Name: 살아있는 포유류 청각 머리 세포에 있는 나노 규모 해상도를 가진 스테레오실리모들 화상 진찰 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: 학습하세요 HPICM을 이용한 살아있는 포유류 청각 머리 세포 스테레오실리아 번들의 나노급 고해상도 비접촉 영상화 방법을. 이 기술은 세포 손상 없이 동적 초미세구조 변화를 연구할 수 있습니다.

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프로젝트의 모든 단계에서 장기적인 지원과 조언을 해주신 유리 코르체프 교수(영국 임페리얼 칼리지)에게 감사드립니다. 또한 파벨 노박 박사와 앤드류 셰브추크 박사(영국 임페리얼 칼리지)와 올렉 벨로프(러시아 국립청각연구센터)에게 소프트웨어 개발에 도움을 준 것에 대해 감사드립니다. 이 연구는 NIDCD/NIH(R01 DC008861 및 R01 DC014658에서 G.I.F.까지)에 의해 지원되었습니다.

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<li>Engström, H., Engström, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+hairs+on+cochlear+sensory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+research%22%5BJournal%5D)">Structure of the hairs on cochlear sensory cells.</a> Hearing research. 1 (1), 49-66 (1978).</li>
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<li>Furness, D. N., Hackney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-links+between+stereocilia+in+the+guinea+pig+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Cross-links between stereocilia in the guinea pig cochlea.</a> Hearing Research. 18 (2), 177-188 (1985).</li>
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<li>Kachar, B., Parakkal, M., Kurc, M., Zhao, Y., Gillespie, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+structure+of+hair-cell+tip+links%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-resolution structure of hair-cell tip links.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 13336-13341 (2000).</li>
<li>Vélez-Ortega, A. C., Freeman, M. J., Indzhykulian, A. A., Grossheim, J. M., Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+current+is+essential+for+stability+of+the+transducing+stereocilia+in+mammalian+auditory+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction current is essential for stability of the transducing stereocilia in mammalian auditory hair cells.</a> eLife. 6, 1-22 (2017).</li>
<li>Ivanchenko, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+scanning+electron+microscopy+of+anti-PKHD1L1+immuno-gold+labeled+mouse+hair+cell+stereocilia+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">Serial scanning electron microscopy of anti-PKHD1L1 immuno-gold labeled mouse hair cell stereocilia bundles.</a> Scientific Data. 7 (1), 182(2020).</li>
<li>Hadi, S., Alexander, A. J., Vélez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin-XVa+controls+both+staircase+architecture+and+diameter+gradation+of+stereocilia+rows+in+the+auditory+hair+cell+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Association+for+Research+in+Otolaryngology+JARO%22%5BJournal%5D)">Myosin-XVa controls both staircase architecture and diameter gradation of stereocilia rows in the auditory hair cell bundles.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology JARO. 21 (2), 121-135 (2020).</li>
<li>Metlagel, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryo-tomography+of+vestibular+hair-cell+stereocilia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Electron cryo-tomography of vestibular hair-cell stereocilia.</a> Journal of Structural Biology. 206 (2), 149-155 (2019).</li>
<li>Langer, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stimulation+of+individual+stereocilia+of+living+cochlear+hair+cells+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Mechanical stimulation of individual stereocilia of living cochlear hair cells by atomic force microscopy.</a> Ultramicroscopy. 82 (1-4), 269-278 (2000).</li>
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<li>Putman, C. A., van der Werf, K. O., de Grooth, B. G., van Hulst, N. F., Greve, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelasticity+of+living+cells+allows+high+resolution+imaging+by+tapping+mode+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Viscoelasticity of living cells allows high resolution imaging by tapping mode atomic force microscopy.</a> Biophysical journal. 67 (4), 1749-1753 (1994).</li>
