Name: 조사 된 버피 코트에서 피더 세포를 사용하여 T 림프구의 격리 및 배양을 통해 대동맥 밸브 석회화 조사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 30 s
Description: 학습하세요 석회화된 대동맥 판막 조직에서 T 림프구를 분리하고 배양하는 방법을 통해 적응 면역이 CAVD에 미치는 영향을 연구하세요. 이 프로토콜은 면역 세포 기능 연구에 활용됩니다.

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이 프로토콜에 사용된 모든 버피 코트 백은 피터 로젠탈 박사, 더크 뵈머 박사, 샤리테 벤자민 프랭클린 방사선학과 전체 팀의 가용성 덕분에 조사되었습니다. 장학금 소지자 / 메리 록사나 크리스토퍼,이 작품은 독일 심장 학회 (DGK)에서 장학금에 의해 지원됩니다.

이 연구는 좋은 과학적 관행을 보장하기위한 Charité의 법령에 따라 수행되었으며 개인 정보 보호 및 윤리에 대한 법적 지침과 조항이 존중되었습니다. 윤리위원회는 모든 인간의 실험을 승인하고 환자의 개인 정보 보호 및 익명성은 윤리 양식에 보고 된 규칙에 따라 유지되었다.
참고: 신선한 인간 스테노틱 밸브 샘플 아래에 설명된 프로토콜을 위해 사용되었습니다.
1. 시약 준비
<ol><li>RPMI 1640 배지: 비필수 아미노산에 첨가하여 농축 된 RPMI 완전 매체를 준비; 피루바테 나트륨, L-글루타민, ß-메르카포에탄올, 페니실린-스트렙토마이신 (펜/스트렙). 사용하기 전에 필터링합니다. +4°C에 보관하고 2개월 이내에 사용하십시오.</li>
	<li>농축 RPMI 1640 완전 배지추가 열불성 태아 소 혈청(FBS), HB 기저형, 인터류빈 2(IL-2) 및 인간 혈청(HS)의 50U를 사용하여 복제 상을 위한 세포 배양 배지(CCM)를 준비한다. 필터링하고 하루 내에 사용합니다. 보관하지 마십시오.</li>
	<li>FBS, HB 기저배지, IL-2 및 HS의 30U를 첨가하여 농축 된 RPMI 1640 완전 배지를 사용하여 재공급 국면에 대한 세포 배양 배지를 준비한다. 필터링하고 하루 내에 사용합니다. 보관하지 마십시오.</li>
	<li>RPMI 250mL 및 5mL 펜/스트렙이 포함된 세척 버퍼를 준비합니다. +4°C에 보관하고 2개월 이내에 사용하십시오.</li>
</ol>2. 인간 T 림프구 절연 및 문화로 T-25 플라스크
<ol><li>스테노틱 밸브 샘플을 워시 버퍼로 채워진 멸균 페트리 접시에 넣고 전체 밸브 샘플이 덮여 있는지 확인합니다. 15분 간 방치하십시오.</li>
	<li>메스를 사용하여 작은 조각으로 스테노틱 밸브를 자르고 10 분 동안 다시 방치하십시오.</li>
	<li>앞서 설명한 대로 IL-2의 50U로 세포 배양 배지를 준비하고 필터링한다.</li>
	<li>T25 플라스크 내부에 CCM을 추가하고 멸균 플라스틱 펜치를 사용하여 밸브 조각을 플라스크 내부에 놓습니다.</li>
	<li>플라스크를 CO2 인큐베이터 내부의 수직 위치에 1주일 동안 저장하여 현미경으로 플라스크의 상태를 관찰합니다. T 세포 클론은 배양 단계 후 약 3일 후에 표시되어야 한다; 더 나은 관찰을 위해 현미경 분석 전에 20 분 동안 플라스크를 수평 위치에 배치하는 것이 좋습니다. 참고: 세포 배양 배지의 양은 현재 샘플의 양과 얼마나 많은 T25 플라스크가 사용될지에 따라 달라집니다. 각 밸브는 플라스크 내부에 10mL의 CCM이 필요하다는 점을 고려할 때 T25 플라스크에서 25mL의 CCM이 3개의 밸브에 적합합니다.</li>
</ol>3. 복제 단계
참고: T 세포의 복제 단계의 경우, PBMC 프로토콜에 따라 조사된 버피 코트(BC)로부터 피더 세포의 분리로 시작해야 합니다.
<ol><li>바늘없는 밸브가달린 백 스파이크를 사용하여 라미나르 플로우 후드 아래에 BC 백을 열고 T150 플라스크에 50mL의 혈액을 옮긴다. 70mL의 PBS를 추가하여 플라스크 내부의 혈액을 희석시합니다.</li>
	<li>4개의 50mL 원문관을 가지고 각각 20mL의 밀도 그라데이션 배지를 배치하고 30mL의 혈액을 조심스럽게 층으로 배치하십시오.</li>
	<li>브레이크오프시 800xg에서 25분, 20°C의 원심분리기.</li>
	<li>신중하게 슈퍼 나티퍼를 흡인하고 폐기물로 폐기하십시오. PBS 솔루션 내부에 최대 50ml의 부피까지 추가하는 새로운 50ml 원물 튜브에서 PBMC 링을 수집합니다.</li>
	<li>원심 분리기는 400 x g 및 20 °C에서 10 분 동안.</li>
	<li>50mL의 부피까지 PBS 용액 내부에 추가하여 상체를 버리고 펠릿을 일시 중단합니다. 400 x g 및 20°C에서 10분 동안 원심 분리 단계를 반복합니다.</li>
