Name: CRISPR/Cas9 게놈 편집 헬리코파 아르미게라 의 배아 미세 주입 및 녹아웃 돌연변이 식별 (휘브너) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: 배우세요 CRISPR/Cas9을 이용한 Helicoverpa armigera 배아 미세주입 및 녹아웃 돌연변이 식별 방법입니다. 이 기술은 유전자 기능과 상호작용을 연구하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 (31725023, GW에 31861133019, CY에 31171912)에 의해 지원되었다.

1. 유전자 특정 프라이머의 설계 및 sgRNA 의 준비
<ol><li>PCR 증폭 및 시퀀싱 분석을 통해 관심 유전자에서 보존된 게놈 영역을 확인합니다. 표적 유전자를 H. 아미게라 의 게놈 DNA로부터 증폭시키고 엑손과 인트론을 구별한다. 참고: 오프 타겟 유전자 편집을 피하기 위해 가이드 사이트의 서열 특이성이 필요합니다. 엑슨에 있는 가능한 가이드 사이트를 검색하는 것은 유전자의 5' UTR에 가깝습니다. 그런 다음 유전자가 완전히 작동하지 않는지 확인하는 것이 중요합니다. sgRNA의 준비를 위한 유동 경로에 대한 요약은 도 1에 도시된다.</li>
	<li>sgRNA 표적을 선택합니다. CRISPR 온라인 웹 사이트 CRISPOR (버전 4.97)를 사용하여 (버전 4.97) (http://crispor.tefor.net/crispor.py)를 사용하여 유전자의 5'UTR에 가까운 exons에서 가능한 가이드 사이트를 검색하십시오. 엑슨 서열을 텍스트 상자에 입력하고 목표 게놈을 헬리코파 아미게라 (Harm_1.0)로 선택한다. "20 bp-NGG"의 PROtospacer 인접 모티브 (PAM) 옵션을 선택하고 웹 사이트의 사용자 매뉴얼에 따라 기본 매개 변수에 다른 설정을 둡니다.</li>
	<li>소프트웨어의 예측 가이드 시퀀스를 비교하고 가장 높은 예측 효율과 가장 적은 불일치로 가이드 시퀀스를 선택하여 편집 효율성을 개선하고 오프 타겟 편집을 줄입니다. 5'UTR에 하나 또는 두 개의 G를 포함하는 20 bp 가이드 시퀀스가 절단 효율을 높일 수 있으므로 권장됩니다. 참고: 엑슨 영역의 gRNA 쌍은 또한 큰 세그먼트 삭제를 얻는 것이 좋습니다, 이는 이후 단계에서 돌연변이 검출을 단순화. 선택한 두 가이드 시퀀스 사이의 간격 거리가 최소 100bp인지 확인합니다. 이 프로토콜에서는 NGG 모티프를 인식하는 일반적으로 사용되는 SpCas9 단백질을 선택합니다. 제조업체의 지시에 따르면, 프로모터가 시퀀스의 5'UTR에 G를 추가하기 때문에 T7 프로모터를 선택할 때 G가 부족한 가이드 시퀀스도 허용됩니다.</li>
	<li>앞으로 설계하고 올리고뉴클레오티드를 역방향으로 지정합니다. 시퀀스 순서를 5'-20 bp 가이드 시퀀스-NGG-3'로 설정하고 역방향 가이드 시퀀스를 보완합니다. gRNA 합성 키트의 사용자 가이드에 따라 T7 프로모터 서열을 전진 및 역가드 가이드 서열에 각각 추가합니다. 참고: PAM 서열 NGG는 올리고뉴클레오티드 서열에서 제외되어야 한다.</li>
	<li>gRNA 합성 키트를 사용하여 sgRNA를 생성한다. 이 과정에는 DNA 템플릿 조립, 시험관 내 전사 및 sgRNA의 정화(도 2)의 세 가지 단계가 포함됩니다. 사용자 지침에 따라 각 단계를 수행합니다.</li>
</ol>2. 배아 준비 및 수집
<ol><li>Hongtao et al.34 에 의해 기술된 바와 같이 남성과 암컷 새끼를 분리하고 두 개의 다른 그물 케이지로 분리합니다. 백과착 후, 페트리 접시에 흡수성 면에 10 % (w / v) 백색 설탕 용액의 ~ 30 mL을 공급합니다. 참고: 백색 설탕 3 g을 멸균 수분 30mL에 용해하여 10%(w/v) 백색 설탕 용액을 준비했습니다.</li>
	<li>각각 3일 된 남성과 2 일 된 여성에서 50 명의 건강한 개인을 선택하고 깨끗한 그물 케이지에 섞습니다. 10% (w/v) 설탕 용액이 들어 있는 코튼 을 케이지에 넣고 면이 촉촉하게 유지합니다. 그물 케이지를 거즈로 덮고 거즈를 고무 밴드로 고정합니다. 촉촉한 상태를 유지하기 위해 거즈에 물을 뿌십시오.</li>
	<li>2단계에서 선택된 수컷과 암컷 나방을 완전히 짝짓기하고 계란 누워양을 관찰하도록 허용합니다. 참고: H. 아미게라 의 난소의 피크는 9:00 p.m 후에 나타납니다. 따라서 짝짓기 의 시간은 후속 단계에서 충분한 수의 계란을 보장하기 위해 고려되어야합니다. oviposition의 절정에, 검은 천으로 거즈를 교체하고 30 분 동안 무료 oviposition을 가능하게. 신선한 계란을 수집하기 위해 30 분마다 검은 천을 교체하십시오 (그림 3A).</li>
