Name: 신속하고 정량적인 병아리 Chorioallantoic 멤브레인 모델을 사용하여 전이성 레귤레이터의 발견 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: 발견하세요 병아리 Chorioallantoic 멤브레인 모델을 활용한 암 전이 억제 유전자 스크리닝 방법입니다. 고급 동물 실험 시설 없이도 신속하게 암 침윤을 차단하는 유전자 또는 유전자 조합을 식별할 수 있습니다.

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이 작품은 캐나다 암 학회 연구소 그랜트 #702849 JDL및 KS에 의해 지원되었다. 루이스 박사는 알버타 암 재단이 지원하는 전립선암 연구에서 프랭크와 칼라 소존키 의자를 보유하고 있습니다.

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여기서 우리는 유전 또는 약물 후보 스크린과 같은 중요한 응용프로그램에 이용될 수 있는 급속한 형광 현미경 검사법을 기반으로 한 인내 검열 프로토콜을 기술합니다. 관심있는 유전 라이브러리로 변환되거나 개별 발현 구조와 연관된 암세포는 이 병아리 CAM 모델을 사용하여 관심 표현형에 대해 빠르게 선별및 정량화될 수 있다. 변환 또는 트랜스페션 프로토콜은 라이브러리 유형에 따라 크게 다르므로 이 절차에 포함되지 않습니다. Pheno전형 관련 전이성 콜로니는 CAM으로부터 절제되고, 확장되고, DNA가 높은 처리량 시퀀싱을 위해 분리되어 관심 있는 발현 구조를 식별한다. 일반적으로, 각 유전 라이브러리에는 프라이머 서열과 유전체 DNA 정제의 권장 방법이 장착되어 있습니다. 최상의 높은 처리량 시퀀싱 결과를 위해 로컬 시설 지침을 사용하는 것이 좋습니다.
스크리닝 전에 라이브러리 및 세포주에 대한 최적의 감염 복합성(M.O.I.)을 결정하는 것이 좋습니다. 이상적으로 각 세포 (따라서...

