Name: 결합 된 오존 과 LPS 유도 뮤린 급성 폐 부상 동안 폐 세포 적응 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 48 s
Description: 학습하세요 오존과 LPS 복합 노출로 유도된 쥐의 급성 폐 손상에서 폐 세포 적응 메커니즘을 형광 현미경법으로 분석하는 방법을. 이 기법은 폐 염증과 면역 반응 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 대통령의 NSERC 보조금과 실비아 페도루크 캐나다 원자력 혁신 센터의 스타트업 기금에 의해 지원됩니다. 실비아 페도루크 캐나다 원자력 혁신 센터는 혁신 서스캐처원의 지원을 받고 있습니다. 형광 화상 진찰은 NSERC에 의해 투자되는 WCVM 화상 진찰 센터에서 수행되었습니다. 제시카 브로코스(MSc 학생)와 만프리트 카우르(MSc Student)는 실비아 페도루크 캐나다 원자력 혁신 센터의 스타트업 기금으로 지원받았다.

<ol><li>Bhattacharya, J., Matthay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+repair+of+the+alveolar-capillary+barrier+in+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury.</a> Annual Review of Physiology. 75, 593-615 (2013).</li>
<li>Aulakh, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+the+lung%3A+%22the+first+responders%22%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in the lung: "the first responders".</a> Cell Tissue Research. , (2017).</li>
<li>Aulakh, G. K., Suri, S. S., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiostatin+inhibits+acute+lung+injury+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Angiostatin inhibits acute lung injury in a mouse model.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (1), 58-68 (2014).</li>
<li>Schneberger, D., Aulakh, G., Channabasappa, S., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+9+partially+regulates+lung+inflammation+induced+following+exposure+to+chicken+barn+air%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Occupational+Medicine+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 9 partially regulates lung inflammation induced following exposure to chicken barn air.</a> Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 11 (1), 1-10 (2016).</li>
<li>Shah, D., Romero, F., Stafstrom, W., Duong, M., Summer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+ATP+mediates+the+late+phase+of+neutrophil+recruitment+to+the+lung+in+murine+models+of+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Extracellular ATP mediates the late phase of neutrophil recruitment to the lung in murine models of acute lung injury.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 152-161 (2014).</li>
<li>Aulakh, G. K., Balachandran, Y., Liu, L., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiostatin+inhibits+activation+and+migration+of+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Angiostatin inhibits activation and migration of neutrophils.</a> Cell Tissue Research. , (2013).</li>
<li>Cakmak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+between+long-term+PM2.5+and+ozone+exposure+and+mortality+in+the+Canadian+Census+Health+and+Environment+Cohort+%28CANCHEC%29%2C+by+spatial+synoptic+classification+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Environment+International%22%5BJournal%5D)">Associations between long-term PM2.5 and ozone exposure and mortality in the Canadian Census Health and Environment Cohort (CANCHEC), by spatial synoptic classification zone.</a> Environment International. 111, 200-211 (2018).</li>
<li>Dauchet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+exposure+to+air+pollution%3A+Associations+with+lung+function+and+inflammatory+markers+in+non-smoking%2C+healthy+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Environment+International%22%5BJournal%5D)">Short-term exposure to air pollution: Associations with lung function and inflammatory markers in non-smoking, healthy adults.</a> Environment International. 121, Pt 1 610-619 (2018).</li>
<li>Delfino, R. J., Murphy-Moulton, A. M., Burnett, R. T., Brook, J. R., Becklake, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+air+pollution+on+emergency+room+visits+for+respiratory+illnesses+in+Montreal%2C+Quebec%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Effects of air pollution on emergency room visits for respiratory illnesses in Montreal, Quebec.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 155 (2), 568-576 (1997).</li>
<li>Peterson, M. L., Harder, S., Rummo, N., House, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ozone+on+leukocyte+function+in+exposed+human+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Research%22%5BJournal%5D)">Effect of ozone on leukocyte function in exposed human subjects.</a> Environmental Research. 15 (3), 485-493 (1978).</li>
<li>Rush, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+chronic+exposure+to+air+pollution+and+mortality+in+the+acute+respiratory+distress+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Pollution%22%5BJournal%5D)">Association between chronic exposure to air pollution and mortality in the acute respiratory distress syndrome.</a> Environmental Pollution. 224, 352-356 (2017).</li>
<li>Rush, B., Wiskar, K., Fruhstorfer, C., Celi, L. A., Walley, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Impact+of+Chronic+Ozone+and+Particulate+Air+Pollution+on+Mortality+in+Patients+With+Sepsis+Across+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Intensive+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Impact of Chronic Ozone and Particulate Air Pollution on Mortality in Patients With Sepsis Across the United States.</a> Journal of Intensive Care Medicine. , (2018).</li>
<li>Stieb, D. M., Burnett, R. T., Beveridge, R. C., Brook, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+ozone+and+asthma+emergency+department+visits+in+Saint+John%2C+New+Brunswick%2C+Canada%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Association between ozone and asthma emergency department visits in Saint John, New Brunswick, Canada.</a> Environmental Health Perspectives. 104 (12), 1354-1360 (1996).</li>
<li>Thomson, E. M., Pilon, S., Guenette, J., Williams, A., Holloway, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ozone+modifies+the+metabolic+and+endocrine+response+to+glucose%3A+Reproduction+of+effects+with+the+stress+hormone+corticosterone%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Ozone modifies the metabolic and endocrine response to glucose: Reproduction of effects with the stress hormone corticosterone.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 342, 31-38 (2018).</li>
