Name: 시험관 내 전사 및 분자 계산을 위한 DNA 테더드 RNA 폴리머라제 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: 학습하세요 DNA 테더드 T7 RNA 폴리머라제를 이용한 시험관 내 전사 조절 방법을. 인공 핵산 전사 인자를 활용한 이 기술은 유전자 회로 설계와 분자 컴퓨팅에 활용됩니다.

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L.Y.T.C 연구 기금 탐사 (NFRF-E), 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC) 디스커버리 그랜트, 캐나다 최초의 연구 우수 기금 (CFREF)의 자금을 받는 디자인 이니셔티브에 의한 토론토 대학의 의학에서 관대 한 지원을 인정합니다.

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<li>Warden-Rothman, R., Caturegli, I., Popik, V., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sortase-tag+expressed+protein+ligation%3A+combining+protein+purification+and+site-specific+bioconjugation+into+a+single+step%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Sortase-tag expressed protein ligation: combining protein purification and site-specific bioconjugation into a single step.</a> Analytical Chemistry. 85 (22), 11090-11097 (2013).</li>
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저자중 누구도 선언할 경쟁적인 재정적 이해관계는 없습니다.

이 연구는 N-말단 태그 재조합 T7 RNAP를 BG 기능화 올리고뉴클레오티드와 공동으로 결합하여 T7 RNA 폴리머라제의 활성을 제어하는 DNA 나노 기술에서 영감을 얻은 접근법을 시연하며, 이는 이후 TMDSD 반응을 프로그래밍하는 데 사용되었습니다. 설계에 의하면, SNAP 태그는 폴리머라제의 N-종착체에 위치하였으며, 야생형 T7 RNAP의 C-종점은 단백질 구조 코어 내에 묻혀 DNA템플릿(28)과중요한 접촉을 한다. 폴리머라제 C-종체를 수정하려는 사전 시도는 다른 보상 돌연변이가 도입되지 않는 한 효소 활성의 완전한 손실을 초래했다. 29,30 대조적으로, T7 RNAP의 N 단말 융합은 잘 용납되지만, 융합 태그의 선택은 중합체 활성에 영향을 미칠 수 있다. 다른 태그가 RNAP 활동에 미치는 영향은 체계적으로 결정되지 않았습니다. SNAP 태그는 효율적이고 견고하기 ...