전이는 암 환자사망1,2,3의주요 원인입니다. 전이성 암세포는 전이성 캐스케이드의 다섯 단계에 걸쳐 암의 유형에 따라 뚜렷한 신호 경로를 활용합니다: 지역 침략, 인트라바션, 순환의 생존, 사치, 먼 전이성 부위의 식민지 확장. 이러한 전이성 과정의 현재 이해는 2개의 병목 현상 단계가 있다는 것을 건의하고, 하나는 1차 종양으로부터 암세포의 방향 침입이며, 두 번째는 먼 부위 전이성 병변4,5,6의확립이다. 두 단계 모두 암세포가 초기 침입 또는 먼 전이성 병변 형성 부위에서 콜라겐 및 혈관과 적극적으로 상호 작용하도록 요구합니다. 따라서 전이성 암세포는 세포에 부착하고, 콜라겐 섬유를 리모델링하고, 혈관 벽을 따라 방향적으로 침입할 수 있어야 한다7. 암세포가 이러한 단계를 완료하지 못하도록 차단하기 위해 항전정 치료 표적을 신속하게 식별할 수 있는 선별 모델은 가장 중요합니다. 기존 시험관 내 선별 모델은 복잡한 라이브 조직 환경을 완전히 모방하지 않습니다. 마우스 모델은 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸립니다. 따라서 복잡한 라이브 조직 환경과 표적의 신속한 식별을 제공하는 인트라베이트 스크리닝 플랫폼에 대한 긴급한 필요성이 있습니다.
지난 10년 이내에 닭배아는 인간암전이8,9,10,11,12의견고하고 비용 효율적인 모델로 확립되었다. 병아리 chorioallantoic 막 (CAM) 조직은 1 차종양 및 / 또는 전이성 부위에서 세포 및 식민지 행동의 중요한 현미경 이미징에 이상적이게 얇고 반투명이다12. 다중 인간 암 세포주로부터의 1 차적인 종양 성장은 CAM 조직으로 마이크로 주입 후에 불과 며칠의 범위 내에서 개시되고 전이될 수 있습니다. 암세포는 여러 가지 방법으로 CAM 조직으로 투여 될 수있다, 정맥을 포함, 내 -CAM 또는 콜라겐 종양으로, 이러한 유연성은 연구원이 암 진행의 특정 단계에 초점을 맞출 수 있습니다, 예를 들어, 전이성 병변 형성, 1 차 종양 또는 혈관 신생에서 침입.
여기서 우리는 침략적인 전이성 병변을 설치하는 암세포의 능력을 측정하는 데 사용될 수 있는 정량적 선별 플랫폼을 기술합니다. 발현 라이브러리로 유도된 암세포는 저밀도에서 CAM 혈관에 정맥내 주입된다. 전이성 식민지는 4-5일 동안 형성되며, 그 후 생성된 식민지의 침략 능력과 혈관 상호작용이 평가된다. 침입에 실패하는 개별 식민지는 절제되고, 전파되고 그들의 표현형은 식민지 소형및 암 세포 혈관 접촉의 재주입 및 정량화에 의해 CAM에서 확인됩니다. 단일 전이성 식민지 돌연변이 표현형을 담당하는 발현 라이브러리 구조는 높은 처리량 시퀀싱을 통해 격리된 식민지 게놈 DNA로부터 식별된다. 동일한 플랫폼은 유전자와 관찰된 표현형 사이의 인과 관계를 검증하거나 관찰된 표현형에 대한 심층적인 기계론적 연구를 수행하기 위해 더 사용될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>1mL 일회용 주사기</td><td>BD</td><td>BD309659</td><td></td></tr><tr><td>15mL 원추형 원심분리 튜브.</td><td>Corning</td><td>CLS430791-500EA</td><td></td></tr><tr><td>18 게이지 x 1 1/2&nbsp; BD 정밀 바늘</td><td>BD</td><td>BD305196</td><td>1.2mm x 40mm를 사용하며, 선호하는 경우 더 짧은 바늘을 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>2.5 % 트립신 용액</td><td>많은 소스를 사용할 수</td><td></td><td></td>있습니다</tr><tr><td>4T1 마우스 유방암</td><td>ATCC</td><td>CRL-2539</td><td></td></tr><tr><td>B16F10 마우스 흑색종 세포주</td><td>ATCC</td><td>CRL-6475</td><td></td></tr><tr><td>벤치 탑 원심 분리기.</td><td>많은 소스를 사용할 수</td><td></td> 있습니다 <td>셀을 스핀 다운하는 데 사용할 수 있는 모든 TC 호환 원심분리기가 적합합니다</td></tr><tr><td>원형 커버슬립, 22mm.