<li>Gavara, N., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncontact+microrheology+at+acoustic+frequencies+using+frequency-modulated+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Noncontact microrheology at acoustic frequencies using frequency-modulated atomic force microscopy.</a> Nature Methods. 7 (8), 650-654 (2010).</li>
<li>Cartagena-Rivera, A. X., Van Itallie, C. M., Anderson, J. M., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+surface+supracellular+mechanical+properties+in+polarized+epithelium+using+noninvasive+acoustic+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Apical surface supracellular mechanical properties in polarized epithelium using noninvasive acoustic force spectroscopy.</a> Nature Communications. 8 (1), 1030(2017).</li>
<li>Katsuno, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRIOBP-5+sculpts+stereocilia+rootlets+and+stiffens+supporting+cells+enabling+hearing%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">TRIOBP-5 sculpts stereocilia rootlets and stiffens supporting cells enabling hearing.</a> JCI Insight. 4 (12), (2019).</li>
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<li>Frolenkov, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-channel+recordings+from+the+apical+surface+of+outer+hair+cells+with+a+scanning+ion+conductance+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Association+for+Research+in+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Single-channel recordings from the apical surface of outer hair cells with a scanning ion conductance probe.</a> Association for Research in Otolaryngology. Abs. 444, (2004).</li>
<li>Sánchez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncontact+measurement+of+the+local+mechanical+properties+of+living+cells+using+pressure+applied+via+a+pipette%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Noncontact measurement of the local mechanical properties of living cells using pressure applied via a pipette.</a> Biophysical Journal. 95 (6), 3017-3027 (2008).</li>
<li>Korchev, Y. E., Negulyaev, Y. A., Edwards, C. R., Vodyanoy, I., Lab, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+localization+of+single+active+ion+channels+on+the+surface+of+a+living+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional localization of single active ion channels on the surface of a living cell.</a> Nature Cell Biology. 2 (9), 616-619 (2000).</li>
<li>Shevchuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angular+approach+scanning+ion+conductance+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Angular approach scanning ion conductance microscopy.</a> Biophysical Journal. 110 (10), 2252-2265 (2016).</li>
<li>Furness, D. N., Katori, Y., Nirmal Kumar, B., Hackney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dimensions+and+structural+attachments+of+tip+links+in+mammalian+cochlear+hair+cells+and+the+effects+of+exposure+to+different+levels+of+extracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The dimensions and structural attachments of tip links in mammalian cochlear hair cells and the effects of exposure to different levels of extracellular calcium.</a> Neuroscience. 154 (1), 10-21 (2008).</li>
</ol>

저자는 경쟁적인 이해관계가 없습니다.

성공적인 HPICM 이미지를 얻으려면 사용자는 낮은 소음과 낮은 진동 시스템을 구축하고 적절한 파이펫을 제조해야합니다. 우리는 강력하게 어떤 라이브 세포 이미징을 수행하기 전에 시스템의 안정성을 테스트하기 위해 AFM 교정 표준의 사용을 권장합니다. 시스템의 해상도가 테스트되면 사용자는 라이브 셀 이미징을 시도하기 전에 이미징 설정에 익숙해지기 위해 Corti 샘플의 고정 기관을 이미징하는 것을 고려할 수 있습니다.
이미징을 위한 최적의 설정점은 팁의 개별 모양(전자 현미경 검사에 의해 검사될 때까지 알려지지 않음)과 팁에 부착된 먼지의 양에 따라 다른 파이펫마다 다양하며, 이는 예측할 수 없습니다. 최적의 설정점을 0.7% 이상 인 나노피펫은 폐기해야 합니다.
살아있는 세포의 화상 진찰 도중, 세포외 용액에 있는 먼지그리고 파편의 양은 시간이 지남에 따라 증가합니다. 이러한 모든 입자는 파이펫 의 끝에서 끝날 수 있습니다, 전류...