	<li>상체를 버리고 10mL의 세포 배양 배지에서 FC를 중단한다.</li>
	<li>새로운 수집 튜브를 가지고 PBS 1:10으로 FC를 희석하고 FC 및 세포 배양 배지로 튜브에서 9.9mL의 PBS 및 100 μL 내부를 추가하여 희석하십시오. 파이펫으로 잘 헹구고 이 희석에서 7 μL을 취하고 현미경의 밑에 세포를 계산하십시오.</li>
	<li>복제 단계에 대한 세포 배양 배지 준비: IL-2의 50U를 가진 70 mL, 다음 두 개의 50 mL 원추형 튜브로 분할, 각 튜브는 세포 배양 배지의 25 mL을 포함합니다, 아래 설명처럼:<ul style="list-style-type: disc;">
<li>튜브 1: CCM + FC 25mL + 식물성 헤마글루티닌 0.6%</li>
		<li>튜브 2: CCM + T 림프구 25mL 참고: PMBC 방법의 목적은 각 mL에 대해 2 x 106 셀을 획득하는 것이므로 제조된 CCM(Tube 1)의 25mL(Tube 1)을 그에 따라 계산해야 합니다. 사용되는 일반 수식은 : 계산 된 셀 수 x 106 : 1 mL = CCM x 106 : X</li>
	</ul>
</li>
</ol>4. 멀티웰 플레이트의 T 림프구 배양
<ol><li>전자 파이펫을 사용하여 플라스크 내부의 모든 세포 배양 배지를 수집하고 50mL 원추형 튜브로 옮킨다. 빈 플라스크를 버릴 수 있습니다.</li>
	<li>400 x g 및 20°C에서 10 분 동안 원심 분리에 의해 세포를 펠렛.</li>
	<li>상체를 버리고, PBS의 50mL에서 펠릿을 중단하고 400 x g 및 20 °C에서 10 분 동안 원심 분리에 의해 세포를 수집합니다. 이 단계를 두 번 반복합니다.</li>
	<li>상체를 버리고 CCM의 1 mL에서 펠릿을 중단하십시오. 이 희석에서 7 μL을 가지고 현미경의 밑에 세포를 계산합니다. 참고: 세수 셀의 수는 챔버의 부피와 적용된 희석을 곱해야 합니다.</li>
	<li>세포 배양 배지에서 105 에서 103 으로 계산된 세포를 희석한 다음 103 에서 500 μL을 복용한 다음 튜브 2 내부에 넣습니다.</li>
	<li>튜브 1의 25mL 세포 배양 배지를 100mm x 15mm 플라스틱 페트리 접시 안에 붓습니다.</li>
	<li>4 개의 96-U 바닥 멀티웰 플레이트를 가지고 각 우물에서 100 μL 시드 FC로 설정된 멀티 채널 파이펫을 사용하십시오.</li>
	<li>튜브 2를 가져 와서 페트리 접시 안에 세포 배양 배지를 붓습니다. 100 μL로 설정된 멀티채널 파이펫을 사용하여 각 우물의 T 셀을 시드합니다.</li>
	<li>멀티웰 플레이트를 CO2 인큐베이터 내부에 1주일 간 보관합니다.</li>
</ol>5. 첫 번째 재공급 단계
<ol><li>조사된 버피 코트 백을 사용하여, 이전 방법에 설명된 바와 같이 PBMC 방법을 따라 FC를 얻을 수 있습니다.</li>
	<li>PHA 없이 적절한 양의 CCM을 준비하고 필터링합니다.</li>
	<li>멀티채널 파이펫을 사용하여 각 우물에서 100 μL을 제거하여 우물 바닥을 만지지 않도록 합니다.</li>
	<li>모든 우물에 100μL의 FC를 공급층으로 추가하여 세포 배양 영양소를 제공하고 배지를 변경합니다. 참고 : 각 멀티 웰에 대해 CCM의 6 mL을 고려하는 것이 좋습니다, 그래서 4 멀티 웰에 대한 권장 수량은 약 30 mL입니다. PHA(총 CCM 수량의 0.4%)를 2주에 한 번씩 CCM에 추가해야 합니다.</li>
</ol>6. 두 번째 재공급 단계
<ol><li>위에서 설명한 구절에 따라 재공급 단계를 반복한다. 0.4% PHA는 세포 배양 배지에 첨가될 필요가 있다.</li>
</ol>7. 1 우물 / 샘플에서 2 우물 / 샘플로 첫 번째 분할 단계
<ol><li>현미경의 밑에 있는 모든 4개의 멀티웰을 확인하고 T 세포 클론 (TCC)로 그 우물을 분할전진하십시오.</li>
	<li>조사된 버피 코트 백에서 피더 셀을 분리하기 위해 PBMC 프로토콜을 따릅니다.</li>
	<li>IL-2의 30U로 세포 배양 배지를 준비한다. FC를 추가하고 U 바닥으로 새로운 96 웰 플레이트를 가져 가라.</li>
	<li>100 μL로 설정된 파이펫을 사용하여 선택한 샘플의 우물 내부에 잘 헹구고 각각 에 포함된 200 μL의 부피를 새로운 멀티웰 플레이트의 2개의 새로운 우물로 나누어 새로운 2개의 우물 각각에 대해 100μL의 부피를 갖습니다.</li>
	<li>모든 새로운 우물 안에 100 μL의 FC를 추가합니다. 각 우물에는 총 부피가 200 μL이어야 합니다.</li>