	<li>검은 천을 불규칙한 모양의 패치로 자르고 약 3mm의 크기로. 각 패치마다 더 많은 계란을 확인하십시오. 참고: 주름이 있는 계란은 일반적으로 수정되지 않기 때문에 선택하지 마십시오.</li>
	<li>양면 테이프를 현미경 슬라이드(25mm x 75mm)에 붙여 넣습니다(그림 3B). 집게를 사용하여 양면 테이프 표면에 계란을 연달아 붙여 넣습니다. 각 패치의 여백을 눌러 테이프에 단단히 고정되도록 합니다. 현미경 슬라이드 당 50-100 계란을 수집 (그림 3C). 참고: 패치는 양면 테이프의 전체 표면을 커버해야 하며, 그렇지 않으면 부화 애벌레가 기어나가는 데 어려움을 가지게 됩니다.</li>
	<li>미세 주입 하기 전에, 배아의 개발을 지연 하는 얼음에 현미경 슬라이드를 유지.</li>
</ol>3. 배아의 미세 주입
<ol><li>마이크로 피펫 풀러를 사용하여 모세관 유리를 당겨 바늘을 준비합니다 (도 4A). 열을 540으로 설정하고, 80으로 당기고, 벨을 75로 당기고, 시간은 170으로, 압력은 450으로 설정합니다. 마이크로 그라인더를 사용하여 바늘 팁을 접지합니다. 이상적인 바늘은 날카로운 팁 (그림 4B)을 보여줍니다.</li>
	<li>사출 솔루션의 준비. 상용화된 Cas9 단백질(1 mg/mL)과 sgRNA(300-500 ng/μL 최종 농도)를 PCR 튜브에 RNase 없는 물에 2μL을 추가하여 10μL 부피 혼합물을 얻습니다. sgRNA의 부피는 그것의 농도에 달려 있습니다. 파이펫팅으로 잘 섞어서 얼음 위에 놓습니다. 참고: 이 단계에서 사용되는 모든 파이펫 팁과 PCR 튜브는 RNase가 없습니다.</li>
	<li>전자 마이크로인젝터의 매개 변수를 설정합니다. 사출 압력(pi)을 1,500hPa로 설정하고, 주사 시간(ti)을 0.1s로, 보상 압력(pc)을 30hPa로 설정한다.</li>
	<li>마이크로 로더 파이펫 팁을 사용하여 혼합물의 2 μL을 바늘에 적재합니다. 바늘 끝에 있는 잔류 공기는 가능한 한 많이 소진되어야 합니다.</li>
	<li>주입 바늘을 마이크로 조작기에 연결하고 두 부분 간의 긴밀한 연결을 보장합니다.</li>
	<li>페트리 접시(100mm)에 슬라이드를 넣고 현미경의 무대에 놓습니다(그림 5A).</li>
	<li>바늘 끝과 배아가 현미경의 밑에 보일 때까지 가벼운 현미경의 밑에 바늘 끝의 위치를 조정합니다 (그림 5B).</li>
	<li>물방울의 볼륨을 조정합니다. 페달을 누르고 바늘 끝에서 액체 방울을 관찰하십시오. 액체 방울의 부피가 배아의 부피의 약 10 분의 1이 될 때까지 마이크로 인젝터의 주입 압력을 조정합니다. 참고: 주사 바늘의 품질은 배아의 생존율에 매우 중요합니다.</li>
	<li>조심스럽게 45도 각도 (그림 5C)에서 배아의 상단 반구에 바늘 팁을 삽입합니다. 페달을 눌러 혼합물을 배아로 전달합니다. 주사는 태아의 약간의 팽창으로 이어집니다. 배아에서 바늘을 즉시 철회하고 다음 배아가 바늘에 근접할 때까지 한 손으로 페트리 접시를 이동하고 동일한 절차로 다음 배아를 주입합니다. 참고: 핀홀의 세포질 유출은 허용됩니다. 세포질 누설이 너무 많은 경우, 유체 유출이 제어 될 때까지 바늘의 각도를 더 심각한 각도로 조정합니다.</li>
	<li>충분한 부화량을 보장하기 위해 적어도 300개의 배아를 주입하십시오. 주입 후 페트리 접시(es)의 뚜껑을 덮습니다. 참고: oviposition에서 50-100 배아의 주입에 이르는 시간은 2시간으로 제한됩니다. 배아의 대부분은 이 시간 프레임 내의 1세포 단계에 아직도 있습니다. 일반적으로, 효율성을 촉진하기 위해 배아 주입 시 배아 주사 시술을 반복하는 것이 유용하다.</li>
</ol>4. 사출 후 곤충 사육
<ol><li>G0 배아의 전파.<ol>
<li>14h 빛/10 h 어두운 인공 기후 상자에 60% 상대 습도 및 28°C에서 배아를 배양합니다.</li>
		<li>주사 후 매일 배아의 발달을 확인하십시오. 배아의 표면 색이 어두워지면 현미경 슬라이드 주위에 페트리 접시에 인공 식단을 넣고 12 시간마다 배아의 발달을 확인하십시오. 참고: 인공 식단은 우 외 35 및 Jha 외.36에 의해 설명된 대로 준비됩니다.</li>
		<li>24웰 의 문화 판을 준비하고 인공 식단으로 볼륨 용량의 3 분의 1에 각각을 채웁니다.</li>