DNA 컴퓨팅은 계산을 위한 매체로 디자인된 올리고뉴클레오티드 세트를 사용합니다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 사용자 지정 논리에 따라 동적으로 조립하고 특정 핵산 입력에 반응하기 위해 서열로 프로그래밍됩니다. 개념 증명 연구에서, 계산의 출력은 전형적으로 겔 전기전도 또는 형광 판 판독기를 통해 검출될 수 있는 형광표형 올리고뉴클레오티드 세트로 구성됩니다. 지난 30년 동안 다양한 디지털 로직 캐스케이드, 화학 반응 네트워크 및 신경망1,2,3과같이 점점 더 복잡해지는 DNA 전산 회로가 입증되었습니다. 이러한 DNA 회로의 제조를 지원하기 위해, 수학적 모델은 합성 유전자 회로4,5의기능을 예측하는 데 사용되었으며, 직교 DNA 서열 설계6,7,8,9,10을 위해 전산 도구가 개발되었습니다. . 실리콘 기반 컴퓨터에 비해 DNA 컴퓨터의 장점은 생체 분자와 직접 인터페이스하고 전원 공급 장치가없는 상태에서 솔루션에서 작동하는 능력뿐만 아니라 전반적인 컴팩트함과 안정성을 포함합니다. 차세대 시퀀싱이 등장하면서 지난 2년간 DNA 컴퓨터 합성 비용은 무어의 법칙11보다빠른 속도로 감소하고 있습니다. 이러한 DNA 기반 컴퓨터의 응용프로그램은 이제 질병진단(12,13),분자 생물물리학(14)에 전력을 공급하고, 데이터 저장플랫폼(15)과같은 출현하기 시작했다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig01.jpg"> 그림 1: 발가락 매개 DNA 가닥 변위의 메커니즘. δ 발가락은 부분 이중에 무료, 언바운드 시퀀스입니다. 두 번째 가닥에 보완 도메인(δ*)이 도입되면 자유 δ 도메인은 혼성화를 위한 발판 역할을 하므로 나머지 가닥(ɑ*)이 가닥 마이그레이션이라고 하는 지퍼/압축 해제 가역 반응을 통해 경쟁업체를 천천히 대체할 수 있습니다. δ 길이가 증가함에 따라 전방 반응용 ΔG가 감소하고 변위가 더 쉽게 발생합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62073/62073fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
현재까지 DNA 컴퓨터의 대다수는 발가락 매개 DNA 가닥 변위(TMDSD, 도 1)16으로알려진 동적 DNA 나노 기술 분야에서 잘 확립된 모티프를 활용한다. 이 모티프는 짧은 "발가락"오버행 (즉, 7- 10 뉴클레오티드 (nt)를 표시하는 부분적으로 이중 좌초 DNA (dsDNA) 이중으로 구성된다. 핵산 "입력" 가닥은 발가락을 통해 부분 이중과 상호 작용할 수 있다. 이것은 부분 이중에서 가닥 중 하나의 변위로 이어지며, 이 해방된 가닥은 다운스트림 부분 이중에 대한 입력역할을 할 수 있습니다. 따라서 TMDSD는 신호 계단식 및 정보 처리를 가능하게 합니다. 원칙적으로 직교 TMDSD 모티프는 솔루션에서 독립적으로 작동하여 병렬 정보 처리를 가능하게 합니다. TMDSD 반응에 대한 다양한 변형이 있었다, 발가락 매개 DNA 가닥 교환 (TMDSE)(17),이중 긴 영역을 가진 "누출없는"발가락 홀드(18),서열 불일치 발가락19,및 "손잡이"매개 가닥 변위(20)등이 있었다. 이러한 혁신적인 설계 원칙을 통해 DNA 컴퓨팅 성능을 개선하기 위해 TMDSD의 에너지와 역학을 보다 세밀하게 조정할 수 있습니다.
전사 유전자 회로와 같은 합성 유전자 회로도 계산21,22,23을계산할 수 있다. 이 회로는 특정 조절 DNA 요소에 결합하여 유전자의 전사를 활성화하거나 억압하는 단백질 전사 인자에 의해 조절됩니다. DNA 기반 회로에 비해 전사 회로는 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, 효소 전사는 기존 촉매 DNA 회로보다 훨씬 높은 회전율을 가지므로 입력의 단일 사본당 더 많은 출력 사본을 생성하고 보다 효율적인 신호 증폭 수단을 제공합니다. 또한, 전사 회로는 치료 단백질에 대한 aptamers 또는 메신저 RNA(mRNA) 인코딩과 같은 상이한 기능성 분자를 생성할 수 있으며, 이는 다른 용도에 대해 악용될 수 있는 계산 출력으로. 그러나, 현재 전사 회로의 주요 한계는 확장성의 그들의 부족입니다. 이는 직교 단백질 기반 전사 인자의 매우 제한된 세트가 있기 때문에 새로운 단백질 전사 인자의 de novo 디자인은 기술적으로 도전적이고 시간이 많이 소요됩니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig02.jpg"> 도 2: "밧줄"과 "케이지"폴리머라제 복합체의 추상화 및 메커니즘. (A 및 B)올리고뉴클레오티드 테더는 SNAP 태그 반응을 통해 T7 폴리머라아제로 효소로 표시된다. 