청각 모발 세포내 의 스테레오실리아가 광학 현미경 검사법에 의해 시각화되고 패치 클램프 실험에서 살아있는 세포에서 편향될 정도로 크다는 사실에도 불구하고 팁 링크와 같은 트랜스듀션 기계의 필수 구조 성분은 죽은 세포에서전자 현미경으로만 이미지화될 수 있다. 포유류 청각 모발 세포에서, 트랜스듀션 기계는 팁 링크의 하부 에 위치하고, 즉, 짧은 행 스테레오실리아1의 끝에서 스테레오실리아2의끝에서 신호를 통해 국소적으로조절된다 2,3. 그러나, 살아있는 머리 세포에 있는 이 위치에 있는 표면 구조물의 레이블 없는 화상 진찰은 입체증의 작은 크기 때문에 가능하지 않습니다.
포유류 달팽이관에는 두 가지 유형의 청각 감각 세포가 있습니다: 내부 및 외부 모발 세포. 내부 모발 세포에서, 스테레오실리아는 외발성 세포4에비해 더 길고 두껍다. 스테레오실리아의 첫 번째 및 두 번째 행은 마우스 또는 쥐 내부 모발 세포에서 300-500 nm의 직경을 갖는다. 빛의 회절로 인해 라벨이 없는 광학 현미경으로 달성할 수 있는 최대 해상도는 약 200nm입니다. 따라서, 내부 헤어 셀 번들의 제1 및 두 번째 행 내에서 개별 입체의 시각화는 광학 현미경으로 비교적 쉽습니다. 대조적으로, 내부 모발 세포및 외부 모발 세포의 모든 스테레오실리아의 짧은 행 스테레오실리는 직경이 100-200 nm이며 광학 현미경5로시각화할 수 없다. 최근 초분해능 이미징의 진전에도 불구하고, 이러한 근본적인 한계는 광학 라벨없는 이미징에서 지속됩니다. 현재 시판되는 모든 슈퍼 분해능 기술은 일종의 형광 분자6이필요하며, 이는 응용 프로그램을 제한합니다. 특정 형광 태그 분자에 대한 필요성에 의한 제한 외에도, 강렬한 빛 조사에 노출세포 손상을 유도하고 세포 과정에 영향을 미칠 수 있는 것으로 나타났으며, 이는 살아있는 세포를 연구할 때 큰 단점이다7.
모발 세포 입체 번들의 초구조적 세부 사항에 대한 현재의 지식은 주로 전자 현미경 검사법(SEM), 전염 전자 현미경 검사법(TEM), 동결 골절 EM 과 같은 다양한 전자 현미경 검사법(EM) 기술로 주로 수득되었으며, 최근에는 이온 빔 또는 냉동-EM 단층 촬영8,9,10, 10, 10, 10, 10, 10,10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 12, 10, 10, 10, 12, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10,12 14,15,16. 불행히도, 이러한 모든 EM 기술은 시료의 화학적 또는 극저온을 필요로 합니다. 현상의 시간 규모에 따라,이 요구 사항은 불가능하거나 매우 노동 집약적 인 스테레오실리의 끝에서 동적 프로세스의 연구를합니다.
원자력 현미경검사(AFM)17,18을가진 살아있는 모발 세포의 모발 번들을 이미지하기 위한 제한된 노력이 이루어지고 있다. AFM은 생리적 용액에서 작동하기 때문에 이론적으로 시간이 지남에 따라 살아있는 모발 세포의 스테레오실리아 번들에 동적 변화를 시각화 할 수 있습니다. 문제는 AFM 프로브와 샘플 사이의 특정 물리적 접촉을 의미하는 고해상도 AFM의 원칙에 있습니다, 심지어 가장 손상 "도청"모드(19). AFM 프로브가 스테레오실륨을 마주하면 일반적으로 충돌하여 머리카락 번들의 구조를 손상시니다. 그 결과, 이 기술은 라이브, 또는 고정된 모발 세포 번들17,18을시각화하는 데 적합하지 않다. 상기 문제점은시료(20)의표면에 유체역학력만을 부과하는 대형 볼 모양의 AFM 프로브를 이용하여 부분적으로 완화될 수 있다. 그러나, 이러한 프로브가샘플(21)의기계적 특성을 테스트하는 데 이상적으로 적합하지만,Corti(22)의 장기를 이미징할 때 서브 마이크로미터 해상도만 제공하며 여전히 고감도 스테레오실리아 번들에 대해 상당한 힘을 샘플에 적용한다.