	<li>파이펫을 100 μL로 설정하고 100 μL을 추가2개의 우물에 추가하여 제어 역할을 하는 FC만 포함합니다. 참고: 라이트 현미경 검사를 사용하여 모든 다중웰 플레이트를 관찰하여 TCC가 성공적으로 성장한 우물을 결정합니다. 클론의 선택을 쉽게 하기 위해 컨트롤(FC만 포함하는 두 개의 우물)에 대한 비교를 할 수 있으며, 복제본은 컨트롤에 비해 어둡고 더 크게 나타납니다. 선택해야 할 우물은 크고 맑고 둥근 클론을 가진 우물이며 림프구는 조밀하게 함께 포장됩니다. 2주 간의 재수유 후에 는 TCC가 없는 경우 1주일 이상 기다렸다가 추가 재공급 단계를 수행하는 것이 좋습니다.</li>
</ol>8. 2 우물 / 샘플에서 4 우물 / 샘플로 두 번째 분할 단계
<ol><li>파이펫을 100 μL로 설정하고 각 샘플의 두 우물 안에 잘 헹구고 각 샘플에 대해 100 μL의 두 개의 새로운 우물을 시드합니다.</li>
	<li>IL-2의 30U로 세포 배양 배지를 준비하고 PBMC 기술을 따라 버피 코트 백에서 FC를 추출하고 CCM 내부에 FC를 배치합니다.</li>
	<li>파이펫을 100 μL로 설정하고 모든 우물에서 FC를 시드합니다. 멀티웰을 CO2 인큐베이터에 1주일 동안 보관합니다.</li>
</ol>9. 4 우물 / 샘플에서 8 우물 / 샘플로 세 번째 분할 단계 :
<ol><li>100 μL로 설정된 멀티채널 파이펫을 사용하여 각 샘플의 4개의 우물 안에 잘 헹구고 새로운 96웰 플레이트의 4개의 새로운 우물에 100 μL을 시드합니다.</li>
	<li>세포 배양 배지를 준비하고 PBMC 기술을 따라 조사된 버피 코트 백에서 FC를 추출합니다.</li>
	<li>CCM 내부에 FC를 배치합니다. 파이펫을 100 μL로 설정하고 모든 우물에서 FC를 시드합니다. 멀티웰을 CO2 인큐베이터에 1주일 간 보관</li>
</ol>10. 세포불화 분석
<ol><li>CO2 인큐베이터에서 가장 오래된 날짜와 멀티웰 플레이트를 가지고 분석할 샘플 번호로 수집 튜브를 식별합니다.</li>
	<li>2개의 팁이 있는 200 μL로 설정된 멀티채널 파이펫을 사용하여 동일한 샘플의 두 우물 안에 철저히 헹구고 동일한 수집 튜브 안에 모두 넣습니다. 모든 샘플에 대해 이 단계를 반복합니다. 참고: FC 샘플은 컨트롤로만 작동하므로 분석되지 않습니다.</li>
</ol>11. 세포성 플루오리메트릭 분석을 위한 항체 염색 패널 준비
<ol><li>각 튜브및 원심분리기에 대해 1mL의 PBS 용액을 400 x g 및 20°C에서 10분 간 추가합니다.</li>
	<li>원심 분리 단계 후 상체를 폐기합니다. 참고: 항체 염색 패널은 표 1에서 찾을 수 있습니다. 계산된 각 단일 항체 농도는 약 2 μL/시료이다. 사용하기 전에 항체 튜브를 잠시 회전하는 것이 좋습니다. 불소로포레가 공주된 항체를 빛으로부터 보호하기 위해 모든 단계는 어둠 속에서 수행되어야 합니다.</li>
	<li>1.5 mL 튜브 내부의 항체 혼합을 준비하고 소용돌이.</li>
	<li>샘플 내부에 항체를 추가하고 15 분 동안 실온에서 어둠 속에서 배양하기 위해 샘플을 둡니다.</li>
	<li>각 샘플에 PBS 1mL을 추가하고 원심분리기는 400 x g 및 20°C에서 10분 동안 추가합니다.</li>
	<li>상체를 버리고 PBS 용액의 500 μL로 펠릿을 일시 중단하십시오.</li>
	<li>세포불화 분석(FACS 분석, 표 1)을 진행한다. 참고: 스테인드 샘플은 PBS 용액에서 희석된 0.5% 파라포름알데히드(PFA)를 사용하여 고정할 수 있으며 최대 15일 후에 분석할 수 있습니다. 주의: PFA는 독성이 있으며 신중하게 처리해야 합니다.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>마커</td>
			<td>플루오로포레</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3</td>
			<td>PE/Cy7</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD4</td>
			<td>알렉사 플루어 488</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8</td>
			<td>화려한 바이올렛 510</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD14</td>
			<td>브릴리언트 바이올렛 421</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD25</td>
			<td>PE</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45</td>
			<td>화려한 바이올렛 711</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1. 석회화 대동맥 판막 질환에서 T 림프구 집단을 검출하는 항체 염색 패널.