테더-프로모터가 있는 "가짜" T7 프로모터로 구성된 케이지를 사용하면 테더에 혼성화하고 전사 활동을 차단할 수 있습니다. (C)작업자(a*b*)가존재할 때, 올리고뉴클레오티드테더(ab)에발가락에 결합하고 케이지의 b* 영역을 변위시켜 전사가 발생할 수 있도록 한다. 이 수치는 추와 시27에서수정되었습니다. 약어 : RNAP = RNA 폴리머 라제. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62073/62073fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
이 논문은 전사 회로의 기능과 DNA 기반 회로의 확장성을 결합한 분자 컴퓨팅을 위한 새로운 빌딩 블록을 소개합니다. 이 빌딩 블록은 단일 좌초 DNA 테더(도2A)와함께 공동으로 부착된 T7 RNAP이다. 이 DNA 테더드 T7 RNAP를 합성하기 위해 폴리머라제는 N 단자 SNAP태그(24)에 융합되고 에슈리치아 대장균에서재조합되었다. SNAP 태그는 BG 기판으로 기능화된 올리고뉴클레오티드로 반응했다. 올리고뉴클레오티드 테더는 DNA 혼성화를 통해 폴리머라제에 근접하여 분자 손님의 위치를 지정할 수 있게 한다. 이러한 손님 중 하나는 "케이지"라고 불리는 경쟁 전사 차단제였으며, 이는 유전자 다운스트림이없는 "가짜"T7 프로모터 DNA 듀플렉스(그림 2B)로구성됩니다. 올리고뉴클레오티드 밧줄을 통해 RNAP에 구속될 때, 케이지는 RNAP 결합을 위한 다른 DNA 템플릿을 능가하여 중합체 활성을 노점으로 하여 RNAP상태를 "OFF"상태(도 2C)로렌더링한다.
"ON" 상태로 중합효소를 활성화하기 위해, 유전자의 T7 프로모터의 상류에 단일 좌초 "연산자" 도메인을 가진 T7 DNA 템플릿이 설계되었다. 연산자 도메인(즉, 도메인 a*b* 도 2C)은TMDSD를 통해 RNAP에서 케이지를 대체하고 RNAP 근위를 유전자의 T7 프로모터에 배치하여 전사를 시동하도록 설계될 수 있다. 대안적으로, DNA 템플릿은 또한 운영자 서열이 "인공 전사 인자"(즉, 도 3A에서TFA 및 TFB 가닥)로 지칭되는 보조 핵산 가닥에 보완된 곳에서 설계되었다. 두 가닥이 반응에 도입되면 운영자 사이트에서 어셈블하여 새로운 의사 연속 도메인 a*b*를만듭니다. 그런 다음 이 도메인은 TMDSD를 통해 케이지를 변위하여전사(그림 3B)를시작할 수 있습니다. 이러한 가닥은 외인성 또는 생산될 수 있다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig03.jpg"> 그림 3: 3성분 스위치 활성제를 통한 폴리머라제 활성의 선택적 프로그래밍. (A)전사 인자(TFA 및 TFB)가존재할 때, 그들은 프로모터의 연산도메인 상류에 결합하여, 포홀드 중재된 DNA 변위를 통해 케이지를 변위시킬 수 있는 의사 단일 가닥 시퀀스(a*b*)를 형성한다. (B)이 a*b* 도메인은 TMDSD를 통해 케이지를 변위하여 전사를 시작할 수 있습니다. 이 수치는 추와 시27에서수정되었습니다. 약어: TF = 전사 인자; RNAP = RNA 중합체; TMDSD = 발가락 매개 DNA 가닥 변위. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62073/62073fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
체외 전사 조절을 위한 핵산 계전사 인자의 사용은 디지털 논리, 피드백 및 신호 계단식과 같은 정교한 회로 동작의 확장 가능한 구현을 가능하게 합니다. 예를 들어, 상류 유전자의 전사체가 다운스트림 유전자를 활성화하는 핵산 서열을 설계함으로써 논리 게이트 캐스케이드를 구축할 수 있다. 이 제안된 기술로 이루어진 계단식 및 멀티플렉스를 활용하는 한 가지 응용 분야는 휴대용 진단 및 분자 데이터 처리를 위한 보다 정교한 분자 컴퓨팅 회로를 개발하는 것입니다. 또한, 분자 컴퓨팅 및 드 노보 RNA 합성 기능을 통합하면 새로운 응용 프로그램이 가능해질 수 있다. 예를 들어, 분자 회로는 사용자 정의 RNA 중 하나 또는 조합을 입력 및 출력 치료 RNA 또는 mRNA로 검출하도록 설계되어 기능성 펩티드 또는 단백질을 치료 시점 의료 응용 분야에 대한 암호화할 수 있다.