스캐닝 이온 전도성 현미경검사(SICM)는 전도성용액(23)으로채워진 유리 파이펫 프로브를 사용하는 스캔 프로브 현미경 검사법의 버전이다. SICM은 파이펫이 전지와 파이펫을 통해 전류에 접근할 때 표면을 감지합니다. 이것은 세포를 접촉하기 전에 잘 일어나기 때문에, SICM은 생리적용액(24)에서살아있는 세포의 비접촉 화상 진찰에 이상적입니다. SICM의 가장 좋은 해상도는 살아있는세포(25)의혈장 막에서 개별 단백질 복합체를 해결할 수 있는 단일 나노미터의 순서에 있다. 그러나 다른 스캐닝 프로브 기술과 마찬가지로 SICM은 비교적 평평한 표면만 이미지할 수 있습니다. 우리는 나노 파이펫이 각 이미징 지점에서 샘플에 접근하는 호핑 프로브 이온 전도성 현미경 (HPICM)(26)를발명하여 이러한 한계를 극복(도 1A). HPICM을 사용하여 나노 스케일 해상도27을사용하여 살아있는 청각 모발 세포에서 입체 번들을 이미지 할 수 있었습니다.
이 기술의 또 다른 근본적인 장점은 HPICM이 이미징 도구일 뿐만 아니라는 것입니다. 다른 스캐닝 프로브 기술과는 달리, HPICM/SICM 프로브는 다양한 자극의 전기 기록 및 국소 전달을 위해 세포 생리학에 널리 사용되는 전극이다. 이온 채널 활동은 일반적으로 HPICM 프로브를 통해 전체 전류가 가장 큰 이온채널(25)에의해 생성된 세포외 전류보다 여러 배 더 큰 크기이기 때문에 HPICM 이미징을 방해하지 않는다. 그러나, HPICM은 이구조(28)로부터관심 구조와 후속 단일 채널 패치 클램프 레코딩을 통해 나노피펫의 정확한 포지셔닝을 허용한다. 이것은 우리가 외발 모발 세포스테레오실리아(29)의끝에서 단일 채널 활동의 첫 번째 예비 기록을 획득한 방법입니다. 나노 피펫을 통해 큰 전류조차도 세포 외 배지의 거대한 전기 션트로 인해 플라즈마 멤브레인 전반에 걸쳐 잠재력의 중요한 변화를 생성 할 수 없다는 것을 언급 할 가치가 있다. 그러나, 개별 이온 채널은 나노피펫(30)을 통해 액체의 흐름에 의해 기계적으로 활성화될 수 있거나, 또는작용제(31)의국소 적용에 의해 화학적으로 활성화될 수 있다.
HPICM에서, 상기 이미지는 나노피펫이 한 지점에서 시료에 순차적으로 접근할 때 생성되고, 후퇴한 다음, 측면 방향으로 이동하여접근법(도 1A)을반복한다. 패치 클램프 증폭기는 파이펫(도1B)의AgCl 와이어에 전압을 지속적으로 적용하여 목욕 용액에서 ~1nA의 전류를 생성한다. 피펫이 셀의 표면에서 떨어져 있을 때 이 전류의 값은 참조 전류로 결정된다(I참조, 도 1C). 이어서, 파이펫은 Z 축에서 이동하여 전류가 사용자에 의해 미리 정의된 양(setpoint)에 의해 감소될 때까지 샘플에 접근한다( 보통 0.2%-1%의 I심판(도 1C,상단 추적). 그런 다음 이 이미징 점의 X 및 Y 좌표와 함께 이 시점에서 Z 값을 샘플높이로 저장합니다. 이어서, 파이펫은 사용자가 정의한 속도로표면(도 1C,하부 추적)에서 멀리 후퇴하며, 보통 700-900 nm/ms. 후퇴 후, 파이펫(또는, 당사의 경우, 샘플-도 1B참조)는 다음 이미징 지점으로 측면으로 이동되고, 새로운 기준 전류 값이 얻어지고, 파이펫이 다시 한 번 샘플에 접근하여 과정을 반복한다. 파이펫의 X-Y 운동은 전형적으로 모발 세포 메카노트랜스유도 전류의 기록에 사용되는 직립 현미경 설정에서 선호된다. 이 설정에서 HPICM 프로브는 상단이 아니라 각도32에서헤어 셀 번들에 접근합니다. 그러나, HPICM 이미징의 최상의 해상도는 반전된 현미경설정(도 1A,B)에서달성되며, 여기서 X-Y 방향으로 샘플의 움직임이 나노피펫의 Z-이동으로부터 분리되어 잠재적인 기계적 유물을 제거한다.