		<li>작은 페인트 브러시를 사용하여 부화 애벌레(그림 5D)를 골라 24웰 배양판으로 옮겨 넣습니다. 각 애벌레가 생존하기에 충분한 음식이 있는지 확인하기 위해 우물당 하나의 애벌레를 삽입하십시오. 참고 : H. armigera 의 애벌레는 일반적으로 서로 식인화되었기 때문에 각 우물에서 개별적으로 사육되었습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>G0 애벌레 사육<ol>
<li>배아와 동일한 조건에서 애벌레를 후면합니다.</li>
		<li>매일 부화한 애벌레를 확인하십시오. 애벌레가 세 번째 인스타 단계로 성장하면 각 유충을 새로운 유리 다틸레스레이로 옮기고, 볼륨의 5분의 1을 인공 식단으로 채웁니다.</li>
		<li>잠복 후 약 12d, 성숙한 애벌레는 새끼를 시작해야합니다.</li>
		<li>G0 성숙한 강아지는 성별에 따라 구별되며 백과사전 전에 별도의 케이지에 배치됩니다. 야생 타입의 같은 나이 의 새끼도 준비되어 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>G0 성인 양육<ol>
<li>야생 유형과 돌연변이 푸파의 백과를 매일 확인하십시오.</li>
		<li>새로 동봉 된 G0 남성 성인과 야생 유형 여성 성인을 신선한 그물 케이지로 옮기고 약 1 :1에서 G0과 야생 유형 사이의 비율을 만듭니다. 면봉에 떨어뜨린 설탕 용액을 10%(w/v)로 공급합니다.</li>
		<li>상기 일상적인 방법을 사용하는 후방 곤충은 세대 1(G1)의 새끼까지.</li>
		<li>dactylethrae를 사용하여 새로 폐쇄 된 단일 G1 성인을 10 % (w / v) 설탕 용액으로 공급되는 플라스틱 항아리 (13cm x 12cm x 12cm)로 옮긴다. 각 항아리를 거즈로 덮습니다. 총 약 50 쌍의 G1 성인을 섭취하십시오. 참고 : 여성 나방의 백과 사전 남성 나방의. 일반적으로 3 일 된 남성과 2 일 된 여성은 성적으로 성숙하고 짝짓기를 할 준비가되어 있습니다. 새로 닫힌 성인은 먹이없이 첫 번째 가벼운 기간에 짝짓지 않습니다.</li>
		<li>G1 성인을 플라스틱 항아리에 담그고 알을 낳은 후 수집합니다. 각 성인 나방을 1.5 mL 원심 분리 튜브에 넣습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 녹아웃 돌연변이 감지
<ol><li>예측된 잘린 사이트에 걸쳐 프라이머 한 쌍을 디자인합니다. 프라이머는 대상 사이트에서 양쪽(업스트림 및 다운스트림)에서 최소 50bp 거리를 설정해야 합니다. 참고: 대상 시퀀스를 식별하기 위한 프라이머는 종종 큰 범위를 커버하여 효율적으로 증폭합니다.</li>
	<li>제1항에서 추출된 게놈 DNA를 사용한 지노피 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 수행한다. 20s에 대한 95 °C에서 PCR 사이클링을 수행; 20초동안 95°C의 35사이클, 20초용 55°C, 1분 동안 72°C; 72°C는 5분, 4°C를 보류한다. 1% (w/v) 아가로즈 젤을 통해 반응 제품을 확인합니다. 선택한 검출 프라이머는 PCR 제품의 품질에 의해 확인되었다. 밴드가 분명하고 구체적인 경우, 프라이머는 앰플리턴 크기에 따라 추가 돌연변이 감지에 사용될 수 있습니다.</li>
	<li>편집된 잠재적인 개인을 위한 화면입니다. 집게를 사용하여 뒷다리를 조심스럽게 제거하고 각 다리를 각각 용액 매트릭스 튜브에 넣습니다. 유리 dactylethrae의 수와 일치하는 라이싱 매트릭스 튜브에 라벨을 부착합니다.</li>
	<li>조직 균질화제를 사용하여 뒷다리를 균질화합니다. 속도를 6.0m/s로 설정하고 시간을 60s로 설정합니다. 제조업체의 지침에 따라 상용 gDNA 추출 키트를 사용하여 균질화된 샘플의 게놈 DNA를 추출합니다.</li>
	<li>2단계에서 설명된 것과 동일한 PCR 반응 조건을 가진 유전자 계피를 사용하여 유전자 세그먼트를 증폭시한다. 유전자 염기서열 분석 서비스에 의한 유전자형을 확인한다. 동일한 항아리에 포함된 G1 돌연변이 유전자형(동일한 부위을 표적으로 삼은)이 감지되면 G1 자성을 유지하고 2세대(G2)로 이름을 바꿉니다.</li>
	<li>동일한 유전자형의 G1 개인을 하나의 그물 케이지에 넣습니다. G1 자손을 자체 교차하고 동일한 방법을 사용하여 계속 화면을 합니다.</li>
	<li>유전자 세그먼트를 증폭시키고 2단계에서 설명된 것과 동일한 절차로 유전자형을 확인합니다. G2 동종구선을 얻고 녹아웃 돌연변이 라인을 유지합니다.</li>
</ol>