<table><tbody><tr><td>0.5% 폴리소르베이트 20(TWEEN 20)</td><td>BioShop</td><td>TWN510.5</td><td></td></tr><tr><td>0.5M 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)</td><td>바이오 베이직</td><td>SD8135</td><td></td></tr><tr><td>10mM 인산나트륨 완충액(pH 7)</td><td>10mM 완충액을 만드는 데 사용되는</td> <td>바이오 베이직</td><td>PD0435</td> 정제</tr><tr><td>10% 과황산암모늄(APS)</td><td>시그마 알드리치</td><td>A3678-100G</td><td></td></tr><tr><td>100kDa 아미콘 울트라-15 원심 분리기 필터 유닛</td><td>Fisher Scientific</td><td>UFC910008</td><td></td></tr><tr><td>100% 아세톤</td><td>Fisher Chemical</td><td>A18P4</td><td></td></tr><tr><td>100% 에탄올 (EtOH)</td><td>하우스 브랜드</td><td>39752-P016-EAAN</td><td></td></tr><tr><td>10x 체외 전사(IVT) 완충액</td><td>New England Biolabs</td><td>B9012</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris-Borate-EDTA (TBE) 완충액</td><td>Bio Basic</td><td>A0026</td><td></td></tr><tr><td>1M 이소프로필 &베타;- d-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)</td><td>시그마 알드리치</td><td>I5502-1G</td><td></td></tr><tr><td>1M 중탄산나트륨 완충액</td><td>시그마 알드리치</td><td>S6014-500G</td><td></td></tr><tr><td>1M 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(트리스)</td><td>시그마 알드리치</td><td>648311-1KG</td><td></td></tr><tr><td>1X 트리스-EDTA(TE) 버퍼</td><td>ThermoFisher</td><td>12090015</td><td></td></tr><tr><td>2M 이미다졸</td><td>시그마 알드리치</td><td>56750-100G</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올(BME)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>3M 아세트산나트륨</td><td>바이오 베이직</td><td>SRB1611</td><td></td></tr><tr><td>40% 아크릴아미드(19:1)</td><td>바이오 베이직</td><td>A00062</td><td></td></tr><tr><td>4x LDS 단백질 샘플 로딩 버퍼</td><td>Fisher Scientific</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>5M 염화나트륨(NaCl)</td><td>바이오 베이직</td><td>DB0483</td><td></td></tr><tr><td>5mM 디티오트레이톨(DTT)</td><td>시그마 알드리치</td><td>43815-1G</td><td></td></tr><tr><td>6x 겔 로딩 염료</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>아가로스 B 분말</td><td>바이오 베이직</td><td>AB0014</td><td></td></tr><tr><td>BG-GLA-NHS</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td>S9151S</td><td></td></tr><tr><td>BL21 유능한 대장균</td><td>애드진</td><td>C2530H</td><td></td></tr><tr><td>BLUeye prestained protein ladder</td><td>FroggaBio</td><td>PM007-0500</td><td></td></tr><tr><td>브로모페놀 블루</td><td>바이오 베이직</td><td>BDB0001</td><td></td></tr><tr><td>쿠마시 블루(SimplyBlue SafeStain)</td><td>ThermoFisher</td><td>LC6060</td><td></td></tr><tr><td>시아닌 염료(SYBR 골드 핵산 겔 염색)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>시아닌 염료(SYBR 안전 핵산 겔 염색)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>건조 디메틸 설폭사이드 (디엠소)</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>포름아미드</td><td>시그마 알드리치</td><td>F9037-100ML</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>바이오 베이직</td><td>GB0232</td><td></td></tr><tr><td>카나마이신 설페이트</td><td>BioShop</td><td>KAN201.5</td><td></td></tr><tr><td>용해 육수</td><td>시그마 알드리치</td><td>L2542-500ML</td><td></td></tr><tr><td>공작석 그린 옥살레이트</td><td>시그마 알드리치</td><td>2437-29-8</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N'-테트라메틸에탄-1,2-디아민(TEMED)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281-25ML</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS 러닝 버퍼(20x)</td><td>Fisher Scientific</td><td>LSNP0002</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris gel 1.0 mm 12-well</td><td>Life Technologies</td><td>NP0322BOX</td><td></td></tr><tr><td>올리고뉴클레오티드(케이지 안티센스)</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>TATAGTGAGTCGTATTAATTTG</td></tr><tr><td>올리고뉴클레오티드( 케이지 센스)</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>TCAGTCACCTATCTGTTTCAAA TTAATACGACTCACTATA</td></tr><tr><td>올리고뉴클레오티드 (공작석 그린 압타머 안티센스)</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>GGATCCATTCGTTACCTGGCT CTCGCCAGTCGGGATCCTATA GTGAGTCGTATTACAGTTCCAT TATCGCCGTAGTTGGTGTACT</td></tr><tr><td>올리고뉴클레오티드(말라카이트 그린 압타머 센스)</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>TAATACGACTCACTATAGGATC CCGACTGGCGAGAGCCAGGT AACGAATGGATCC</td></tr><tr><td>올리고뉴클레오티드(전사 인자 A)</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>AGTACACCAACTACGAGTGAG</td></tr><tr><td>올리고뉴클레오티드(전사 인자 B)</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>TCAGTCACCTATCTGGCGATAA TGGAACTG</td></tr><tr><td>올리고뉴클레오티드 3' 아민 변형(테더)</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>GCTACTCACTCAGATAGGTGAC TGA/3AmMO/</td></tr><tr><td>Pierce strong ion exchange spin columns</td><td>Fisher Scientific</td><td>90008</td><td></td></tr><tr><td>플라스미드 인코딩 SNAP T7 RNAP 및 kanamycin resistance genes</td><td>Genscript</td><td>N/A</td><td>custom gene insert</td></tr><tr><td>protein purification column (HisPur Ni-NTA spin column)</td><td>Fisher Scientific</td><td>88226</td><td></td></tr><tr><td>rNTP 믹스</td><td>New England Biolabs</td><td>N0466S</td><td></td></tr><tr><td>Roche 미니 퀵 DNA 스핀 컬럼</td><td>시그마 알드리치</td><td>11814419001</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마 알드리치</td><td>T8787-100ML</td><td></td></tr><tr><td>초저 범위 DNA 사다리</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>10597012</td><td></td></tr><tr><td>요소</td><td>BioShop</td><td>URE001.1</td><td></td></tr></tbody></table>