</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-101</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐분해</td>효소 <td>시그마</td><td>C0130-100MG</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td></td><td></td><td>우리는 Nikon A1r</td></tr><tr><td>면봉</td>을 사용합니다 <td>많은 소스를 사용할 수</td><td></td><td>있습니다 사용 전에 멸균해야 합니다</td></tr><tr><td>사용된 세포주에 적합한 배양 배지</td><td>를 사용할 수 있습니다 많은 소스를 사용할 수</td><td></td> 있습니다 <td>DMEM에서 HT1080, HEp3 및 b16 세포주를 성장시킵니다. 10% FBS 매체</td></tr><tr><td>난자 인큐베이터</td><td>다양한 소스를 사용할 수</td><td></td> 있습니다 <td>필요한 정확한 모델은 화면의 규모에 따라 다릅니다. 사용 가능한 소스는 MGF Company Inc., Savannah, GA, 또는&nbsp; Lyon Electric Company Inc., Chula Vista, CA</td></tr><tr><td>eppendor 튜브, 1.5ml</td><td>Sigma</td><td>T4816-250EA</td><td></td></tr><tr><td>수정된 White Leghorn 계란</td><td>모든 현지 공급업체</td><td></td><td></td></tr><tr>의<td>미세한 펜치</td><td>많은 출처가 사용 가능하며</td><td></td>, 혈구계를 <td>사용하기 전에 멸균해야 합니다</td></tr><tr><td>.</td><td>Millipore-Sigma</td><td>MDH-4N1-50PK</td><td></td></tr><tr><td>HT1080 인간 섬유육종 세포주</td><td>ATCC</td><td>CCL-121</td><td></td></tr><tr><td>이미지 분석 소프트웨어</td><td></td><td></td><td>우리는 Nikon Elements</td></tr><tr><td>Lectin Lens Culinary Agglutinin (LCA)을 Fluorescein 또는 Rhodamine과 결합하여 사용합니다.</td><td>Vector Laboratories</td><td>RL-1042, FL-1041</td><td>현미경 감각에 따라 희석 원료(5mg/ml) 50-100배. </td></tr><tr><td>MDA-MB-468 인간 유방암 ATCC</td><td></td><td>HTB-132</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x)</td>를 선별하는 데 사용되는 세포주의 색상과 다른 색상이어야 합니다. 많은 <td>소스가 사용 가능합니다</td><td></td><td></td></tr>. <tr><td>플라스틱 가중치 접시&nbsp;</td><td>Simport</td><td>CA11006-614</td><td>치수는 78x78x25mm이며, 다른 많은 소스는 작은</td></tr> 수술용 가위를 사용할 수 있습니다<tr><td>&nbsp;</td><td>사용 전에 멸균해야 하는</td> <td>많은 소스가 있습니다</td><td></td></tr><tr><td>. 나트륨 보로실리케이트 유리 모세관 튜브, 외경 1.0 mm, 내경 0.58 mm, 길이 10 cm;</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF100-58-10</td><td></td></tr><tr><td>사각 페트리 접시(가중 접시의 뚜껑으로 사용).</td><td>&nbsp; 폭스바겐&nbsp;</td><td>CA25378-115&nbsp;</td><td>치수는 100x100x15mm이며 다른 많은 소스를 사용할 수 있습니다</td></tr>.<tr><td>실체 형광 현미경&nbsp;</td><td></td><td></td><td>우리는 Zeiss Lumar v12</td></tr><tr><td>Tygon R-3603 실험실 튜빙</td><td>Cole-Parmer</td><td>AAC00001</td><td>내경 1/32 인치, 외부 직경 3/32 인치, 벽 두께</td></tr><tr><td>U-118 MG 인간 교모세포종</td><td>ATCC</td><td>HTB-15</td><td></td></tr><tr><td>U-87 MG 인간 교모세포종</td><td>ATCC</td><td>HTB-14</td><td></td></tr><tr><td>수직 피펫 풀러를 사용합니다.</td><td>많은 소스를 사용할 수</td><td></td> 있으며 <td>David Kopf Instruments, Tujunga, CA; 모델 720</td></tr></tbody></table>