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<li>Garneau, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRISPR%2FCas+bacterial+immune+system+cleaves+bacteriophage+and+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA.</a> Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).</li>
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<li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096(2014).</li>
<li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+efficiency+of+human+pluripotent+stem+cell+genome+editing+through+replacing+TALENs+with+CRISPRs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs.</a> Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).</li>
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<li>Zheng, M. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-destructive+method+of+genotyping+individual+insects+from+the+exuviate+of+final+instar+larvae%2C+or+puparia%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+Applied+Entomology%22%5BJournal%5D)">A non-destructive method of genotyping individual insects from the exuviate of final instar larvae, or puparia.</a> Chinese Journal of Applied Entomology. (2), 21(2018).</li>
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</ol>

저자는 이해 상충이 없습니다.

CRISPR/Cas9 시스템의 적용은 다양한 유전자 간의 유전자 기능 및 상호 작용의 분석을 위한 강력한 기술 지원을 제공하고 있습니다. 우리가 여기에서 제시하는 상세한 프로토콜은 CRISPR/Cas9 게놈 편집을 통해 H. armigera 에 있는 homozygote 돌연변이의 생성을 보여줍니다. 이 믿을 수 있는 절차는 H. armigera에 있는 지시한 유전자 돌연변이 발생을 위한 간단한 쪽을 제공합니다.
CRISPR 대상 사이트의 선택은 돌연변이 발생 효율37에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 온라인 웹 사이트 CRISPOR의 여러 결과를 비교하고 분석하여 적절한 대상 사이트를 얻었습니다. 실리코에서 gRNA 예측은 몇 가지 장점을 제시합니다. 첫째, 그들은 오프 타겟 효과를 최소화하기 위해 sgRNA를 설계 할 때 H. armigera 의 전체 게놈을 분석합니다. 위에...