HPICM을 사용하여 마우스와 쥐 내부 및 외발 모발 세포 스테레오실리아 번들의 지형 영상을 입수하고, 지름26,27에서약 5nm인 스테레오실리사이의 링크를 시각화하였다. 이 기술로 모발 세포 번들 이미징의 성공은 여러 가지 요인에 의존합니다. 첫째, 나노피펫 전류의 노이즈(분산)는 HPICM 이미징에 대해 가능한 가장 낮은 설정점을 허용하기 위해 가능한 한 작아야 한다. 낮은 설정점을 사용하면 HPICM 프로브가 더 먼 거리와 프로브 접근법에 대한 모든 각도에서 스테레오시리아 표면을 "감지"할 수 있으며 놀랍게도 HPICM 이미징의 X-Y 해상도를 향상시킵니다(토론 참조). 둘째, 이미징 유물에 직접 기여하기 때문에 시스템의 진동과 드리프트를 10nm 미만으로 감소시켜야 합니다. 마지막으로, HPICM 프로브와 시편 스테이지가 단일 나노미터 이하의 정확도를 갖는 보정된 피드백 제어 압압 액추에이터에 의해 Z 및 X-Y 축으로 이동하더라도 나노피펫 팁의 직경은 전류(감지 부피)의 확산을 결정하고 따라서해상도(그림 1A). 따라서, 살아있는 헤어 세포를 이미징하기 전에, 적절한 파이펫을 당기고, 교정 샘플로 원하는 해상도에 도달하고, 기록 시스템에서 낮은 잡음을 달성하는 것이 중요합니다.
적어도 수십 년 동안, SICM 기술은 상용화되지 않았으며 영국 제국 대학의 Korchev 교수의 선도적 인 실험실과 함께 세계에서 몇 실험실만 개발하고 있습니다. 최근에는 여러 SICM 시스템이 상용화되었습니다(재료 표참조), 이 모든 시스템은 원래 HPICM 원칙을 기반으로 합니다. 그러나, 헤어 셀에서 이미징 스테레오실리아 번들 은 폐쇄된 "즉시 이동" 시스템에서 기술적으로 도전적이거나 불가능한 몇 가지 사용자 지정 수정이 필요합니다. 따라서 일부 구성 요소 통합이 필요합니다. HPICM 설정은 보다 엄격한 진동 및 드리프트 요구 사항과 HPICM 프로브및샘플(그림 1D)의압조 구동 이동을 갖춘 패치 클램프 리그를 나타내기 때문에 패치 클램핑에 능숙한 모든 연구원에게 이러한 통합이 비교적 쉽습니다. 그러나 적절한 배경이없는 과학자는 전기 생리학에 대한 교육이 먼저 필요합니다. 이미징 속도 증가와 같은 남은 과제에도 불구하고(토론참조), 우리는 나노 스케일 해상도로 살아있는 모발 세포에서 스테레오실리아 번들을 손상시키지 않고 이미지화할 수 있었습니다.