<li>Aulakh, G. K., Brocos Duda, J. A., Guerrero Soler, C. M., Snead, E., Singh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+low-dose+ozone-induced+murine+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterization of low-dose ozone-induced murine acute lung injury.</a> Physiological Reports. 8 (11), 14463(2020).</li>
<li>Aulakh, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+regional+murine+ozone-induced+lung+inflammation+using+%5B18F%5DF-FDG+microPET%2FCT+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Quantification of regional murine ozone-induced lung inflammation using [18F]F-FDG microPET/CT imaging.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15699(2020).</li>
<li>Charavaryamath, C., Keet, T., Aulakh, G. K., Townsend, H. G., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+responses+to+secondary+endotoxin+challenge+in+rats+exposed+to+pig+barn+air%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Occupational+Medicine+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Lung responses to secondary endotoxin challenge in rats exposed to pig barn air.</a> Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 3, London, England. 24(2008).</li>
<li>Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+pulmonary+damage+induced+by+lipopolysaccharide+via+intranasal+instillation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation.</a> Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).</li>
<li>Southam, D. S., Dolovich, M., O'Byrne, P. M., Inman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+intranasal+instillations+in+mice%3A+effects+of+volume%2C+time%2C+body+position%2C+and+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position, and anesthesia.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 282 (4), 833-839 (2002).</li>
<li>Aulakh, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+CD34+produces+defects+in+platelets%2C+microparticles%2C+and+lung+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Lack of CD34 produces defects in platelets, microparticles, and lung inflammation.</a> Cell Tissue Research. , (2020).</li>
<li>Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+and+recovery+of+the+alveolar+macrophage+phagocytic+system+during+continuous+exposure+to+0.5+ppm+ozone%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Lung+Research%22%5BJournal%5D)">Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone.</a> Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).</li>
<li>Yipp, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lung+is+a+Host+Defense+Niche+for+Immediate+Neutrophil-Mediated+Vascular+Protection%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Lung is a Host Defense Niche for Immediate Neutrophil-Mediated Vascular Protection.</a> Science Immunology. 2 (10), (2017).</li>
<li>Lee, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiostatin+regulates+the+expression+of+antiangiogenic+and+proapoptotic+pathways+via+targeted+inhibition+of+mitochondrial+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Angiostatin regulates the expression of antiangiogenic and proapoptotic pathways via targeted inhibition of mitochondrial proteins.</a> Blood. 114 (9), 1987-1998 (2009).</li>
<li>Hawkins, C. L., Davies, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+identification%2C+and+quantification+of+oxidative+protein+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Detection, identification, and quantification of oxidative protein modifications.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (51), 19683-19708 (2019).</li>
<li>Hemming, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+Pollutant+Ozone+Causes+Damage+to+Lung+Surfactant+Protein+B+%28SP-B%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Environmental Pollutant Ozone Causes Damage to Lung Surfactant Protein B (SP-B).</a> Biochemistry. 54 (33), 5185-5197 (2015).</li>
<li>Oosting, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+of+surfactant+protein+A+to+ozone+in+vitro+and+in+vivo+impairs+its+interactions+with+alveolar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Exposure of surfactant protein A to ozone in vitro and in vivo impairs its interactions with alveolar cells.</a> American Journal of Physiology. 262 (1), Pt 1 63-68 (1992).</li>
<li>Roth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+necrotic+neutrophils+release+interleukin-16C+and+macrophage+migration+inhibitory+factor+from+stores+in+the+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Discovery%22%5BJournal%5D)">Secondary necrotic neutrophils release interleukin-16C and macrophage migration inhibitory factor from stores in the cytosol.</a> Cell Death & Discovery. 1, 15056(2015).</li>
<li>Kawaguchi, N., Zhang, T. T., Nakanishi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+CXCR4+in+Normal+and+Abnormal+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Involvement of CXCR4 in Normal and Abnormal Development.</a> Cells. 8 (2), (2019).</li>
<li>Gupta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrapulmonary+manifestations+of+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Extrapulmonary manifestations of COVID-19.</a> Nature Medicine. 26 (7), 1017-1032 (2020).</li>
<li>Aulakh, G. K., Kuebler, W. M., Singh, B., Chapman, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAulakh%2C+GK+%222017+IEEE+Nuclear+Science+Symposium+and+Medical+Imaging+Conference+%28NSS%2FMIC%29%22">2017 IEEE Nuclear Science Symposium and Medical Imaging Conference (NSS/MIC)</a>. , 1-2 (2017).</li>
<li>Aulakh, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+image+x-radiography+for+functional+lung+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+in+Medicine+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiple image x-radiography for functional lung imaging.</a> Physics in Medicine & Biology. 63 (1), 015009(2018).</li>
</ol>