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여기서 는 유동 세포측정법을 사용하여 스테노성 대동맥 판막 시료로부터 분리된 T 림프구 하위 모집단을 특성화하는 방법을 제시합니다. 이 방법은 조사 된 버피 코트를 사용하여 PBMC를 격리해야합니다. 버피 코트 백이 반드시 복종해야 하는 방사선 주파수는 9000 Rad/90 Gray(Gy)이며 피더 세포의 증식을 중단하는 중요한 단계를 나타냅니다. 버피 코트 백에서 분리 된 세포의 역할은 피더 세포로만 작용하고 밸브에서 분리 된 T 세포에 대한 영양소를 제공하는 것입니다. 지난 25년에 언급된 바와 같이, 비단한 버피 코트 백을 사용하면 문화분야에서 PBMC의 확산을 촉진할 수 있습니다. 90 이하의 방사선 주파수는 문화권에서 PBMC의 증식을 보여주었기 때문에 정확히 90Gy의 방사선을 사용하는 것이 좋습니다. 참고로, 같은 날 또는 대부분의 다음 날에 조사된 버피 코트를 사용하여 지속적인 동요를 유지하는 장치에 보관하는 것이 좋습니다. 이 방법의 또 다른 중요한 단계는 유물의 영향을...

석회화 대동맥 판막 질환 (CAVD)은 가장 흔한 심장 판막 질환 중 하나이며 의료에 큰 영향을 미칩니다. 지난 몇 년 동안 대동맥 판막 교체의 빈도가 급격히 증가하고 있으며, 고령인구가 증가함에 따라 더욱 증가할 것으로 예상됩니다1.
CAVD의 근본적인 병리생리학은 부분적으로만 알려져 있으며 현재 치료 전략은 외과 또는 경피 적 절차를 통해 보수적 인 조치 또는 대동맥 판막 교체로 제한됩니다. 현재까지, 어떤 효과적인 치료도 CAVD 진행을 방해하거나 되돌릴 수 없으며 높은 사망률은 대동맥 판막 교체(AVR)가 수행되지 않는 한 초기 증상 발병과 관련이 있습니다2. 심한 증상 대동맥 협착증 환자에서 3 년 증상없는 생존은 20%3으로 낮게 보고되었습니다. Transcatheter 대동맥 판막 교체 (TAVR)는 새로운 옵션을 나타냅니다, 고위험 환자에 대한 치료를 혁명, 특히 노인 중 극적으로 사망률을 감소했다, 이는 본질적으로 이 인구4,5,6. TAVR의 유망한 결과에도 불구하고, 새로운 초기 치료 목표를 확인하기 위해 CAVD 병리 생리학을 이해하기 위해 추가 연구가 필요합니다7,8,9.
이전에는 수동적이고 퇴행성 공정으로 여겨졌던 CAVD는 이제 대동맥 판막 간질 세포의 골세포 표현형 스위치를 특징으로 하는 활성 진행성 질환으로 인식되고 있다10. 이 질병은 진행성 광물화, 섬유질 변화 및 대동맥 판막 전단지 (경화증)의 감소 된 운동성을 포함하며 궁극적으로 대동맥 판막 개구부의 협착 (협착)으로 이어지는 혈류를 방해합니다11.
염증은 혈관 동맥 경화증의 과정과 유사한 CAVD 병리 생리학의 중요한 과정으로 간주됩니다. 내피 손상은 지질 종, 특히 대동맥 판막12에서 산화 지단백질의 증착 및 축적을 가능하게합니다. 이러한 산화 지단백질은 염증 반응을 유발, 그들은 세포 독성으로, 미네랄화로 이어지는 염증 활성. CAVD 개발 및 질병 진행에서 선천적이고 적응성 면역의 역할이 최근 강조되고 있다13. 메모리 T 세포의 특정 하위 집합의 활성화 및 복제 확장은 CAVD 및 광물화 대동맥 판막 전단지 환자에서 문서화되어 염증 과정이 적어도 CAVD의 개발에 관여하는 것으로 가정되고 아마도 질병 진행에 관여할 수 있도록14. 사실, 항원 제시 세포및 대식세포는 건강하고 병든 판막둘다 존재하더라도, T 림프구의 존재는 노인과 병든 대동맥 판막을 나타낸다. 이 림프구성은 신생아와 대사의 증가와 함께 침투하는 것은 CAVD15의 특징적인 조직학적 징후이다.
우리는 대동맥 판막 간질 세포와 면역 계통의 활성화 사이의 상호 작용의 존재를 가설, 이는 잠재적으로 대동맥 판막에서 만성 염증 과정의 개시를 트리거. 스테노성 대동맥 판막 조직에서 T 세포의 분석은 생체 내 대동맥 판막 세포의 밀접한 표현을 제공 할 수 있기 때문에 석회화 발달에서 자신의 역할을 명확히하는 효율적인 방법이 될 수 있습니다. 본 작업에서, 대동맥 판막 조직을 사용하여, 우리는 T-림프구를 분리하고, 배양하고 복제하고, 그 후에 형광 활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하여 그(것)들을 특성화합니다. 신선한 대동맥 판막 샘플은 중증 대동맥 협착증에 대한 외과 용 판막 교체를받은 CAVD 환자로부터 절제되었습니다. 수술 후, 신선한 판막 샘플은 작은 조각으로 해부되었고 T 세포는 배양되었고, 그 후 유동 세포 측정을 사용하여 분석하였다. 염색 절차는 간단하고 스테인드 튜브는 파라포름알데히드의 0.5%를 사용하여 고정할 수 있으며 최대 15일 후에 분석할 수 있습니다. 스테닝 패널에서 생성된 데이터는 개입과 관련하여 시간이 지남에 따라 T 림프구 분포의 변화를 추적하는 데 사용될 수 있으며 특정 T 세포 하위 집합의 활성화 상태를 평가하기 위해 쉽게 더 발전될 수 있다.
석회화 된 조직의 추출, 석회화 된 조직에서 백혈구의 분리 및 특히 조직의이 유형에 유동 세포종의 사용은 자동 형광과 같은 문제로 인해 어려울 수 있습니다. 이 특정 목적에 대한 프로토콜이 존재하는 간행물은 거의 없습니다16,17,18. 본 발명에서는 인간 대동맥 판막 시료로부터 T 림프구의 직접 절연 및 배양을 위해 특별히 설계된 프로토콜을 제시한다. 림프구의 클로날 확장은 적응성 면역의 특징입니다. 시험관 에서이 과정을 연구 림프구 이질성의 수준에 통찰력있는 정보를 제공합니다19. 3주 간의 인큐베이션 기간 이후에, T 세포 클론은 각 클론으로부터 적절한 양의 T 세포를 얻어서, 표현성 및 기능적 연구를 허용하도록 하여 배분할 준비가 되어 있다. 그 후 T 클론의 표현형은 세포성 평성에 의해 연구된다.
이러한 면역 학적 프로토콜은 이전에 Amedei 외에 의해 개발 된 방법의 적응이다 T 세포 격리 및 인간 조직에서 특성화, 특히 CAVD20,21,22에서와 같은 석회화 인간 조직을 위해 설계. 조사된 버피 코트를 이용한 PBMC(말초 혈액 단핵세포)의 분리를 위한 프로토콜은 밸브 간질 세포로부터 분리된 T 림프구의 복제 상을 위해 특별히 조정된 피더 세포(FC)를 얻는 효과적인 방법을 설명합니다. 피더 층은 여전히 실행 가능하고 생리활성인 성장 체포 된 세포로 구성됩니다. 피더 세포의 역할은 밸브 간질 세포23에서 분리된 T 림프구의 체외 생존 및 성장을 지원하는 것이 중요합니다. 배양에서 피더 세포 확산을 피하기 위해, 이러한 세포는 성장 체포를 받아야한다. 이는 조사와 같은 물리적 방법을 통해, 또는 미토마이신 C(MMC)와 같은 세포독성 화학물질로 치료를 통해 배양 표면에 직접 적용될 수 있는 항종양 항생제24로 달성될 수 있다. 여기서 우리는 세포 조사를 통해 달성 된 피더 세포 성장 체포를 보여줍니다.
이 방법은 대동맥 판막 조직에서 T 세포를 분리하고 특성화하는 효율적이고 비용 효율적인 방법을 제시하여 CAVD 병리생리학을 탐구하기 위한 면역 학적 방법의 스펙트럼을 넓히는 데 기여합니다.