게놈 편집 기술의 응용 프로그램은 다양한 종에서 표적 유전자 돌연변이를 달성하기 위한 효율적인 도구를 제공합니다. 클러스터된 단락형 짧은 palindromic 반복(CRISPR)/관련 단백질 9(Cas9) 시스템의 출현은 게놈1을 조작하는 새로운 방법을 제공한다. CRISPR/Cas9 시스템은 가이드 RNA(gRNA)와 Cas9 endonuclease2,3로 구성되며, gRNA는 두 부분으로 더 나눌 수 있으며, 표적 보완 CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스 활성화 crRNA(tracrRNA)로 나뉩니다. gRNA는 Cas9 엔도누클레스와 통합하고 리보뉴클레오단백질(RNP)을 형성한다. gRNA를 사용하면 Cas9 엔도누벨리스는 기본 보완을 통해 게놈의 특정 부위로 향할 수 있습니다. Cas9의 RuvC 및 HNH 도메인은 프로토스페서 인접 모티프(PAM) 서열 전에 게놈 3기의 표적 부위를 크리브하고 이중 가닥 브레이크(DSB)를 생성한다. DNA 분열은 다음 두 가지 메커니즘을 통해 복구 할 수 있습니다, 비 동종 종조 (NHEJ) 또는 homology 지향 수리 (HDR)4. DSB의 복구는 표적 유전자를 비활성화하는 방법으로 삽입 또는 삭제를 소개합니다, 잠재적으로 유전자 기능의 완전한 손실을 일으키는 원인이 됩니다. 따라서 CRISPR/Cas9 시스템의 퇴적및 특이성은 생체 내에서 유전자 기능을 특성화하고 유전자 상호 작용을 분석하는 견고한 방법입니다5.
CRISPR/Cas9 시스템은 생물의학6,7, 유전자 치료8,9, 농업 10,11,12 등 다양한 분야에 적용되었으며 미생물13, 식물14,15, 선충제16 및 포유류17을 포함한 다양한 생물학적 시스템에 사용되어 왔습니다. . 무척추 동물에서는 많은 곤충 종은 과일 플라이 드로소필라 멜라노가스터와 그 너머 18,19,20,21,22와 같은 CRISPR/Cas9 게놈 편집을 실시했습니다.
헬리코파 아미게라는 전 세계적으로 가장 파괴적인 해충 중 하나이며, 면, 대두, 사탕수수를 포함한 수많은 작물을 손상시다. 시퀀싱 기술의 발달로, H. armigera의 게놈은 물론 Lepidoptera 곤충 종의 범위의 그, 완전히 시퀀싱되었습니다 26,27,28,29. 많은 수의 저항 및 후각 수용체 유전자가 최근 몇 년 동안 이들 곤충으로부터 확인되고 특징지어졌다19,27,28,29. 일부 저항 관련 유전자는 H. armigera에서 확인되었습니다, cadherin30에 대한 인코딩 유전자와 같은, ATP 결합 카세트 수송31,32, 뿐만 아니라 HaTSPAN133. CRISPR/Cas9 기술을 사용하여 이 유전자의 녹아웃은 취약한 긴장에서 바실러스 thuringiensis (BT) 독소에 저항의 높은 수준을 초래합니다. 또한, Chang et al. (2017)는 페로몬 수용체를 쓰러뜨려 짝짓기 시간 규정19에서 중요한 기능을 검증했습니다. 이 보고는 CRISPR/Cas9가 곤충 시스템에서 생체 내 유전자 기능을 공부하는 효과적인 공구로 작동할 수 있다는 것을 건의합니다. 그러나 곤충 시스템의 CRISPR/Cas9 수정에 대한 자세한 절차는 불완전하게 남아 있어 곤충 기능적 유전체학의 적용 범위를 제한합니다.
여기서, 우리는 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 H. armigera 에 있는 기능성 유전자를 노크하기 위한 프로토콜을 제시합니다. gRNA 생산을 위한 유전자 특이적 프라이머의 설계 및 준비, 배아 수집, 미세 주입, 곤충 사육 및 돌연변이 식별을 포함한 상세한 단계별 프로토콜이 제공됩니다. 이 프로토콜은 H. 아미게라 에 있는 어떤 기능성 유전자든지 조작하기 위하여 귀중한 참조 역할을 하고 그밖 Lepidoptera 종으로 확장될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>2kb DNA ladder</td><td>TransGen Biotech</td><td>BM101</td><td></td></tr><tr><td>Capillary Glass</td><td>World Precision Instrucments</td><td>504949</td> 양면 테이프 Minnesota Mining and Manufacturing Corporation 665 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf FemtoJet 4i Microinjector</td><td>Eppendorf Corporate</td><td>E5252000021</td><td></td></tr> <tr><td>프로토콜에서 "모세관 유리"라고 합니다.Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator</td><td>Eppendorf</td><td>Corporate 5192000051</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Microloader 피펫 팁</td><td>Eppendorf Corporate</td><td>G2835241</td><td></td></tr><tr><td>GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A29377</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>세일 브랜드</td><td>7105</td><td></td></tr><tr><td>Olympus</td><td>현미경 Olympus Corporation</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td></td><td>돌연변이 검출에 사용되는</td> <td>Takara Biomedical Technology</td><td>R040</td></tr><tr><td>Sutter Micropipette Puller</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>TIANamp 게놈 DNA 키트</td><td>TIANGEN Corporate</td><td>DP304-03</td><td></td></tr><tr><td>TrueCut Cas9 Protein v2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A36499</td><td></td></tr></tbody></table>

crispr/cas9 게놈 편집 헬리코파 아르미게라 의 배아 미세 주입 및 녹아웃 돌연변이 식별 (휘브너)

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (H&#252;bner)