저자는 이해 상충이나 공개가 없습니다.

현재 연구에서 제시된 방법은 폐 염증 도중 다중 세포 사건을 공부하기 위하여 다중 구획 분석의 유용성을 강조합니다. 표 2의결과를 요약했습니다. 우리와 많은 실험실은 광범위하게 폐 호중구의 급속한 모집에 의해 표시되는 비강 LPS 주입에 뮤린 반응을 연구했습니다, 이는 6-24 시간 사이 피크, 해상도차기. 그리고 최근에는 서브임상O3(2시간 동안 0.05ppm)만으로도 폐 혈관 구획에 호중구를 분할하여 표시되는 C57BL/6NJ 서브 스트레인15에서상당한 폐 손상을 유도할 수 있으며, 이는 BAL에서 손상된 대식세포및 파편이 관찰된 반면, 따라서O3의염증 가능성을 나타낸다. 그 모형에서 우리는 O3 유도한 폐포 상피 손상및 폐포 대식세포에 의하여 결과된 phagocytosis결과로 폐포 구획에 있는 호중구의 부재를 관찰했습니다. 우리는 O3 모형에 있는 세포외 DNA 및 파편을...

급성 폐 손상(ALI)은 응고, 섬유성 및 선천성 면역 계통1의동시 활성화에 의해 표시되는 전염성 또는 기타 유해한 자극에 대한 폐의 중요한 병리학 반응이다. 호중구는 즉시 톨과 같은 수용체 (TLR) 패밀리2,3,4를통해 미생물 및 세포 내 손상 패턴을 감지합니다. Neutrophils는 그 때 부수적인 조직 손상을 일으키는 원인이 될 수 있는 미리 형성된 사이토카인 및 세포독성 과립 내용을 풀어 놓습니다. 이어지는 폐포 손상은 아데노신 삼위산염 (ATP)5와같은 분자의 방출로 이어지는 이차 세포 죽음으로 손상되어 면역 dysregulation의 악순환에서 설정됩니다.
ALI의 이해에 해결되지 않은 문제는 발포막 내에서 부상이 어떻게 시작되는지에 대한 문제와 관련이 있습니다. 전자 수송 복합체 V, F1F0 ATP 신타제는 염증 중 세포(내피, 백혈구, 상피 포함)에서 유비쿼터스로 발현되는 것으로 알려진 미토콘드리아 단백질이다. 액틴과 튜룰린으로 구성된 세포 골격은 미토콘드리아 단백질뿐만 아니라 많은 세포 모양과 기능 변조를 각각 항구합니다. 우리는 최근에 내인성 분자, 혈관 스타틴, 침묵 호중구 모집, 활성화 및 리포 폴리사카라이드 (LPS)에 의해 ATP synthase의 봉쇄가 폐 염증6을유도하는 것으로 나타났습니다. 따라서, 생화학적(ATP synthase)과 면역(TLR4) 메커니즘은 폐 염증 시 폐포 장벽을 조절할 수 있다.
오존(O3)에 노출되면 환경 오염물질, 폐 기능 저하, 폐 감염에 대한 감수성을 증가시키고,O3 노출의 짧은 저수준은 근기 심폐질환7,8,9,10,11,12, 13,14의기초심률을 가진 이들의 사망률 위험을 증가시킨다. 따라서,O3의 생리학적관련 농도에 노출되면 염증7,8의근본적인 기전을 연구하기 위한 ALI의 의미 있는 모델을 제공한다. 우리 실험실은 최근 저용량 O3 유도 ALI 15의 뮤린 모델을설립했다. 낮은O3 농도에 대한 투여량 및 시간 반응을 수행한 후, LPS 모델과 유사한 폐 ATP 신타제 복합 V 서브유닛 β(ATPβ) 및 혈관스타틴 발현에 의해 표시되는 급성 폐 손상을 유도하는 것을 관찰하였다. 인트라바이탈 폐 이미징은 폐 손상을 나타내는 폐포액소균의 해체를 밝혀, 및 폐포 중격 반응성 산소 종(ROS) 수준(기준세포 신호의 변색을 나타내는) 및 미토콘드리아 막 전위(급성 세포 사멸을 나타내는)의 절제는 이질성 폐 18FDG 보존16,중성구 모집 및 사이토메16-16, 중성구 모집 및 사이토메킨 방출과 상관관계가 있는 0.05 ppm O315에 2시간 노출 후 우리의 최근 연구에서 테이크 홈 메시지는 O3 인간의 노출에 대 한 8 시간 (하루) 허용 된 한계 아래 농도에 노출 될 때 기하 급수적으로 높은 독성을 생산. 중요하게도, 이러한 하위 임상O3 노출이 세균성 내독소(17)에 의한 TLR4 매개메커니즘을 조절할 수 있는지에 대해서는 명확한 이해가 존재하지 않는다. 따라서, 우리는 이중 히트 O3 및 LPS 노출 모델을 공부하고 면역 및 비 면역 세포 적응을 관찰했다.
우리는 다양한 폐 및 전신 바디 구획, 즉 기관지 폐포 라베지 액체의 포괄적인 형광 현미경 분석을 기술합니다 (즉,, BAL) 폐포 공간을 샘플링하는, 폐 혈관 난간 (즉, LVP)은 폐 혈관 과 폐 막증을 시료하고 폐경 벽이 손상된 경우 폐 극저섹션을 남기고, 상주 피렌자피 및 부착 된 leuks좌를 들여다 보는 , 순환백혈구체와 흉골 및 대퇴골골수를 나타내는 말초 혈액은 각각 염증 중 조혈 세포 동원의 근해 및 말단 부위를 시료하는 양상동맥 및 대퇴골 골수와 이복된다.