<table><tbody><tr><td>50 mL 플라스틱 주사기</td><td>Fisherbrand</td><td>9000701</td><td></td></tr><tr><td>96- 웰 U- 바닥 멀티웰 플레이트</td><td>Greiner Bio-One</td><td>10638441</td><td></td></tr><tr><td>Bag Spike (바늘 무료)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td> PBS CD14<td>로 4%로 희석</td></tr><tr><td>Brilliant violet 421</td><td>&nbsp; 바이오레전</td><td>드 560349</td><td></td></tr><tr><td>CD25 PE</td><td>&nbsp; 바이오레전</td><td>드 302621</td><td></td></tr><tr><td>CD3 PE/Cy7</td><td>&nbsp; Biolegend</td><td>300316</td><td></td></tr><tr><td>CD4 Alexa Fluor 488</td><td>&nbsp; 바이오레전</td><td>드 317419</td><td></td></tr><tr><td>CD45 브릴리언트 바이올렛 711</td><td>&nbsp; Biolegend</td><td>304137</td><td></td></tr><tr><td>CD8 브릴리언트 바이올렛 510</td><td>&nbsp; Biolegend</td><td>301047</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 튜브 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>13094697</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 튜브 0.5 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB0533</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 mL 코니컬 원심분리기 튜브</td><td>, Falcon</td><td>10136120</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL 코니컬 원심분리기 튜브</td><td>, Falcon</td><td>10788561</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Round-Bottom 폴리스티렌 튜브</td><td>BD</td><td>2300E</td><td></td></tr><tr><td>Fast read 102 플라스틱 계수 챔버</td><td>KOVA INTERNATIONAL</td><td>630-1893</td><td></td></tr><tr><td>배양 배지 250mL</td><td>Nalgene용 필터Thermo Fisher Scientific</td><td>168-0045</td><td></td></tr><tr><td>배양 배지용 필터 500mL</td><td>NalgeneThermo Fisher Scientific</td><td>166-0045</td><td></td></tr><tr><td>HB 101 동결건조 보충제</td><td>Irvine Scientific</td><td>T151</td><td></td></tr><tr><td>HB Basal Medium</td><td>Irvine Scientific</td><td>T000</td><td></td></tr><tr><td>열 비활성화 FBS (소 태아 혈청)</td><td>Euroclone</td><td>ECS0180L</td><td></td></tr><tr><td>HS (인간 혈청)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3667</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-2 IS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-744</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Falcon</td><td>352057</td><td></td></tr><tr><td>비필수 아미노산 용액</td><td>Sigma</td><td>11082132001</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10538931</td><td></td></tr><tr><td>PBS (인산염 완충 식염수)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td></td><td>15070063 10000 U/mL</td></tr><tr><td>PHA (phytohemagglutinin)</td><td>줄기세포 Technologies</td><td>7811</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 페트리 접시</td><td>Thermo Scientific</td><td>R80115TS</td><td>10 0mm x 15 mm</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Media</td><td>HyClone</td><td>15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Gibco by Life technologies</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Syringe Filters 0,45&micro; l</td><td>Rotilabo-Spritzenfilter</td><td>P667.1</td><td></td></tr><tr><td>T-25 세포 배양 플라스크</td><td>InvitrogenThermo Fisher Scientific</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>T-75 세포 배양 플라스크</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10232771</td><td></td></tr><tr><td>&beta;- Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>A2916801</td><td></td></tr></tbody></table>