면 볼웜헬 리코파 아미게라는 세계에서 가장 파괴적인 해충 중 하나입니다. 분자 유전학의 조합, 생리학, 기능적 유전체학, 행동 연구는 H. armigera 레피드 옵테라 녹투이대에서 모델 종했다. 다른 유전자 간의 생체 내 기능 및 상호 작용을 연구하기 위해 정기적으로 간격이 짧은 palindromic 반복 (CRISPR)/ 관련 단백질 9 (Cas9) 게놈 편집 기술은 기능적 게놈 연구를 수행하는 데 사용되는 편리하고 효과적인 방법입니다. 이 연구에서는 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 H. armigera 에서 유전자 녹아웃을 완료하는 단계별 체계적인 방법을 제공합니다. 가이드 RNA(gRNA)의 설계 및 합성은 자세히 설명되어 있다. 이어서, 가이드 RNA(gRNA) 생성, 배아 수집, 미세주입, 곤충 사육 및 돌연변이 검출을 위한 유전자 특이적 프라이머 설계로 구성된 후속 단계를 요약한다. 마지막으로, 유전자 편집의 효율성을 개선하기 위해 문제 해결 조언과 메모가 제공됩니다. 우리의 방법은 H. 아미게라 뿐만 아니라 다른 Lepidopteran 나방에 CRISPR / Cas9 게놈 편집의 적용을위한 참조 역할을 할 것입니다.

이 프로토콜은 CRISPR/Cas9 기술을 사용하여 H. armigera 의 유전자 녹아웃 라인을 얻기 위한 상세한 단계를 제공합니다. 이 프로토콜에 의해 얻은 대표적인 결과는 gDNA 선택, 배아 수집 및 주입, 곤충 사육 및 돌연변이 검출을 위해 요약됩니다.
이 연구에서는, 관심있는 우리의 유전자의 표적 사이트는 두 번째 exon에 위치했다 (그림 2A). 본 사이트는 매우 보존되었고, 합성 된 sgRNA의 표적 대역 단편은 아가로즈 젤 전기 포진 (도 2B, C, D)을 사용하여 확인되었다.
남성과 ...

여기에 제시 헬 리코파 armigera 의 프로토콜입니다 (Hübner) 태아 미세 주입 및 CRISPR / Cas9 게놈 편집에 의해 생성 된 녹아웃 돌연변이 식별. 돌연변이 곤충은 생체 내의 다른 유전자 들 사이에서 유전자 기능 및 상호 작용의 추가 연구를 가능하게 합니다.

CRISPR/Cas9 게놈 편집 헬리코파 아르미게라 의 배아 미세 주입 및 녹아웃 돌연변이 식별 (휘브너)

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional ...