신속하고 정량적인 병아리 chorioallantoic 멤브레인 모델을 사용하여 전이성 레귤레이터의 발견

Discovery of Metastatic Regulators using a Rapid and Quantitative Intravital Chick Chorioallantoic Membrane Model

암 연구에 있는 최근 어드밴스는 암 전이의 매우 복잡한 본질을 보여주었습니다. 다중 유전자 또는 유전자 네트워크는 암 유형, 조직 및 개별 환자 특성에 의존하는 암 전이성 캐스케이드 유전자 및 유전자 제품을 분화 조절하는 데 관여하는 것으로 밝혀졌다. 이들은 유전 치료 및 개인화된 약 접근을 위한 잠재적으로 중요한 표적을 나타냅니다. 급속한 검열 플랫폼의 발달은 이 유전 표적의 확인을 위해 필수적입니다.
병아리 chorioallantoic 막 (CAM)은 발달 배아에서 가스 교환을 허용하는 계란 껍질 아래에 위치한 고도로 혈관, 콜라겐이 풍부한 막입니다. CAM의 위치와 혈관화로 인해, 우리는 콜라겐이 풍부한 매트릭스 및 혈관과 암 세포 상호 작용의 견고한 인간 암 세포 xenografting 및 실시간 이미징을 허용하는 중요한 인간 암 전이 모델로 개발했습니다. 
이 모델을 사용하여, 정량적 선별 플랫폼은 새로운 드라이버 또는 암 전이의 억제제의 식별을 위해 설계되었습니다. 우리는 완전한 인간 게놈 shRNA 유전자 라이브러리를 가진 머리와 목 HEp3 암세포의 풀을 변환하고, 그 후, 저밀도에서, CAM 혈관화로 세포를 주입했습니다. 세포는 증식하고 단하나 종양 세포 식민지를 형성했습니다. CAM 조직으로 침입할 수 없었던 개별 식민지는 소형 식민지 표현형으로 보였으며 세포에 존재하는 트랜스포이드 된 shRNA의 식별을 위해 절제되었다. 개별 식민지의 이미지는 그들의 침략에 대 한 평가 되었다. 거짓 긍정의 비율을 줄이기 위해 여러 번의 선택이 수행되었습니다. 관심 있는 유전자를 발현하는 개별, 고립된 암세포 클론 또는 새로 설계된 클론은 1차 종양 형성 분석 또는 암 세포 혈관 학 공동 선택 분석을 받게 되었다. 요약하면 우리는 전이성 방지 대상 식별 및 이벤트의 동적 및 복잡한 계단식 에 대한 인트라비티 분석을 허용하는 신속한 선별 플랫폼을 제시합니다.

암세포 주사는 모세혈관에 박혀 있는 세포의 대다수가 단일이고 서로(~0.05-0.1cm)의 상당한 차이에 위치하여 5-6일 후 식민지가 인큐베이션기간(그림 3A)이겹치지 않도록 성공하는 것으로 여겨진다. 암세포의 축적이 모세혈관의 대부분에서 볼 수 있다면 주사가 성공하지 못했으며, 이를 나타내는 배아는 폐기되어야한다(도 2E). 주입된 암세포의 상당수는 주사의 24 시간 안에 멸망하는 몇몇 태아가 모든 암세포를 거부하는 것처럼 보입니다. 암세포 생존은 국소 계란 공급 업체에 따라 달라질 수 있으며(즉, 주입되는 세포의 양은 다를 수 있음) 실험을 진행하기 전에 최적의 주사 조건(암세포 농도 대 주사 기간)을 결정하는 것이 좋습니다. 0.5 x 106 ~ 1.0 x 106 셀/m 사이의 범위에서 세포 농도를 권장합니다. 최적의 ...

이것은 암 전이의 억제제 또는 드라이버를 위해 검열하는 효과적인 방법입니다. 발현 라이브러리로 변환된 세포는 전이성 콜로니를 형성하기 위해 닭 초리오알란토아막 혈관에 주입됩니다. 감소 또는 증가 된 침략을 갖는 식민지는 절제, 확장, 자신의 표현형을 확인하기 위해 재주입, 마지막으로, 높은 처리량 시퀀싱을 사용하여 분석.

신속하고 정량적인 병아리 Chorioallantoic 멤브레인 모델을 사용하여 전이성 레귤레이터의 발견

Recent advances in cancer research has illustrated the highly complex nature of cancer metastasis. Multiple genes or genes networks have been found to be ...