이 논문은 우리의 사용자 정의 시스템을 사용하여 젊은 산후 쥐 또는 마우스 달팽이관 이출에 있는 살아있는 청각 머리 세포 번들의 성공적인 HPICM 화상 진찰을 능력을 발휘하기 위하여 상세한 프로토콜을 제시합니다. 통합 된 구성 요소는 재료표에나열됩니다. 이 논문은 또한 발생할 수 있는 일반적인 문제와 문제를 해결하는 방법에 대해서도 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>아날로그 오실로스코프</td><td>B& 나</td><td>노 피펫 전류 및 Z축 접근 방식의 실시간 모니터링을 위한</td>K Precision <td>2160C</td> 아날로그 오실로스코프</tr><tr><td>AFM 교정 표준</td><td>TED PELLA Inc</td><td>HS-100MG; HS-20MG</td><td>이 100 및 20nm 교정 표준은 HPICM 시스템</td></tr><tr><td>벤치탑 진동 절연체,</td><td>AMETEK/TMC</td>, <td>Everstill K-400</td>, <td>활성 진동 절연</td></tr><tr><td>붕규산 유리 모세관,</td><td>World Precision Instruments(WPI)</td><td>1B100F-4</td>, <td>나노피펫용 붕규산 유리 모세관,</td></tr><tr><td>D-(+)-포도</td>당, <td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>의 성능을 테스트하는 데 사용됩니다.삼투압 디</td></tr><tr><td>지타이저</td><td>National Instruments Corporation</td><td>PCI-6221</td><td>다중 채널 입력/출력 디지타이저</td></tr><tr><td>Z 이동을 위한 고속 아날로그 비례-적분-미분(PID) 제어</td><td>Standford Research Systems</td><td>SIM900, SIM960, SIM980</td><td>Z 이동을 위한 외부 PID 컨트롤러에 통합된 계측 모듈. 일반적으로 상용 피에조 증폭기에서 구현되지 않는 빠른 응답이 필요합니다.</td></tr><tr><td>패러데이 케이지</td><td>AMETEK/TMC</td><td>Type II</td><td>전자기 간섭을 차폐하는 데 필요</td></tr><tr><td>유리 바닥 접시</td><td>WPI(World Precision Instruments)</td><td>FD5040-100</td><td>조직의 챔버용 접시로 사용</td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution(HBSS)</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>14025092</td><td>세포외(수조) 용액</td></tr><tr><td>계측 증폭기</td><td>Brownlee Precision</td><td>Model 440</td><td>계측 증폭기는 필요한 오프셋, 필터링 및 2차 배율 또는 감쇠를 제공합니다</td></tr><tr>.나노 피펫을 제작하기 위한<td>레이저 기반 마이크로피펫 풀러</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-2000/G</td><td>마이크로피펫 풀러. 날카로운 석영 피펫에는 레이저가 필요합니다.</td></tr><tr><td>Lebovitz의 L-15, 페놀 레드</td><td>없음 Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>21083027</td><td>세포외(수조) 솔루션</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Scientifica PatchStar</td><td></td><td>Z 피에조 액추에이터의 "코스" 포지셔닝에 사용</td></tr><tr><td>현미경</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td>도립 광학 현미경</td></tr><tr><td>패치 증폭기</td><td>Molecular Devices</td><td>Axopatch 200B</td><td>패치 클램프 증폭기는 나노 피펫</td></tr><tr><td>피에조 증폭기 (XY 축)</td> <td>Physik Instrumente (PI)</td> <td>E-500.00, E-505.00, E-509를 통해 전류를 측정합니다. </td><td>XY 피에조 변환 단계를 위한 C2A 증폭 및 PID 제어</td></tr><tr><td>피에조 증폭기 (Z 축)</td><td>피에조 시스템 jena</td><td>ENT 400 & 800</td><td>사용자 정의 앰프는 ENT 400 전원 공급 장치와 두 개의 ENT 800 증폭기를 병렬로 연결하여 최대 전류 1.6 nA를 달성합니다</td></tr><tr><td>. 