표준화된 장 루프 모델을 사용하여 마우스에서 장 투과성 및 호중구 환전 이동의 기능 평가

장 모델은 창자 얼마나 새는지 측정 하는 광범위 하 고 생리적인 방법 얼마나 새는 쥐에서 창 자에서 마이그레이션 하는 방법, 생체 내. 이 방법은 증가 된 장 투과성과 병리학장 염증의 기본 메커니즘을 더 잘 이해하는 데 도움이됩니다. 이 기술은 궤양성 대장염과 크론병에서 볼 수 있듯이 창자 장벽 기능 및 병리학적 염증의 근본적인 이해 메커니즘을 돕기 위해 사용될 수 있습니다.

이 모델은 장 장벽 기능 또는 마우스의 면역 세포 모집을 검사하기 위해 장막 또는 근위 결장 중 잘 혈관, 외부화된 창자 세그먼트를 사용합니다. 이 광범위한 응용 프로그램을 통해 장 루프 모델은 새는 장 장벽과 염증 반응으로 인한 질병에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 수술 단계를 연습하면 어려움을 극복할 수 있습니다.

완전히 혈관화된 장 세그먼트를 외부화하고 출혈을 피하기 위해 결찰에 적합한 위치를 선택하는 것이 매우 중요합니다. 장 루프 모델은 마이크로 외과 기술이므로 다른 외과 적 절차와 마찬가지로 시각적 데모 및 방법의 단계별 프리젠 테이션에서 크게 이점을 얻을 수 있습니다. 마취의 수술 평면을 달성 한 후, 알코올 면봉 또는 70 %에탄올에 담근 거즈 스폰지로 복부 미드 라인의 모피를 문질러 시작합니다.

저체온증을 방지하기 위해 알코올로 모피의 넓은 영역을 적시지 마십시오. 가위를 사용하여 중간 라인 복강경 절제술을 수행합니다. 복부 의 중간에 수평 절개를하고 복막을 노출하여 복부 내 장기를 손상시키지 않도록주의하십시오.

노출 된 복강 내 구멍 위에 미리 절단 된 젖은 면 거즈를 놓습니다. 젖은 면봉을 사용하여 cecum을 동원하고 외부화하고 젖은 면 거즈에 조심스럽게 배치하십시오. 그런 다음, 동원하고 부드럽게 ileum을 외부화.

장막 혈관과 혈액 공급을 방해하지 않고 젖은 면 거즈에 적어도 6 센티미터의 말단 일루를 배치하십시오. 노출 된 조직을 항상 촉촉하게 유지하십시오. 간질에 있는 ileum을 공급하는 주요 동맥을 확인합니다, cecum에 가까운.

그런 다음 중요한 혈관이없는 막질에 두 개의 결찰 부위를 찾습니다. 무딘 조직 집게로 말기 일루를 단단히 잡고 미세 팁 집게를 사용하여 혈관을 피하면서 장간을 회귀합니다. 천포에 실크 봉합사를 놓고 수술 매듭을 묶어 첫 번째 결찰을 만듭니다.

눈자를 사용하여 첫 번째 합자에서 4센티미터 떨어진 곳에 측정하고 두 번째 합자를 만듭니다. 4센티미터 의 일루 루프를 분리하여 혈액 공급과 막막을 그대로 유지하기 위해 미세 가위로 각 결찰 옆에 조심스럽게 잘라냅니다. 10 밀리리터 주사기에 부착된 유연한 노란색 공급 튜브를 사용하여 따뜻한 HBSS로 일릴 루프 세그먼트의 함량을 부드럽게 플러시합니다.

수술 부위를 깨끗하게 유지하기 위해 복부에서 발광 내용을 씻어 내십시오. 실크 봉합사를 곁들인 플러시 일루 루프의 두 컷 끝을 리게이트합니다. 30 게이지 바늘로 1 밀리리터 주사기를 사용하여 FITC-덱스트랜스 또는 케모킨과 같은 시약 250 마이크로리터를 장 루멘에 천천히 주입하십시오.

일막 루프가 팽창하여 점막의 적당한 팽창을 일으킵니다. 바늘 홀더, 해부학 집게 및 3.0 흡수할 수 없는 실크 봉합사를 역절단 바늘로 사용하여 복부 벽을 닫습니다. 저체온증을 방지하기 위해 동물을 건조 한 후, 잠복기 동안 온도 조절 마취 챔버에 놓습니다.

