2020년 12월 23일
여기서, 우리는 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) RNA를 시각화하기 위하여 정시 혼성화 (RNA-FISH)와 면역형광에 있는 RNA 형광을 결합하는 간단한 방법을 기술합니다. 이 프로토콜은 단일 세포 수준에서 SARS-CoV-2 RNA 숙주 상호 작용의 분자 특성에 대한 이해를 증가시킬 수 있다.
이 프로토콜을 통해 세포주와 완전히 분화된 3차원 인간 기도 상피 배양에서 SARS-CoV-2 RNA를 시각화할 수 있게 되어 단일 세포 수준에서 바이러스 발병 기전 및 복제를 더 잘 이해할 수 있는 도구를 제공할 수 있었습니다. 이 방법은 특이성, 민감도 및 해상도가 높기 때문에 SARS-코로나바이러스-2에 대한 기초 과학 연구뿐만 아니라 진단과 같은 응용 프로젝트에도 유용합니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 박사 과정 학생인 Agnieszka Suder입니다.
텍스트 원고에 설명된 대로 세포를 고정하고 투과시킨 후 웰에서 1X PBS 용액을 제거하고 각 웰에 최소 300마이크로리터의 증폭 버퍼를 추가합니다. 실온에서 30분 동안 샘플을 배양합니다. 별도의 튜브에서 원하는 부피를 스냅 냉각하여 각 HCR 헤어핀을 준비합니다.
300마이크로리터의 증폭 용액을 준비하려면 각 헤어핀당 18피코몰을 사용하십시오. 헤어핀 용액을 튜브에 옮기고 섭씨 95도에서 90초 동안 배양합니다. 그런 다음 어둠 속에서 30분 동안 실온으로 식힙니다.
스냅 냉각 H1 및 H2 헤어핀을 증폭 버퍼에 추가하여 헤어핀 혼합물을 준비합니다. 30-50 마이크로 리터의 헤어핀 혼합물을 Parafilm에 떨어 뜨립니다. 세포가 든 커버슬립을 머리핀 혼합물 방울에 놓고 실온의 어둠 속에서 밤새 샘플을 배양합니다.
슬라이드를 장착하려면 슬라이드에 10마이크로리터 장착 매체 두 방울을 놓고 두 개의 커버슬립을 단일 슬라이드에 놓을 수 있도록 방울이 충분히 분리되었는지 확인합니다. 깨끗한 수건으로 커버 슬립을 두드려 여분의 액체를 제거하십시오. 그런 다음 세포가 아래를 향하도록 하여 페이드 방지 장착 매체에 놓습니다.
장착된 샘플을 어두운 곳의 건조하고 평평한 표면에 놓고 경화시킵니다. 본문 원고에 기술된 대로 HAE 세포를 고정 및 투과시킨 후, 실온에서 30분 동안 증폭 버퍼로 배양하여 샘플을 사전 증폭합니다. 각 헤어핀의 30피코몰을 사용하여 500마이크로리터의 증폭 용액을 준비합니다.
머리핀 용액을 튜브에 옮기고 섭씨 95도에서 90초 동안 배양합니다. 그런 다음 어둠 속에서 30분 동안 실온으로 식히십시오. 실온에서 500마이크로리터의 증폭 버퍼에 모든 스냅 냉각 헤어핀을 추가하여 헤어핀 용액을 준비합니다.
사전 제거amplification 용액을 추가하고 완전한 헤어핀 용액을 추가합니다. 그런 다음 어두운 곳에서 실온에서 밤새 샘플을 배양합니다. Transwell 인서트의 컷아웃 멤브레인을 셀이 위를 향하도록 하여 10마이크로리터의 페이드 방지 마운팅 미디어에 놓고 멤브레인에 추가 마운팅 미디어를 추가합니다.
그런 다음 커버 슬립으로 멤브레인을 덮으십시오. 이 immuno-RNA-FISH 프로토콜은 Vero 세포주와 3D 인간 기도 상피 배양이라는 두 개의 세포 시스템에서 수행되었습니다. 감염 및 모의 접종된 Vero 세포에서 SARS-coronavirus-2 아게놈 RNA의 국소화가 여기에 나와 있습니다.
바이러스 RNA는 빨간색으로 볼 수 있습니다. 감염 및 모의 접종된 인간 기도 상피 세포에서 SARS-coronavirus-2 subgenomic RNA 국소화가 나와 있습니다. 투과화 프로토콜은 Vero 세포에서 최적화되었습니다.
세제를 사용한 투과화는 SARS-코로나바이러스-2 아게놈 RNA에 대한 명확하고 특이적인 신호를 생성하는 반면, 에탄올을 사용하면 흐릿하고 초점이 맞지 않는 이미지가 생성됩니다. Vero 셀이 있는 슬라이드를 장착할 때 셀이 아래를 향하도록 커버슬립을 배치하는 것이 중요합니다. HAE 슬라이드를 장착할 때 세포가 위를 향하도록 멤브레인을 배치해야 합니다.
이 기술은 미래에 나타날 수 있는 비암호화 RNA 및 RNA 바이러스를 포함한 모든 RNA를 검출할 수 있도록 쉽게 수정할 수 있습니다. 면역형광과 결합하여 단세포 수준에서 단백질-RNA 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
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이 기사는 RNA 형광 in situ 하이브리다이제이션(RNA-FISH)과 면역형광법을 통합하여 SARS-CoV-2 RNA를 시각화하는 방법을 제시합니다. 이 접근법은 단일 세포 수준에서 SARS-CoV-2 RNA-숙주 상호작용에 대한 이해를 향상시킵니다.
High-resolution visualization of SARS-CoV-2 RNA in both cell lines and 3D human airway epithelium cultures enables precise mapping of viral replication and host-pathogen interactions at the single-cell level. This capability supports mechanistic de-risking and target validation in infectious disease research pipelines. The protocol's adaptability for diverse RNA targets positions it as a reusable asset for rapid response to emerging viral threats.
This immuno-RNA-FISH protocol integrates from early discovery through preclinical research, supporting hypothesis testing, target validation, and translational biomarker alignment.