<table><tbody><tr><td>33-plex Bioplex chemokine panel</td><td>Biorad</td><td>12002231</td><td></td></tr><tr><td>63X oil (NA 1.4-0.6) 현미경 대물렌즈</td><td>Leica</td><td>HCX PL APO CS (11506188)</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 350 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11045</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11002</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488 conjugated phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A12370</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555 활용 염소 항 -&알파; 튜불린 클론 DM1A</td><td>Millipore</td><td>05-829X-555</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 568 활용 염소 항 햄스터 IgG (H + L)</td><td>Invitrogen</td><td>A21112</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 568 활용 염소 항 쥐 IgG (H + L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11077</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 633 활용 염소 항 토끼 IgG (H + L)</td><td>Invitrogen</td><td>A21070</td><td></td></tr><tr><td>아르메니아 햄스터 안티 CD61 (클론 2C9. G2) IgG1 kappa</td><td>BD Pharmingen</td><td>553343</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 J Mice</td><td>Jackson Laboratories</td><td>64</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 레이저 스캐닝 현미경</td><td>Leica</td><td>Leica TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&prime;,6-diamidino-2-phenylindole)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>분취 2 &micro; l 재고 및 상점 -20°C; C</td></tr><tr><td>도립 형광 광시야 현미경</td><td>Olympus</td><td>Olympus IX83</td><td></td></tr><tr><td>케타민(나르케탄)</td><td>베토퀴놀</td><td>100mg/ml</td><td>10회 희석하여 10mg/ml 스톡</td></tr> 만들기Live<tr><td>(calcein)/Dead(Ethidium homodimer-1) 세포독성 키트</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>마우스 anti-ATP5A1 IgG2b(클론 7H10BD4F9)</td><td>Invitrogen</td><td>459240</td><td></td></tr><tr><td>마우스 항-ATP5&베타; IgG2b (클론 3D5AB1)</td><td>Invitrogen</td><td>A-21351</td><td></td></tr><tr><td>마우스 anti-NK1.1 IgG2a kappa (클론 PK136)</td><td>Invitrogen</td><td>16-5941-82</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 660 nm 단백질 분석</td><td>Thermoscientific</td><td>22660</td><td></td></tr><tr><td>토끼 항 안지오스타틴 (마우스 aa 98-116) IgG</td><td>Abcam</td><td>ab2904</td><td></td></tr><tr><td>토끼 anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880)</td><td>Invitrogen</td><td>14-6093-81</td><td></td></tr><tr><td>쥐 anti-Ki-67 (클론 SolA15) IgG2a 카파</td><td>Invitrogen</td><td>14-5698-82</td><td></td></tr><tr><td>쥐 안티 Ly6G IgG2a 카파 (클론 1A8)</td><td>Invitrogen</td><td>16-9668-82</td><td></td></tr><tr><td>쥐 안티 Ly6G / Ly6C (Gr1) IgG2b 카파 (클론 RB6-8C5)</td><td>Invitrogen</td><td>53-5931-82</td><td></td></tr><tr><td>쥐 안티 마우스 CD16 / CD32 Fc 블록 (클론 2.4G2)</td> <td>BD Pharmingen</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>감소 mitotracker orange</td><td>Invitrogen</td><td>M7511</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine (Rompun)</td><td>Bayer</td><td>20 mg/ml</td> 2회 <td>희석하여 10mg/ml 육수 만들기</td></tr></tbody></table>