시험관 내 전사 및 분자 계산을 위한 dna 테더드 rna 폴리머라제

DNA-Tethered RNA Polymerase for Programmable In vitro Transcription and Molecular Computation

DNA 나노 기술은 다양한 응용 프로그램에 대한 사용자 처방 모양과 역학으로 핵산의 프로그래밍 가능한 자체 조립을 가능하게합니다. 이 연구는 DNA 나노 기술의 개념이 파지 유래 T7 RNA 폴리머라제(RNAP)의 효소 활성을 프로그래밍하고 확장 가능한 합성 유전자 조절 네트워크를 구축하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다. 첫째, 올리고뉴클레오티드 테더드 T7 RNAP는 N단말 스냅 태그 RNAP의 발현과 SNAP 태그의 후속 화학 결합을 벤질구아닌(BG)-변형 올리고뉴클레오티드와 결합하여 설계된다. 다음으로, 핵산 가닥 변위는 주문형 폴리머라제 전사를 프로그래밍하는 데 사용된다. 또한, 보조 핵산 어셈블리는 DNA 템플릿을 사용하여 DNA 프로그래밍된 T7 RNAP 간의 상호 작용을 조절하기 위해 "인공 전사 인자"로 사용될 수 있다. 이 시험관 내 전사 규제 메커니즘은 디지털 논리, 피드백, 계단식 및 멀티플렉스와 같은 다양한 회로 동작을 구현할 수 있습니다. 이 유전자 규제 아키텍처의 컴포지토리는 설계 추상화, 표준화 및 확장을 용이하게 합니다. 이러한 기능은 생체 감지, 질병 검출 및 데이터 저장과 같은 응용 분야에 대한 시험관 내 유전 장치의 신속한 프로토타이핑을 가능하게 합니다.