우리의 프로토콜은 뷰어의 암 침입을 차단하는 유전자 또는 유전자 조합의 효율적인 식별을 허용합니다. 문화를 통해 유지 보수를 위해 고급 동물 시설을 필요로하지 않습니다. 전체적으로 일반 또는 일반 특수 라이브러리는 몇 주 만에 뷰어로 상영될 수 있습니다.이 이상 선별 시스템은 연구원이 암 전이를 차단하기 위하여 이용될 수 있는 새로운 치료 유전자 표적 또는 유전자 표적 조합을 발견하는 것을 도울 것입니다. IV 주입의 경우, 세포를 희석하거나 다시 중단하기 위해 얼음 감기 1X PBS를 사용하여 밀리리터당 0.5~ 1백만 개의 세포에 세포를 농축합니다. 10개의 태아마다 약 1밀리리터의 세포 현탁액이 필요할 것으로 예상됩니다.주사 장치를 조립하려면 주사기에 바늘을 장착한 다음 3~5센티미터 길이의 튜브조각으로 주사기 바늘을 확장합니다. 미세 한 집게를 사용하여 보로 실리 케이트 바늘의 끝을 깰. 암 세포 현탁액의 50~ 200 마이크로리터로 주사기를 적재합니다.그리고 튜브에 borosilicate 바늘을 삽입합니다. 세포 막힘 및 기포에 대한 바늘을 검사합니다. 모세관 내에서 세포 막힘이 관찰되면 모세관을 제거하고 세포를 다시 일시 중단하고 새로운 모세관으로 대체하십시오.플런저를 사용하여 거품을 밀어내보도록 합니다. 커버 뚜껑을 제거하고 입체 범위 아래에 배아를 전달합니다. CAM 표면에 주입할 적절한 정맥을 식별합니다.이는 일반적으로 보로실리케이트 바늘 팁의 직경보다 약간 더 넓으며 배아와 계량 접시 벽 사이에 중간에 위치합니다.일반적으로 정맥 분기에 즉시 인접한 지점에서 주입하는 것이 더 쉽습니다. 혈관 벽에 바늘의 끝을 누르고 혈류와 같은 방향으로 부드러운 압력을 적용합니다. 필요한 경우 면봉을 사용하여 주입되는 선박을 고정하거나 안정화하십시오.원하는 부피가 주입될 때까지 주사기 플런저를 2~10초 동안 부드럽게 누르십시오. 주사 부위에 과도한 출혈이나 명확한 액체 축적이 나타나면 배아를 폐기하십시오. CAM에서 바늘을 제거하고 혈액 이나 과잉 암 세포를 제거 하는 면 봉면으로 주사 사이트를 부드럽게 두드려.계량 접시에 주입된 배아를 뚜껑으로 덮고 인큐베이터로 되돌려 보입니다. 모든 배아가 주입될 때까지 절차를 반복하십시오. 박테리아 또는 곰팡이 오염 또는 사망을 위해 배아를 육안으로 검사합니다.그리고 실험실 처리 절차에 따라 오염된 배아를 폐기하십시오. 전이성 식민지가 처음 1~3일 동안 제복을 입고 나

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

병아리 chorioallantoic 막 (CAM)은 angiogenesis와 tumorigenesis을 연구하는 독특한 자연 immunodeficient 지원 문화 환경입니다. 이 비디오 기사는 여자의 서로 다른 단계를...

병아리 예 비켜 문화와 예 비켜 CAM 어세이 : 그게 정말로 작동하는 방법

정량 PCR을 사용하여, 우리는 잘 설립된 여자 CAM 모델이 양적 먼 기관으로 인간의 종양 세포의 전이를 분석하는 데 사용할 수있는 방법을 보여줍니다.

조류 엠브료 모델을 사용하여 암 전이의 정량 분석

이 비디오에서는 암세포를 닭 융모막막에 이식하여  난자  모델을 생성하는 방법을 설명합니다. 이 모델은 부인암의 진행을 연구하기 위해 난소암 세포를 성공적으로 생착시킵니다.