결합 된 오존 과 lps 유도 뮤린 급성 폐 부상 동안 폐 세포 적응 시각화

Visualizing Lung Cellular Adaptations during Combined Ozone and LPS Induced Murine Acute Lung Injury

폐는 멸균 (입자 또는 반응성 독소) 및 전염성 (세균성, 바이러스 또는 곰팡이) 염증 조건의 형태로 직접적이고 간접적인 모욕에 지속적으로 직면합니다. 압도적인 숙주 반응은 병리학적 숙주 면역, 응압 및 조직 리모델링 반응의 결과로 폐 호중구 모집을 특징으로 하는 손상된 호흡 및 급성 폐 손상을 초래할 수 있습니다. 소뇨폐 세포 적응을 시각화하고 정량화하는 민감한 현미경 방법은 저용량(0.05 ppm) 오존에 대응하여, TLR4 작용제인 세균성 리포폴리사카라이드와 함께 강력한 환경 오염물질로 숙주 염증 및 수리 메커니즘을 이해하는 데 매우 중요합니다. 우리는 다양한 폐 및 전신 바디 구획, 즉 기관지-폐포라 라베지 액체, 폐 혈관 난투, 좌측 폐 극저섹션 및 흉골 골수 투과구의 포괄적인 형광 현미경 분석을 기술합니다. 당사는 분석된 구획에서 이산 케모킨 그라데이션에 의해 표시되는 지연(최대 36-72h) 면역 반응과 상관되는 골수 세포뿐만 아니라 폐포성 대식세포의 손상을 보여줍니다. 또한 폐 세포 외 매트릭스 및 세포 세포 종편 상호 작용 (액틴, 튜룰린), 미토콘드리아 및 반응성 산소 종, 항 응고 성 플라스미노겐, 항 혈관 신생 펩타이드 단편 혈관 산기 세포 혈관, 미토콘드리아 ATP 시네시아 복합 V 서브 유닛, α 및 β 제시합니다. 이러한 대리 마커는 적절한 체외 세포 기반 분석술및 생체 내 미생물 현미경 검사법과 같은 생체 내 동물 이미징 기술로 보충될 때, 새로운 면역 조절제에 대한 폐 반응을 이해하는 쪽으로 중요한 정보를 제공할 수 있다.

결합된 O3및 LPS 노출은 72h에서 전신 염증 및 골수 동원으로 이끌어 냅니다: 다른 구획에 있는 세포 수는 말초 혈액에 있는 중요한 변경을 밝혔고 대퇴골골총 세포는 결합한 O3 및 LPS 노출에 근거를 두는 때 계산합니다. 결합된O3 및 LPS 노출은 총BAL(도 1A)또는 LVP(도1B)세포 수, 다형성형 세포가 24(도1F,보충도 1),노출 후 36및 72h에서 우세한 세포 유형으로 제시된 어떠한 변화도 유도하지 않았다. 24h BAL 사이토스핀이미지(도 1F)에서다형성 핵세포에 시글렉-f 및 CX3CR1 염색이...

결합 된 오존과 세균성 내독신 노출 마우스는 호중구의 것을 포함하여 광범위한 세포 죽음을 보여줍니다. 우리는 세포 골격 라멜레포디아의 중단, 기관지 폐포 라베이지의 복잡한 V ATP synthase 서브유닛 β 및 혈관 스타틴의 세포 발현 증가, 폐 면역 반응 억제 및 지연 된 호중구 모집과 같은 세포 적응을 관찰했습니다.

결합 된 오존 과 LPS 유도 뮤린 급성 폐 부상 동안 폐 세포 적응 시각화

Lungs are continually faced with direct and indirect insults in the form of sterile (particles or reactive toxins) and infectious (bacterial, viral or ...