조사 된 버피 코트에서 피더 세포를 사용하여 t 림프구의 격리 및 배양을 통해 대동맥 밸브 석회화 조사

Investigating Aortic Valve Calcification via Isolation and Culture of T Lymphocytes using Feeder Cells from Irradiated Buffy Coat

석회화 대동맥 판막 질환 (CAVD), 밸브의 온화한 두껍게에서 심한 석회화에 이르기까지 활성 질병 과정, 고체 대동맥 판막 교체 (TAVR)와 같은 새로운 치료 옵션에도 불구하고, 높은 사망률과 연관된다. 
밸브 석회화로 시작하여 심각한 대동맥 협착증으로 이어지는 전체 경로는 부분적으로만 이해됩니다. 생체 내 대동맥 판막 세포의 밀접한 표현을 제공함으로써, 스테노판 막부 조직에서 T 림프구의 분석은 석회화의 발달에 있는 그들의 역할을 명확히 하는 능률적인 방법이 될 수 있었습니다. 수술 후, 신선한 대동맥 판막 시료는 작은 조각으로 해부되고 T 림프구가 배양되고 복제된 다음 형광 활성 세포 분류(FACS)를 사용하여 분석합니다.
염색 절차는 간단하고 스테인드 튜브는 파라포름알데히드의 0.5%를 사용하여 고정할 수 있으며 최대 15일 후에 분석할 수 있습니다. 염색 패널에서 생성된 결과는 개입과 관련하여 시간이 지남에 따라 T 세포 농도의 변화를 추적하는 데 사용될 수 있으며 관심의 특정 T 세포 아류형의 활성화 상태를 평가하기 위해 쉽게 더 발전될 수 있다. 이 연구에서는, 우리는 새로운 석회화 대동맥 판막 샘플과 CAVD 병리생리학에서 적응성 면역의 역할을 더 이해하기 위해 유동 세포 세포를 분석하는 단계와 T 세포 클론에 수행 T 세포의 절연을 보여줍니다.

우리는 중증 대동맥 판막 협착증 (프로토콜 참조)을 가진 인간 환자에게서 파생된 신선한 대동맥 판막 샘플의 백혈구 집단을 특성화하기 위하여 간단하고 비용 효과적인 방법을 이용했습니다. PBMC를 격리하는 방법은 실험의 모든 단계(복제, 재공급 및 분할 단계)에 사용되는 피더 세포를 획득하는 데 중요한 단계이며 대동맥 밸브 샘플에서 백혈구에 침투하는 검출 및 특성화를 가능하게 합니다. 이 메서드의 주요 단계는 그림 1에 표시됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62059/62059fig01.jpg"> 그림 1. FC는 버피 코트에서 격리됩니다. (A) 밀도 그라데이션 배지(<s...