<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig05.jpg"> 그림 5: SNAP T7 RNAP 발현 및 체외 전사 분석의 SDS-PAGE 분석. (A)SNAP T7 RNAP 단백질 정제 분석, SNAP T7 RNAP 분자량: 119.4kDa. FT = 컬럼에서 의 흐름을 통해, W1 = 용출 분획불을 포함하는 세척 버퍼, 정제 된 제품을 포함하는 E1-3 = 용출 분획, 및 DE = 10 배 희석 총 탈염 용출. 4-12% 프리캐스트 비스-트리스 단백질 젤, 스테인: 쿠마시 블루, 러닝 버퍼: MES 버퍼, 조건: 200 V 35 분 동안 .(B)시험관 내 전사 분석은 시간이 지남에 따라 형광 압태의 생산을 측정하여 SNAP T7 RNAP...

우리는 시험관 내 전사 반응을 조절하기 위해 새로운 DNA 테더T7 RNA 폴리머라제의 엔지니어링을 설명합니다. 우리는 단백질 합성 및 특성화를 위한 단계를 논의하고, 개념 증명 전사 적 조절을 검증하며, 분자 컴퓨팅, 진단 및 분자 정보 처리에 대한 응용 분야에 대해 논의합니다.

시험관 내 전사 및 분자 계산을 위한 DNA 테더드 RNA 폴리머라제

DNA nanotechnology enables programmable self-assembly of nucleic acids into user-prescribed shapes and dynamics for diverse applications. This work ...