안녕하세요, 내 이름은 구르프리트입니다. 우리의 실험실은 폐 염증 및 수리의 메커니즘을 조사합니다. 안녕하세요, 내 이름은 제시카이고 나는 형광 현미경 방법을 사용하여 오존 유도 실험실 쥐 폐포를 조사합니다.안녕하세요 여러분, 내 이름은 Manpreet입니다. 그리고 동물 화상 진찰 방법으로 폐 염증을 연구합니다. 폐는 지속적으로 오존과 같은 멸균및 세균성 리포폴리사카라이드 또는 LPS와 같은 미생물 성분에서 발생하는 직접및 간접적인 모욕에 직면해 있습니다.압도적인 호스트 반응은 통제되지 않는 호스트 면역, 응고성 및 조직 리모델링 때문에 폐 호중구 모집을 특징으로 하는 손상한 호흡 및 급성 폐 상해귀착될 수 있습니다. 우리는 다양한 구획, 즉 기관지-폐포라 라베이지 액, 즉 BAL, 폐 혈관 난투, 즉 LVP, 좌측 폐 저온 섹션, 말초 혈액 및 흉골 및 대퇴골 골수의 포괄적인 분석을 설명합니다. 오존 노출의 경우 마우스를 사용자 지정 유도 상자에 부드럽게 배치하고 마우스를 오존0.05 PPM에 지속적으로 노출시2시간 동안 노출시다.LPS 노출의 경우, 가벼운 인트라테오네케타민과 자일라진 믹스 하에서 마우스를 마취한다. 이제 LPS 용액50마이크로리터를 마우스 외부 나레에 주입합니다. 멸균 식염수 50 마이크로 리터와 제어 마우스를 주입.지정된 시점에서 케타민과 자일라진 믹스의 전체 용량으로 마우스를 마취시화합니다. 다음으로 마우스를 살균하고 페달 반사 신경을 확인, 즉 뒷다리 숫자 중 하나를 꼬집고, 사지의 후퇴를 관찰. 반사작용이 없다는 것은 깊은 마취를 의미합니다.이제 흉골 아래 컷을하고 마음을 노출. 혈액 주사기에 부착된 25게이지 바늘을 오른쪽 심실로 넣고 심장 펑크로 혈액을 그립니다. 고분리 된 주사기에서 혈액을 수집하고 추가 처리를 위해 미세 분리 튜브에서 배출하십시오.조심스럽게 핀셋 이나 무딘 집게를 사용 하 여 오버티 티슈에서 기관 영역을 취소. 이제 폐를 노출하기 위해 흉곽을 잘라. 기관 아래에 면 합자를 전달하고 당분간 그대로 둡니다.기관 절제술을 위해 폐에서 길이의 약 1/3에 간격을 두는 기관지. 기관지에 28 게이지 폴리에틸렌 캐뉼라를 삽입합니다. 면 합자를 단단히 묶어 캐뉼라를 제자리에 고정시합니다.캐뉼라를 무너지지 않도록 하십시오. 이제 점차적으로 1 mL 주사기의 도움으로 캐뉼라에 PBS 0.5 ml를 주입합니다. PBS를 주입 한 후 흡입에 저항하지 않는 한 주사기를 흡인합니다.표지된 미세 파기 튜브에서 흡인된 액체를 수집하고 이 절차를 두 번 더 반복합니다. 폐 관류 중 백업을 피하기 위해 흉부와 복부 반쪽 사이의 위치에서 내림차순 흉부 대자를 잘라. 절단 대오르타 끝 근처에 구멍을 얼룩 혈액이 없는 끝.다음으로 폐에 0.5 ML의 상온 이산식염수를 주입하고 오른쪽 심실을 통해 주입합니다. 내림차순 흉부 대동맥의 절단 끝에 있는 구멍에서 혈관 분리를 수집합니다. 오른쪽 기관지계를 구각한 후, 왼쪽 폐가 0.5 ML의 파라포름알데히드로 팽창하여 5분간 팽창시키십시오.이제 복부 부분을 소독합니다. 복부 부분을 잘라 골반 뼈에서 책상을 부수습니다. 골반 뼈를 수집하고 얼음위에 보관된 식염수 채워진 페트리 접시에 왼쪽과 오른쪽 대퇴골 뼈를 분리합니다.복부 갈비뼈 케이지와 흉골을 식염수로 채워진 페트리 접시에 모아 얼음 위에 보관합니다. 잘 맞는 바늘을 1 ML 주사기에 사용하여 식염수0.5 ML로 뼈의 절단 끝을 4 번 퍼퓨즈하십시오. 각 뼈의 분획을 필터가 장착하고 얼음 위에 놓인 표지된 팔콘 튜브로 수집합니다.심분리기는 3000 RPM에서 10분 동안 모든 샘플을 원심분리합니다. 