이 연구에서는, 우리는 유동 세포 분석분석을 사용하여 적응성 백혈구 하위 집합의 특성화를 위한 T 세포 복제의 신선한 견본 및 T 세포 복제의 분석 단계에서 T 림프구 절연의 과정을 기술합니다.

조사 된 버피 코트에서 피더 세포를 사용하여 T 림프구의 격리 및 배양을 통해 대동맥 밸브 석회화 조사

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high ...

이 프로토콜은 수행하기 쉽습니다. 복제 단계는 신선한 샘플에서 더 많은 수의 T 클론을 얻을 수 있게 합니다. 더욱이, T 세포의 표현형 및 기능을 쉽게 분석할 수 있다.절차를 시연하는 것은 메리 크리스토퍼, 내 실험실에서 박사 과정 학생이 될 것입니다. T 세포 복제를 유도하려면 바늘이 없는 밸브가 달린 백 스파이크를 사용하여 라미나르 플로우 후드에 조사된 버피 코트 백을 엽니다. 가방에서 최대 50밀리리터의 혈액을 T-150 플라스크로 옮기고 70밀리리터의 PBS를 플라스크에 넣습니다.4개의 50 밀리리터 원액 튜브 각각에 있는 20 밀리리터의 밀도 그라데이션에 희석된 혈액의 30 밀리리터를 주의 깊게 층으로, 밀도 그라데이션 원심분리에 의해 세포를 분리한다. 신중하게 슈퍼나탈을 흡인하고, 각 튜브에서 PBMC를 하나의 새로운 50 밀리리터 튜브로 전송합니다. PBS를 사용하여 최종 볼륨을 50밀리리터로 가져오고 원심분리로 PBMC를 수집합니다.동일한 조건하에서 두 번째 세척 후, 셀 배양 배지의 10 밀리리터에서 격리 된 피더 세포를 중단하고, 2 개의 50 밀리리터 튜브 각각에 IL-2 용액 50 단위로 보충 된 70 밀리리터 세포 배양 배지의 25 밀리리터를 추가합니다. 그런 다음 IL-2 농도로 보충된 세포 배양 배지의 밀리리터 당 6세포에 2-10의 튜브에 피더 세포를 첨가한다. T 림프구 배양을 설정하려면 스테노틱 밸브 샘플 플라스크에서 슈퍼나티를 포함하는 T 셀 클론을 단일 50 밀리리터 튜브로 풀링하고 원심분리로 세포를 수집합니다.세척당 PBS의 50 밀리리터에서 펠릿을 세 번 세척한 후 셀 배양 배지의 1 밀리리터에서 세포를 재보설한다. 셀을 밀리리터 농도당 3번째 세포에 11로 희석하고, 피더 세포 없이 IL-2로 보충된 세포 배양 배지의 튜브에 500 마이크로리터를 첨가한다. 피더 셀 서스펜션을 플라스틱 100 x 15 밀리리터 페트리 접시에 추가하고 실험을 위해 적절한 수의 U-bottom 96-well 플레이트의 각 웰에 100 마이크로리터의 피더 셀을 추가합니다.그런 다음 T 세포를 페트리 접시에 추가하고 세포 배양 인큐베이터에서 1 주일 동안 잘 보충 된 각 피더 셀에 100 마이크로 리터를 추가합니다. PBMC 절연은 피더 세포를 획득하고 대동맥 밸브 샘플에서 백혈구에 침투하는 검출 및 특성화를 가능하게 하는 데 매우 중요합니다. 2주 간의 배양 후 클론 T 세포 집단을 얻을 수 있다.여기서, 석회화 대동맥 판막 질환 환자의 T세포 하위집단을 분석하기 위한 게이팅 방식이 도시된다. 이 환자에서 관찰된 바와 같이, CD8+T 세포보다 더 많은 CD4+T 세포가 있었다. 복제되지 않은 T 세포의 흐름 세포 측정 분석은 동일한 T 세포 마커가 네이티브 밸브 및 클론 샘플 모두에 존재하는지 확인합니다.종합하면, 이 데이터는 T 세포가 CD45+백혈구를 가진 석회화한 대동맥 판막에 존재한다는 것을 나타내며, 석회화 대동맥 판막 질환이 면역 계통및 염증 활성의 활성화와 관련이 있음을 시사합니다. 이 방법은 매우 다재다능합니다. 그것은 연구원이 기능적 특성화를 위해 조직에서 세포를 격리할 수 있어야 하는 다른 프로토콜에 적용될 수 있습니다.오염을 피하기 위해 멸균 조건하에서 작업하고 현미경으로 세포를 비판적으로 관찰하는 것이 중요합니다.

investigating-aortic-valve-calcification-via-isolation-culture-t

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 분리하고 심장 밸브 내피 세포 (VEC)의 culturing 순수한 인구를위한 방법을 제공합니다. VEC는 (雨 期) 또는 전단지의 양쪽으로부터 격리하고 즉시 다음과 같은 수 있습니다 기본 중간 세포 (VIC) 격리는 간단합니다.