수술을 위해 마우스를 준비하고 이전에 설명한 대로 cecum을 외부화하십시오. 젖은 면 봉면을 사용하여 전체 일루를 외부화하고 젖은 면 거즈 위에 놓습니다. 메소콜론에 있는 근위 결장및 혈액 공급을 확인합니다.

근위 결장을 동원하고 메소콜론의 선박이 없는 지역에서 약 0.5cm의 하스쿼터를 생성한다. 첫 번째 합자에서 2 센티미터를 측정하고 메소콜론에서 혈액 공급이없는 영역에서 두 번째 합자를 만듭니다. 미세 한 가위를 사용 하 여 각 결찰 옆에 조심스럽게 잘라 2 센티미터 긴 pcLoop를 격리 합니다.

10 밀리리터 주사기에 부착된 유연한 노란색 공급 튜브를 사용하여 pcLoop를 따뜻한 HBSS로 부드럽게 플러시하여 대변을 제거합니다. 수술 부위를 깨끗하게 유지하기 위해 복부에서 발광 내용을 씻어 내십시오. 그런 다음 실크 봉합사를 사용하여 플러시 pcLoop의 두 컷 끝을 리게이트합니다.

30 게이지 바늘이 있는 1밀리리터 주사기를 사용하여 FITC-dextran 또는 chemokine와 같은 시약 200 마이크로리터를 장 루멘에 천천히 주입하십시오. pcLoop는 팽창하여 점막의 적당한 팽창을 일으킵니다. 젖은 면봉을 사용하여 ligated pcLoop, 일루, cecum을 부드럽게 다시 넣습니다.

바늘 홀더, 해부학 집게 및 3.0 흡수할 수 없는 실크 봉합사를 역절단 바늘로 사용하여 복부 벽을 닫습니다. 잠복기 후 마취 된 마우스를 안락사시키고 분석을 위해 조직을 수집합니다. 장 투과성 평가를 위한 I 루프 모델의 정확성을 확인하기 위해 FITC-dextran pcLoop 분석체는 생체내 장 장벽 기능의 조절에서 단단한 접합 관련 단백질 Jam-a의 역할을 평가하기 위해 수행되었다.

pcLoop 모델을 사용하면 FITC-dextran 혈청 수치가 대조군에 비해 Jam-a null 마우스에서 2.5배 증가하였다. 유사한 결과는 장 상피 세포에 Jam-a의 선택적 손실을 품고 있는 마우스로 얻어졌다. pcLoop 모델은 다형성 핵 호중구 또는 PMN을 연구하는 데 사용되었으며, 장 점막으로의 모집 및 생체 내의 후속 환피성 마이그레이션을 연구하는 데 사용되었습니다.

pcLoop의 발광 함량에서 PMN의 수는 유동 세포 측정 분석에 의해 정량화되었다. 근위 결장의 세그먼트에 존재하는 PMN의 수는 생리적 조건하에서 낮았다. 프로 염증 사이토카인, TNF 알파 및 IFN 감마를 가진 전처리는 수술 전에 pcLoop 루멘에서 모집된 PMN의 증강된 수의 결과로 이어졌습니다.

PMN 화학 요법의 투여는 PMN 카운트의 극적인 증가로 이어졌다 LTB4. 대장 점막에서 PMN의 면역히스토케미칼 염색은 사이토카인 및 LTB4를 자극한 후 PMN의 높은 모집을 확증한다. PMN 환피성 이동에 Jam-a의 기여는 장 상피 세포에 Jam-a의 선택적 손실을 항구 마우스에 pcLoop 모델을 사용하여 연구되었다.

상피 잼-a의 손실은 쓰레기 대조군에 비해 식민지 루멘에서 전환 PMN의 감소 된 수로 이어졌다. 이 기술에 대 한 중요 한 측면 수술을 수행 할 때 외부 장 세그먼트에 혈액 공급을 보존 하는 것을 기억 하는. 이 프로토콜에 따라, 장 투과성 분석 및 호중구 환전 이동 분석과 같은 다른 방법은 생체 내 장벽 무결성 및 장 염증의 손실을 조사하기 위해 수행 될 수있다.