초월체를 수집하고 플래시는 그들을 동결. PBS의 최소 200 마이크로 리터에서 세포를 재구성합니다.총 백혈구 수를 수행합니다. 칼신 그린과 붉은 에디듐 호모디머 하나의 얼룩의 혼합으로 BAL의 또 다른 액체를 얼룩. 케모키인 및 총 단백질 농도에 대한 상체를 분석합니다.원심 분리는 생화학 및 면역 단백질을 위한 각 슬라이드및 얼룩에 2개의 사이토스핀을 준비하는 세포를 준비합니다. 모든 그룹에 대해 폐 극저섹션에 수정된 H 및 E 염색을 수행합니다. 병합된 이미지 패널에서 150~200개의 셀을 수동으로 간략하게 설명합니다.모든 채널에 관심 있는 영역을 복사합니다. 모든 채널에 대한 사전 설정 매개 변수를 측정합니다. 염색된 분자의 형광 강도를 DAPI 또는 CD61에 의해 나눕니다.이들은 DAPI 또는 CD 61 정규화형 광등 강도 비율로 불려집니다. 다음으로 매개 변수를 플롯하여 노출 후 변경 내용을 평가합니다. 비록, 결합된 노출은 총 BAL, LVP 또는 흉골 골수 세포 수에 있는 어떤 변경도 유도하지 않았더라도, 마우스는 24 시간에 전신 백혈구증을 표시하고, 노출 후에 72 시간에 백혈구를 선행하였다.이들은 말초 혈액 세포 수에 표시됩니다. 대퇴골골수 세포 수는 모든 시간 점에 비해 72 시간에 늦은 스파이크를 보여줍니다. BAL 사이토스핀의 이미지에서 24시간 동안 다형성 핵세포에 시글렉-F 및 CX3CRI 염색이 없는 점에 유의하시기 바랍니다.BAL 및 LVP 사이토스핀은 0시간에 큰 CD11b 및 GR1 양성 단일핵 세포의 존재를 보여주었다. 다형성핵 세포는 노출 후 모든 구획에서 우세한 세포 유형으로 제시된다. BAL 총 단백질 함량은 결합 된 노출 후 36 시간으로 가장 높았습니다.그러나, LVP 단백질은 노출 후에 변경되지 않았습니다. 에오타신-2 및 인터류신-2의 수준은 LVP에서 4시간 만에 가장 높았다. 이러한 케모키닌은 BAL 분획에서 감소되었다.흥미롭게도, 호중구 경보 IL-16 및 많은 타고난 케모키네는 LVP에서 변경되었지만 BAL 분획은 아닙니다. BAL 세포의 95% 이상 기준선에서 피질 액틴, 라멜리포디아, 스트레스 및 튜룰린 섬유를 나타내는 모노 핵이 있었으며, 미토트래커 염색을 감소시키는 데 매우 긍정적이었습니다. 4시간 만에 액틴을 잃어버린 원형 BAL 세포를 관찰했지만, 적색 및 하부 감소된 미토트래커 염색에 도시된 바와 같이 마이크로튜블러 네트워크가 확산되는 것을 보여주었습니다.결합 된 노출 후 초기, BAL 세포는 부분적으로 손상된 세포를 나타내는 칼세인과 에디듐 호모이머-1에 대한 이중 양성 등장. 36 시간에서 BAL 세포는 대체로 실행 가능했으며 녹색입니다. 우리는 BAL 폐포 대식세포 및 호중구에서 이산 ATP 알파 및 Ly6G 염색을 관찰했습니다.우리는 DAPI 정상화 ATP 알파의 감소와 세포 내 Ly6G 단백질 함량의 증가를 관찰했다. 결합된 노출은 발, 천연 킬러 세포 및 K1.1, 호중구 ATP, 서브 유닛 PETA, 증식 인자, Ki-67 및 호중구 GR1, 혈소판 CX3CRI 및 발 세포에서 항 혈관신생 혈관발틴 단백질의 지속적인 발현을 유도하였다. 기관지 및 폐포 중격 손상이 예상되었지만 노출 후 36 시간 후에 대형 선박에서 세포 응고를 관찰하는 것은 놀랍습니다.마지막으로 이 표에는 요약자 결과가 있습니다. 우리는 우리의 murine 모형이 침략적인 세포 죽음 및 감염의 기계장치를 공부하기 위한 레벨 2 봉쇄 실험실에서 재현될 수 있는 쉽게 접근할 수 있는 프로토타입역할을 하기를 바랍니다. 감사합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