판막병 내피 세포의 분리

본 논문은 aortas의 면역 성분을 조사하기 위해 흐름 cytometry 기반 방법을 제공합니다. 신문은 또한 별도로 주변 adventitia 및 혈관 벽을 검사 수 있습니다 추​​가 기법을 보여줍니다. 이 방법은 대동맥 leukocytes의 phenotypical 분석을 수행하고 죽상 경화증 연구에 대한 몇 가지 면역 assays을 적용하는 가능성을 엽니다.

Murine Aortas 이내에 면역 세포의 흐름 Cytometry 분석

이 비디오에서는 성인 마우스의 심장에서 대동맥 판막 간질 세포를 2단계 콜라겐분해효소 절차를 사용하여 분리하고 이후 소량의 성장 배지에서 배양하는 방법을 보여줍니다.

Isolation of Mouse Valve Interstitial Cells: 마우스 대동맥 판막에서 VIC를 분리하고 배양하는 효소 방법

이 비디오는 in vitro에서 혈관 평활근 세포의 동맥 내측 석회화를 평가하기 위한 염색 기술을 보여줍니다. 폰 코사 (von Kossa) 방법은 광화학 반응을 사용하여 석회화 부위에 금속성 은을 증착시키고 검은 색을 부여합니다.

Von Kossa 대동맥 혈관 평활근 세포의 염색: 동맥 내측 석회화 평가를 위한 체외 기술

이 비디오는 in vitro에서 대동맥 판막 간질 세포의 석회화를 평가하기 위한 분석 기술을 보여줍니다. 이 분석은 칼슘 이온과 반응하여 자주색 칼슘-비소 복합체를 형성하는 칼슘에 민감한 염료인 arsenazo III 시약을 사용하여 칼슘 농도를 정량화하는 데 도움이 됩니다.

대동맥 판막 간질 세포의 칼슘 농도를 측정하기 위한 석회화 분석

혈관 석회화는 인간의 심혈관 질환을 예측하는 중요한 인자이자 기여자입니다. 이 프로토콜은 근적외선 형광 이미징을 사용하여 배양된 1차 혈관 평활근 세포의 석회화를 유도하고 동물 대동맥의 석회화 및 대식세포 부담을 정량화하는 방법을 설명합니다.

대동맥 석회화와 염증의 혈관 평활근 세포 및 이미지의 석회화

이 문서에서는 식별하고 세포 내 염색에 의해 쥐의 신장, 대동맥 림프절 내에 존재하는 기능 T 림프구의 하위 집합을 정량화 및 유동 세포 계측법하는 자세한 방법을 제공합니다. 안지오텐신 II 유발 된 고혈압의 모델은 설명 단계별, 절차 및 유동 세포 계측법의 기본 원리 및 세포 내 염색하기 위해 선택되었다.

세포 내 염색 및 유동 세포 계측법은 고혈압의 모델에 쥐 대동맥, 신장 및 림프절에서 림프구 하위 집합을 식별하는

이 프로토콜 절연, 문화, 및 석 회화의 쥐 파생 밸브 중간 셀의 calcific 대동맥 밸브 질환 (CAVD)의 높은 생리 적 체 외에서 모델에 설명합니다. 이 쥐 모델의 착취 셀 및 분자 메커니즘이 복잡 한 병 적인 과정을 기초에 CAVD 연구를 촉진 한다.

절연 및 기본 쥐의 밸브 중간 세포: 관상동맥 밸브 석 회화를 공부 하는 새로운 모델

이 문서에서는 2단계 콜라게나아제 절차에 의한 마우스 대동맥 판막 세포의 분리에 대해 설명합니다. 격리된 마우스 밸브 세포는 체외 석회화 분석과 같은 상이한 분석체를 수행하고 대동맥 판막 광물화로 이어지는 분자 경로를 조사하는 데 중요합니다.

시험관 내 대동맥 판막의 석회화를 연구하기 위해 마우스 간막판 세포의 격리

이 프로토콜은 외과적 대동맥 판막 치환술 중 또는 사체 조직에서 추출한 인간 대동맥 판막의 수집과 환자 특이적 일차 판막 내피 및 간질 세포의 후속 분리, 확장 및 특성화를 설명합니다. 세포 생존율 및 표현형 특이성을 보장하는 데 필요한 프로세스에 대한 중요한 세부 정보가 포함되어 있습니다.

체외 질병 모델링을 위한 인간 일차 판막 세포의 분리

이 논문은 광물화 가능성을 관찰하기 위해 쥐 대동맥을 분리한 후 석회화된 세포외 소포를 추출하여 혈관 석회화를 얻고 평가하는 방법론을 제시합니다.

In Vitro 및 In Vivo 모델을 사용한 세포외 Vesicle-Mediated Vascular Calcification 분석

학습하세요 석회화된 대동맥 판막 조직에서 T 림프구를 분리하고 배양하는 방법을 통해 적응 면역이 CAVD에 미치는 영향을 연구하세요. 이 프로토콜은 면역 세포 기능 연구에 활용됩니다.

조사 된 버피 코트에서 피더 세포를 사용하여 T 림프구의 격리 및 배양을 통해 대동맥 밸브 석회화 조사

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