인공 핵산 전사인자를 이용한 중합효소 활성조절방안을 제안한다. 이 유전자 규제 아키텍처는 체외 유전 적 장치를 위한 미래 를 위한 빌딩 블록역할을 할 수 있습니다. DNA 결합 도메인을 T7 RNA 폴리머라아제에 스테더링하여, 이 기술은 DNA 기반 회로의 확장성과 전사 회로의 기능을 결합합니다.테이블에 표시된 바와 같이, 5에서 1 대 5 비율로, 이중 증류수의 50 마이크로 리터의 최종 부피에 단일 좌초 BG 올리고 뉴클레오티드의 9 희석을 함으로써 시작합니다. BG 올리고뉴클레오티드 의 4개의 마이크로리터와 SNAP 버퍼의 2개의 마이크로리터, 그리고 SNAP T7 RNAP의 4개의 마이크로리터를 혼합해서 각 희석에 대하여 1개의 반응 혼합물을 준비합니다. 올리고뉴클레오티드를 이중 증류수로 대체하여 RNAP 제어를 준비하고, SNAP T7 RNAP를 이중 증류수로 대체하여 DNA 제어를 준비합니다.각 샘플의 마이크로리터 2개와 SNAP 버퍼 4개 소리터, 샘플당 단백질 로딩 염료 2개에 첨가하여 11개의 반응을 설정합니다. 70도에서 10분 동안 반응을 가열한 후 각 샘플의 마이크로리터 2개를 4~12%의 유리체 단백질 젤에 적재하여 200볼트의 얼음에 젤 전기포아를 35분간 적재합니다. 실행이 끝나면 세척당 적어도 10 분 동안 셰이커에 3 개의 물 교환으로 젤을 씻고 핵산이 15 분 동안 시아닌 염료로 염색합니다.적절한 젤 이미징 시스템에서 젤을 이미지화하고 쿠마시 블루의 20 밀리리터로 젤을 다시 얼룩지게 합니다. 1 시간 후, 다시 젤을 이미징하기 전에 적어도 한 시간 동안 이중 증류수로 얼룩을 해제합니다. 올리고뉴클레오티드 테더드 SNAP T7 정제의 경우, 먼저, 1개의 어형량 50마이크로리터를 5개의 어금니 나트륨 염화나트륨 100마이크로리터와 850마이크로리터의 이중 증류수와 혼합하여 용출 완충제를 준비한다.다음으로, 샘플당 1개의 이온 교환 컬럼을 개별 2밀리리터 원심분리기 튜브에 넣고, 각 열에서 모든 버퍼가 출동될 때까지 원심분리로 매립 버퍼로 컬럼을 세척한다. 각 샘플을 3 내지 1정정제 버퍼에서 샘플 비율로 희석하고 400마이크로리터의 샘플을 각 컬럼에 로드합니다. 모든 버퍼가 설명된 대로 용출된 경우 각 샘플에 대해 흐름을 수집하고 레이블을 지정합니다.모든 버퍼가 세척당 용출될 때까지 세척당 400 마이크로리터의 정제 버퍼로 컬럼을 세 번 세척하여 흐름 스루를 적절히 수집하고 라벨링합니다. 마지막 세척 후, 열의 중앙에 용출 완충제 50 마이크로리터를 추가하고, 버퍼의 모든 50 마이크로 리터가 용출 될 때까지 컬럼을 세 번 원심분리하여 용출 단백질을 수집합니다. 각 원심 분리 후 엘루스를 수집하고 라벨을 지정하여 마지막 원심 분리 후 단일 튜브로 엘루스를 풀링하고 젤 분석을 위해 각 엘ute의 소량을 남깁니다.260 및 280 나노미터에서 나머지 엘루트 알리쿼트의 흡수도를 측정하고, 사용 전까지 영하 20도 저장을 위해 1대 1 비율로 시료에 글리세롤을 추가합니다. 500 마이크로리터 30킬로달톤 경질 필터 유닛을 사용하여 총 elute 제품을 2배 스토리지 버퍼로 교환합니다. 그리고 입증된 바와 같이 흡광도를 측정합니다.그런 다음 영하 20도 저장을 위해 일대일 비율로 제품에 글리세롤을 추가합니다. SDS-PAGE에 의해 엘ute를 평가하기 위해, 200 볼트에서 35 분 동안 또는 염료 전면이 젤의 끝으로 이동 할 때까지 4 ~ 12 %유리체 젤에 적절한 단백질 사다리에서 샘플을 실행합니다. 테더드 RNAP의 온디맨드 제어 활성을 입증하려면 각 템플릿의 2.4 마이크로리터를 5배 의 소리터 5개, 이중 증류수 14.2마이크로리터와 혼합합니다.결과 1개의 마이크로몰러 이중 좌초 DNA CAGE를 섭씨 75도에서 2분 동안 배양합니다. 그리고 표에 표시된 것과 동일한 방식으로 프로모터 및 말라카이트 녹색 aptamer DNA 템플릿의 감각과 반감각 균주를 음침한다. 