NADPH 산화 효소가 phagocytes에서 반응성 산소 종의 주요 소스 (ROS)입니다. 때문에 ROS의 임시 자연의, 그것은 생활 동물의 ROS 수준을 측정하고 모니터링하기가 어렵습니다. 생활 쥐 ROS의 일련 정량화하기위한 최소한 침입 방법 설명되어 있습니다.

다른 동물 모델에서 NADPH 산화 효소 활동의 Bioluminescence 영상

병원균 감염에 대한 숙주 면역 반응은 긴밀하게 규제 과정이다. 생쥐의 리포 다당류 폐 노광 모델을 이용해서, 그 질병 병인과 관련된 복잡한 메커니즘은 고해상도 평가를 수행하는 것이 가능하다.

마우스의 호스트 면역 반응을 평가하기 위해 구인두 기관 내 PAMP 관리 및 폐포의 활용

우리는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 기관내 주입에 의한 쥐 폐 손상 모델을 개발했습니다. 이 모델은 폐렴 중 폐 손상을 모방하며 임상적으로 관련이 있습니다.

녹농균 유발 폐 손상 모델

이 연구는 반복적으로 오존의 높은 농도에 쥐를 노출 하 여 새로운 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD) 동물 모델의 성공적인 세대를 설명 합니다.

반복된 오존 노출에 의해 쥐에 만성 폐쇄성 폐 질환 모델의 생성

여기에 제시된 단계별 절차는 직접적인 경포대당증 주입에 의해 마우스에서 급성 폐 손상을 유도하고 혈액 샘플, 기관지 정맥 세척액 및 폐 조직의 FACS 분석을 수행하기 위한 것이다. 최소 침습성, 간단한 취급, 좋은 재현성 및 질병 중증도의 적정은 이 접근법의 이점입니다.

직접 경포당증 주입에 의해 마우스에 있는 심각한 폐 상해를 유도하는

마우스에서 좌측 폐에 선택적 기관차 산 주입은 위산 흡인에 의해 유도된 인간 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS)을 모델로 하는 일방적이고 자가 제한적인 급성 폐 손상을 초래한다.

일방적인 기관내 산 성 증착에 의한 자가 제한 급성 폐 손상의 모델

이 원고는 오존에 노출 여부를 결정하기위한 프로토콜을 설명, 기준 대기 오염 물질, 생체 내에서 폐포 대식세포 efferocysis를 손상. 이 프로토콜은 일반적으로 사용되는 시약 및 기술을 활용하고 폐 포상 손상의 여러 모델에 적응하여 폐포 대식세포 효능에 미치는 영향을 결정할 수 있습니다.

오존 노출 에 따른 폐포 대식세포 비세포증의 생체내 평가

본 프로토콜은 급성 호흡곤란 증후군(ARDS)을 모방하기 위해 올레산을 사용하는 마우스의 폐 손상 모델을 설명합니다. 이 모델은 부종에 대한 염증 매개체를 증가시키고 폐 순응도를 감소시킵니다. 올레산은 소금 형태(올레산염)로 사용되는데, 이 생리학적 형태가 색전증의 위험을 피하기 때문입니다.

올레산 유도 급성 호흡곤란 증후군의 마우스 모델

생체 내 형광 현미경 검사는 백혈구 - 내피 상호 작용 및 모세관 관류를 실시간으로 연구하는 데 활용 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 진공-안정화된 폐 영상화 시스템을 사용하여 폐 미세순환에서 이러한 파라미터를 영상화하고 정량화하는 방법을 기술한다.

진공 안정화 이미징 시스템을 이용한 실험적 급성 폐 손상에서의 폐 미세순환의 생체내 광역 형광 현미경 검사

환기를 유지하고 저산소증을 피하면서 왼쪽 폐 허혈 재관류 (IR) 손상을 만드는 마우스 수술 모델.

Orotracheal 삽관 및 환기 폐 허혈 재관류 수술의 마우스 모델

본 연구에서는 기본 후두경을 사용하여 쥐에서 ALI를 발달시키는 비침습적 기기관내 삽입 기법이 입증되어 LPS가 폐에 정밀히 전달되도록 합니다. LPS는 후두경을 이용한 기관내관 을 통해 주입됩니다. 폐 손상의 규모는 여러 시점에서 평가됩니다.

설치류에서 급성 폐 손상을 유도하기 위한 비침습적 기관내 지포폴리당(Lipopolysaccharide) 투여

학습하세요 오존과 LPS 복합 노출로 유도된 쥐의 급성 폐 손상에서 폐 세포 적응 메커니즘을 형광 현미경법으로 분석하는 방법을. 이 기법은 폐 염증과 면역 반응 연구에 활용됩니다.

결합 된 오존 과 LPS 유도 뮤린 급성 폐 부상 동안 폐 세포 적응 시각화

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