Chicken Chorioallantoic Membrane-based Cancer Modeling: An An In Ovo Model to Study Cancer Cell Tumorigenesis and Metastasis(닭 융모막막기반 암 모델링: 암세포 종양 형성 및 전이를 연구하기 위한 In Ovo 모델)

이 동영상은 닭 융모막막혈관 구조에 암세포를 정맥 주사하여 CAM 암 전이 모델을 생성하는 절차를 보여줍니다. 주입된 세포는 결국 흩어져 있는 단일 암 세포 군체를 형성하여 암 침습 및 전이에 대한 연구를 가능하게 합니다.

닭 융모대질막막혈관구조에 암세포를 정맥 주사: 암 침입 및 전이를 연구하기 위한 융모대립막암 모델을 확립하는 절차

이 비디오에서는 껍질이 없는 난자 배양을 사용하여 닭 융모대질막막(CAM)에서 전이성 암세포 군집을 분리하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 암 전이의 원인이 될 수 있는 요인을 선별하는 데 도움이 됩니다.

닭 CAM에서 전이성 암 세포 집락 분리: 껍질이 없는 난자 배양에서 암세포를 분리하는 절차

<em&gt; OVO에서</em육종을위한 Xenograftmodel으로&gt; CAM-분석

Perineural 침략은 머리와 목 편평 상피 세포 암 및 그밖 종양을 위한 공격적인 표현형입니다. 병아리 융모난성 막 모형은 혈관신생, 암 침략 및 전이를 공부하기 위하여 이용되었습니다. 여기에서 우리는 이 모형이 생체내 perineural 침략을 평가하기 위하여 이용될 수 있는 방법을 보여줍니다.

두경부암의 신경성 침윤을 평가하는 생체내 병아리 융모난토암 막

전이성 맑은 세포 신장 세포 암은 철저한 전임상 조사를 위한 포괄적인 동물 모델이 없는 질병이다. 이 프로토콜은 질병에 대한 두 가지 새로운 동물 모델을 보여줍니다: 정형 이식 마우스 모델과 닭 융모난토막 모델, 둘 다 임상 사례를 닮은 폐 전이를 보여줍니다.

마우스 신장과 닭 융모알란투암 막에 설립된 전이성 맑은 세포 신장 세포 암종 모델 비교

우리는 부인과 및 비뇨기과 암 세포주 및 환자 유래 종양의 이식에 대한 대안, 이식 가능한 생체 내 모델로 닭 융모알구암 막 모델을 제시합니다.

비보 모델에서 닭 융모난토암 막을 사용하여 부인과 및 비뇨기과 암을 연구

암세포의 전이성 능력을 평가하기 위한 CAM-Delam 분석은 비교적 빠르고, 쉽고, 저렴하다. 이 방법은 전이 형성을 조절하는 분자 메커니즘을 풀고 약물 스크리닝에 사용할 수 있습니다. 인간 종양 샘플을 분석하기 위한 최적화된 분석은 개인화된 암 치료를 위한 임상 방법이 될 수 있다.

CAM-Delam Assay, 암세포의 박리 및 침윤 능력을 정량화하여 전이성 특성을 점수화하기 위한 분석

여기에서는 인간 난소 조직을 위한 병아리 융모막 이식(CAM) 이종 이식 모델을 개발하기 위한 프로토콜을 설명하고 기술의 효과, 이식편 혈관 재생술 기간 및 6일 이식 기간 동안 조직 생존력을 입증합니다.

난소 조직 이식을 연구하기 위한 도구로서의 병아리 맥락막 막(CAM) 모델

발견하세요 병아리 Chorioallantoic 멤브레인 모델을 활용한 암 전이 억제 유전자 스크리닝 방법입니다. 고급 동물 실험 시설 없이도 신속하게 암 침윤을 차단하는 유전자 또는 유전자 조합을 식별할 수 있습니다.

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