인큐베이션의 끝에서, 500 나노 몰러 RNAP의 최종 농도에 1 ~ 5 어금니 비율로 이중 좌초 된 DNA 케이지에 테더드 된 SNAP T7 RNAP를 추가합니다.실온에서 15분 후, 얼음에 샘플을 놓고, 25 밀리머 리보뉴클레오사이드 삼중산염의 1개의 마이크로리터, 1밀리머 말라카이트 녹색의 1개의 마이크로리터, RNAP CAGE 혼합물의 2.5 마이크로리터, 2.5 마이크로리터, 1개의 마이크로모클레오 크로니티어, 2.5 마이크로리터 각각 1개의 마이크로모클레오 크로니톤 및 1개의 마이크로모클레오 크로니티드 비디온 인자 A 이중 증류수 10마이크로리터에 1밀리몰러 말라카이트 녹색 압타머 템플릿3개. 이중 증류수 15마이크로리터에서 체외 전사 완충제 10x의 2.5 마이크로리터, 25밀리머 리보뉴클레오사이드 삼중산염 믹스 1편, 밀리머 말라키테 그린 1개, 마이크로리터 1개, RNAP CAGE 혼합물 2.5 마이크로리터, 3개의 마이크로리터를 포함하는 두 번째 반응을 설정합니다. 완충액만 함유한 반응을 설정하려면 시험관내 전사 완충제에 10x의 마이크로리터 2.5마이크로리터, 25밀리머 리보뉴클레오사이드 삼중산염 믹스 1개, 밀리머 말라카이트 그린 1개 마이크로리터, 17.5 마이크로리터 1밀리미터 의 마이크로리터를 혼합하여 17.5 마이크로리터의 이중 화분으로 사용할 수 있습니다.모든 반응이 준비되면 각 반응을 384웰 플레이트로 옮기고, 610나노미터 발암시 37도에서 2시간 동안 형광판 판독기에 말라카이트 녹색 이타수 전사를 모니터링하고 655나노미터 방출을 한다. 판독의 끝에서, 얼음에 접시를 놓고, 20 분 동안 280 볼트에서 70 섭씨 TBE 버퍼에 12 %TBE 우레아 폴리 아크릴 젤에 각 우물에서 RNA 제품을 실행, 또는 염료 전면이 젤의 끝에 도달 할 때까지. 그런 다음, 시안염 핵산 얼룩으로 젤을 궤도 셰이커에 10분 동안 얼룩지게 한 후, 이미징을 시연한 바와 같이.재조합 SNAP T7 RNAP 단백질의 성공적인 발현 및 정제는 SDS-PAGE를 사용하여 확인할 수 있다. SDS-PAGE에 이어, 효소 활성은 체외 전사 반응에 의해 검증될 수 있다. BG 기능성 올리고뉴클레오티드의 성공적인 결합은 18%의 TBE-urea PAGE를 통해 검증될 수 있다.수정되지 않은 올리고뉴클레오티드에 비해, 올리고뉴클레오티드에 BG 모에티를 첨가하면 분자량이 증가한다. 본 대표적인 시아닌 염료 얼룩 젤에서 관찰된 바와 같이 과잉 BG 올리고뉴클레오티드로부터 DNA 테더드 T7 RNAP 정제를 확인하듯이, 분획을 통한 초기 흐름은 대부분 과잉 BG 올리고뉴클레오티드뿐만 아니라 양이온 교환 수지에 결합하지 않은 DNA 테더폴리라제의 작은 부분을 함유했다. 풀 희석 분획은 올리고뉴클레오티드 밧줄에 결합된 시아닌 염료에 의해 야기된 RNAP 올리고의 단일 밴드만 포함되었으며, 업 농축 된 제품 레인은 동일한 것을 나타내지만 어두운 밴드는 성공적인 업 농도를 나타냅니다.동일한 패턴은 쿠마시 블루 스테인링에 의해 관찰되며, 작은 겔 이동성 변화는 비 컨쥬게이드 RNAP 제어에서 관찰된다. 여기서, 실시간 운동학에서 시험관 내 전사의 끝에서 생성된 형광 신호가 도시된다. 본 분석에서, 형광 신호에서 336배의 활성화가 관찰되었고, 중합활성의 견고한 제어를 입증하였다.이 프로토콜을 시도할 때 핵산 염색 전에 젤에서 SDS를 철저히 씻어야 합니다. 이는 STS가 젤의 염료를 포획하여 높은 배경 신호를 생성하기 때문입니다. 여러 캐스케이드가 있는 대형 유전자 회로에 당사의 방법을 적용하면 테더드 전사 시스템의 확장성과 합성성을 보여줄 수 있습니다.이 기술은 현재 신경망 스타일 계산이 가능한 유전자 회로를 개발하는 데 사용되고 있습니다.

dna-tethered-rna-polymerase-for-programmable-vitro-transcription

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

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