면 볼웜은 전 세계적으로 가장 파괴적인 해충 중 하나입니다. CRISPR/Cas9 기술로 게놈 편집은 이 유기체에 있는 다른 유전자 중 유전자 기능 및 상호 작용의 추가 연구를 가능하게 합니다. 이 기술의 두 가지 주요 장점은 높은 특이성을 가지고 있으며 헤아질 수 있다는 것입니다.sgRNA 표적을 선택하려면 CRISPR 온라인 웹 사이트로 이동하여 가능한 가이드 사이트와 유전자의 5가지 주요 번역되지 않은 영역에 가까운 엑슨을 검색하십시오. 텍스트 상자에 엑슨 서열을 입력하고 헬리코파 아미게라에 대상 게놈을 선택합니다. 웹 사이트의 사용자 매뉴얼에 따라 20 BPNGG에 대한 PAM 옵션을 선택하고 기본 매개 변수에 다른 설정을 둡니다.소프트웨어의 예측 가이드 시퀀스를 비교하고 가장 높은 예측 효율과 가장 적은 불일치와 다섯 가지 주요 미번역 영역 근처에 하나 또는 두 개의 구아닌을 포함하는 20 개의 기본 쌍의 가이드 시퀀스를 선택하여 편집 효율성을 개선하고 오프 타겟 편집을 줄입니다. 배아 준비를 위해 3일 된 남성과 2일 된 암컷중 50명의 건강한 개인을 선택하고 깨끗한 그물 케이지에 섞어 줍니다. 10%의 설탕 용액이 들어 있는 촉촉한 면 한 조각을 케이지에 놓습니다.그물 케이지를 거즈로 덮고 거즈를 고무 밴드로 고정합니다. 거즈에 물을 뿌리면 촉촉하게 유지하십시오. 검은 천을 적절한 크기로 자르고 촉촉한 거즈를 이 검은 천으로 대체하여 30분 동안 무료 바요사 위치를 확보할 수 있습니다.양면 테이프를 현미경 슬라이드에 붙여 넣습니다. 집게를 사용하여 양면 테이프 표면에 계란을 연달아 붙여 넣습니다. 각 패치의 여백을 눌러 테이프에 단단히 고정되도록 합니다.현미경 슬라이드 당 50~100개의 계란을 수집합니다. 미세 주입 하기 전에, 배아의 개발을 지연 하는 얼음에 현미경 슬라이드를 유지. 텍스트 원고에 설명된 마이크로 파이펫 풀러를 사용하여 모세관 유리를 당겨 바늘을 준비합니다.마이크로 그라인더를 사용하여 바늘 끝을 날카로운 팁으로 갈아 넣습니다. 10 마이크로리터 부피 혼합물을 얻기 위해 PCR 튜브에 RNace 없는 물에 상용화된 Cas9 단백질 및 sgRNA 의 2개의 마이크로리터를 추가하여 사출 솔루션을 준비하십시오. 파이펫팅으로 잘 섞어서 얼음 위에 놓습니다.전자 마이크로인젝터의 매개 변수를 설정합니다. 마이크로 로더 파이펫 팁을 사용하여 혼합물의 마이크로 리터 2 개를 바늘에 적재하여 바늘 끝에 많은 잔류 공기를 최대한 소모합니다. 주입 바늘을 마이크로 조작기에 연결하고 두 부분 간의 긴밀한 연결을 보장합니다.페트리 접시에 슬라이드를 놓고 현미경의 무대에 놓습니다. 조심스럽게 45도 각도에서 배아의 상단 반구에 바늘 팁을 삽입합니다. 배아에 혼합물을 전달하기 위해 페달을 누르면 배아의 약간의 팽창이 발생합니다.배아에서 바늘을 즉시 철회하고 다음 배아가 바늘에 근접할 때까지 페트리 접시를 한 손으로 움직입니다. 충분한 부화양을 보장하기 위해 동일한 절차를 사용하여 적어도 300 개의 배아를 주입하십시오. 주입 후 페트리 접시의 뚜껑을 덮습니다.배아의 표면 색이 어두워지면 현미경 슬라이드 주위에 페트리 접시에 인공 식단을 넣습니다. 24웰 의 문화 판을 준비하고 인공 식단으로 볼륨 용량의 1/3에 각각을 채웁니다. 작은 페인트 브러시를 사용하여 부화 유충을 골라 24웰 문화 판으로 옮기면 애벌레 가 하나 도 있습니다.애벌레가 세 번째 인스타 스테이지로 성장하면 새로운 유리 성덕에 게 전달합니다. 새로 동봉 된 G-제로 남성 성인과 야생 형 여성 성인을 동일한 비율로 신선한 그물 케이지로 옮긴다. 면봉에 떨어뜨린 10%의 설탕 용액을 공급합니다.G-one의 새끼까지 일상적인 방법을 사용하여 후면 곤충. 집게를 사용하여 뒷다리를 조심스럽게 제거하고 각 다리를 Lysing Matrix 튜브에 넣습니다. 조직 균질화제를 사용하여 뒷다리를 균질화합니다.제조업체의 지침에 따라 상용 gDNA 추출 키트를 사용하여 균질화된 샘플의 게놈 DNA를 추출합니다. 텍스트 원고로부터 유전자 계부 프라이머및 PCR 반응 조건을 사용하여 유전자 세그먼트를 증폭한다. 유전자 염기서열 분석 서비스로 유전자형을 확인합니다.동일한 유전자형의 G-one 개인을 하나의 그물 케이지에 넣고, 자기가 G-one 자손을 교차하고 동일한 방법을 사용하여 계속 화면을 계속합니다. 관심 유전자의 표적 부위는 두 번째 엑슨에 위치했다. 이 사이트는 매우 보존되었고 합성 된 sgRNA의 표적 밴드 단편은 아가로즈 젤 전기 포이를 사용하여 확인되었다.단일 sgRNA 표적의 돌연변이 검출은 G-one 부모 단위로부터 PCR 제품을 시퀀싱하여 수행되었다. 돌연변이의 큰 삭제가 야생 형 팬과 쉽게 구별되었기 때문에 서로 다른 엑슨에 걸쳐 비 겹치는 sgRNA 쌍을 사용하는 효과가 입증되었습니다. 특정 수의 돌연변이 개인을 얻은 후, 전기 생리학적 또는 행동 실험은 다른 유전자 간의 유전자 기능 및 상호 작용을 명확히 하기 위해 수행될 수 있다.

embryo-microinjection-knockout-mutant-identification-crisprcas9

Research

연구

JoVE Journal

Behavior

행동

이 동영상은 형질전환 예쁜꼬마선충 균주를 만드는 일반적인 방법인 미세주입에 대해 설명합니다. 이 예에서는 CRISPR 염기 유전자 편집을 위한 리보핵단백질(RNP) 복합체를 도입하는 데 사용되는 미세주입을 볼 수 있습니다.

생식선 미세주입: 예쁜꼬마선충의 생식세포에 직접 화합물을 전달하는 방법

Microinjection Nasonia vitripennis 배아의 생성 상속 게놈 수정 하기 위한 필수적인 방법입니다. 여기에 설명 된 microinjection 그리고이 유기 체에서 미래 게놈 조작에 크게 용이 하 게 한다 Nasonia vitripennis 배아의 이식에 대 한 자세한 절차가입니다.

