘플을 섭씨 4도에서 밤새 4%파라포름알데히드에 넣습니다. 다음 날, 심장을 15% 자당 용액으로 옮기고 섭씨 4도에서 24시간 동안 배양합니다.

배양 후 심장을 30% 자당 용액으로 섭씨 4도에서 24시간 더 옮깁니다. PBS에 희석된 1%Triton X-100으로 심장을 씻습니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 밤새 차단 용액으로 차단하고 투과화합니다.

심장을 1.5ml 튜브에 넣고 차단 용액으로 희석한 토끼 항 마우스 커넥신 43 및 쥐 항 마우스 HTN4 항체를 섭씨 4도에서 7일 동안 배양합니다. 7일 후, 피펫을 사용하여 1차 항체가 포함된 용액을 제거합니다. 1% Triton X-100 용액으로 오비탈 셰이커에서 1시간 동안 3회 심장을 세척합니다.

2차 항체와 DAPI로 배양 후 세척 단계를 반복합니다. 플라스틱 링을 준비하고 플라스틱으로 채운 후 심장 뒤쪽이 위를 향하도록 하여 플라스틱 홈에 심장을 넣습니다. 심장의 등쪽에 위치한 SAN과 강간 영역을 확인합니다.

심장에 PBS를 추가하여 심장이 PBS로 완전히 덮일 때까지 구멍 내의 모든 공기를 대체합니다. 플라스틱 링의 가장자리에 실리콘을 바릅니다. 샘플의 주변 부분을 플라스틱에 부드럽게 눌러 심장을 고정하고 커버 슬립으로 심장을 덮습니다.

그런 다음 플라스틱 뒷면을 부드럽게 눌러 PBS의 일부를 짜내고 이미징 영역 내에 기포가 생기지 않도록 주의하면서 하트를 커버 슬립에 부착합니다. 전체 마운트 염색 샘플을 컨포칼 현미경의 플랫폼에 거꾸로 놓고 텍스트 원고에 설명된 대로 이미징을 진행합니다. 컨포칼 현미경의 각 채널에 대한 매개변수는 해당 소프트웨어를 사용하여 설정됩니다.

이 프로토콜은 쥐 심장에서 동방결절과 방실 결절 모두에 대한 컨포칼 현미경 이미징을 수행하는 데 사용되었습니다. HCN4 및 Connexin 43을 각각 표적으로 하는 전도 시스템의 특정 염색과 형광 항체로 작동하는 심근을 통해 온전한 해부학적 구조 내에서 동방결절과 방실 결절을 확인할 수 있습니다. 이 전체 마운트 염색 프로토콜을 사용하면 다양한 항체를 사용하여 다양한 세포 유형의 상호 작용을 연구할 수 있습니다.