태아 Microinjection 및 Nasonia vitripennis 게놈 조작을 위한 이식 기술

여기 우리가 수집 하 고 microinjecting precellular 서쪽 옥수수에 대 한 프로토콜 rootworm 배아 생식 변환 및 CRISPR/Cas9-게놈 편집과 같은 게놈 기능 분석을 수행 하기 위해 제시.

Microinjection 웨스턴 옥수수 Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, 배아의 생식 변환, 또는 CRISPR/Cas9 게놈 편집과

이 프로토콜은 CRISPR/Cas9 유전자 편집 도구와 함께 작동하도록 최적화된 Culex quinquefasciatus 태아를 위한 미세 주입 절차를 기술합니다. 이 기술은 이 저학질병 벡터에 있는 유전 기술을 구축하는 데 사용될 수 있는 사이트 특정, 유전성, 생식선 돌연변이를 효율적으로 생성할 수 있습니다.

컬렉스 퀸케파시아투스의 효율적인 부위 별 돌연변이 발생을 위한 배아 미세 주입 기술

우리는 사육, 계란의 미세 주입 및 게놈 편집 후 돌연변이 균주를 생성하고 유지하기 위해 파이어 브라트 Thermobia 국산의 효율적인 짝짓기를위한 상세한 프로토콜을 제공합니다.

파이어 브라트 Thermobia 국내에서 게놈 편집을위한 계란 미세 주입 및 효율적인 짝짓기

이 프로토콜은 태아 수집, 주사, 곤충 사육 및 식별뿐만 아니라 관심있는 돌연변이의 선택 : 모래 파리에 CRISPR / Cas9 표적 돌연변이 발생의 단계를 자세히 설명합니다.

샌드 플라이 (플레보토무스 파파타시) CRISPR/Cas9 돌연변이 발생을 위한 배아 미세 주입

곤충 우사회성의 많은 특성은 식민지 내 의사 소통과 노동 분업에 의존합니다. 미세 주입 및 CRISPR 매개 돌연변이 유발을 통한 개미 배아의 주요 조절 유전자의 유전자 조작은 진사회적 곤충의 이타적 행동의 본질에 대한 통찰력을 제공합니다.

개미 하르페냐토스 염기 에서 CRISPR 매개 돌연변이 유발을 위한 배아 주사

여기에서는 CRISPR/Cas9 기반 게놈 편집을 통해 게놈을 수정하거나 생식계열 형질전환을 통해 표시된 전치 요소를 추가할 목적으로 세포 전 옥수수 식물 호퍼 배아를 수집하고 미세 주입하기 위한 프로토콜입니다.

CRISPR/Cas9 게놈 편집을 위한 옥수수 Planthopper, Peregrinus maidis, 배아의 미세주입

이 연구는 동형접합 메뚜기 돌연변이의 CRISPR/Cas9 리보뉴클레아제 기반 구성의 체계적으로 최적화된 절차와 메뚜기 알의 냉동 보존 및 소생을 위한 상세한 방법을 제공합니다.

CRISPR/Cas9 기술을 이용한 철새 메뚜기의 동형접합 돌연변이 구축

이 논문은 동양 초파리 박트로세라 등쪽의 CRISPR/Cas9 돌연변이 유발에 대한 단계별 프로토콜을 제시합니다. 이 표준화 된 프로토콜에 의해 제공되는 상세한 단계는 B. dorsalis에서 기능적 유전자 연구를위한 돌연변이 파리를 생성하는 데 유용한 가이드 역할을합니다.

동양 초파리 박트로세라 등쪽의 CRISPR/Cas9 돌연변이 유발에 대한 프로토콜

이 논문은 곤충병원성(EPN: 곤충기생) 선충이자 신흥 유전 모델인 Steinernema hermaphroditum 에서 CRISPR-Cas9 매개 게놈 공학을 시연합니다. 기술이 설명한 기술은 돌연변이를 생성하는 데 유용하며, 상리공생 및 기생 공생과 관련된 선충 생물학의 유전자 기능을 밝히는 데 도움을 줍니다.

곤충병원성 선충 Steinernema hermaphroditum 의 CRISPR-Cas9 기반 돌연변이 유발과 돌연변이 계통의 유지

배우세요 CRISPR/Cas9을 이용한 Helicoverpa armigera 배아 미세주입 및 녹아웃 돌연변이 식별 방법입니다. 이 기술은 유전자 기능과 상호작용을 연구하는 데 활용됩니다.

CRISPR/Cas9 게놈 편집 헬리코파 아르미게라 의 배아 미세 주입 및 녹아웃 돌연변이 식별 (휘브너)

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