플라스틱 커버슬립</td><td>TED PELLA Inc</td><td>26028</td><td>조직용 챔버 제작에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>SICM 컨트롤러 및 소프트웨어*</td><td>Ionscope, UK (ionscope.com)</td><td>N/A</td><td>Innovative Integration Ltd의 SBC6711 디지털 신호 처리 보드를 기반으로 한 맞춤형 컨트롤러</td></tr><tr><td>실리콘 엘라스토머(Sylgard)</td><td>World Precision Instruments(WPI)</td><td>SYLG184</td> 조직 실리콘 접착제<td>의 챔버에 유연한 유리 섬유를 부착하는 데 사용</td></tr><tr><td>The</td><td>Dow Chemical Company</td><td>734</td><td>조직 용 챔버의 다른 부분을 접착하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>텅스텐 막대</td><td>A-M Systems</td><td>717500</td> 조직 XY 피에조 나노 포지셔너 Physik Instrumente (PI) P-733.2DD XY 변환 단계 용량 성 센서가있는 챔버의 치<td>실 가닥을 고정하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr>. Z <tr><td>피에조 나노 포지셔너</td><td>피에조 시스템 예나</td><td>RA 12/24 SG</td><td>스트레인 게이지 센서가 있는 링 피에조 액추에이터</td></tr><tr><td>*Ionscope는 더 이상 별도의 SICM 컨트롤러를 판매하지 않습니다. 다른 상용 시스템은 거의 없습니다. NX12-Bio 및 NX10 SICM,&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Park Systems, 한국 및 영국 ICAPPIC Limited의 SICM 모듈(icappic.com). 이 모든 시스템은 원본을 기반으로 합니다&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPICM 원칙. 그러나, 유모 세포에서 입체섬모 다발을 이미징하는 것은 기술적으로 다음과 같은 몇 가지 맞춤형 수정을 필요로 합니다.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>닫힌 곳에서 도전적인(또는 심지어 불가능한) " 바로 사용할 수 있습니다." Ionscope 또는 NX12-Bio/NX10과 같은 시스템. 현재는 하나뿐입니다&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>모든 SICM/HPICM 실험에 적합할 수 있는 유연성을 제공하지만 일부 구성 요소 통합이 필요한 모듈식 시스템(ICAPPIC)입니다.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

살아있는 포유류 청각 머리 세포에 있는 나노 규모 해상도를 가진 스테레오실리모들 화상 진찰

Stereocilia Bundle Imaging with Nanoscale Resolution in Live Mammalian Auditory Hair Cells

내이 헤어 셀은 소리 유발 변위를 감지하고 높이가 증가하는 행으로 배열되는 스테레오실리아로 구성된 헤어 번들에서 이러한 자극을 전기 신호로 변환합니다. 스테레오실리아가 편향되면 작은(직경5nm)에 예인선이 교차하는 스테레오시리아를 연결하여 메카노감과감성 트랜스듀션 채널에 힘을 전달합니다. 메카노트랜스덕션은 수십 년 동안 살아있는 모발 세포에서 연구되었지만, 스테레오실리아 의 끝에서 메카노트랜스덕션 기계의 기능적으로 중요한 초구조적 세부 사항(예: 팁 링크 역학 또는 트랜스듀션 의존성 입체 리모델링)은 여전히 전자 현미경 검사를 받은 죽은 세포에서만 연구될 수 있다. 이론적으로, 원자력 현미경 검사법과 같은 스캐닝 프로브 기술은 스테레오실리아의 표면을 시각화하기에 충분한 해상도를 갖습니다. 그러나, 이미징 모드와는 별개로, 스테레오실리와 함께 원자력 현미경 프로브의 사소한 접촉조차도 일반적으로 번들을 손상시합니다. 여기서 우리는 살아있는 설치류 청각 모발 세포의 호핑 프로브 이온 전도성 현미경 검사법 (HPICM) 화상 진찰에 대한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 이 비접촉 스캐닝 프로브 기술은 모발 세포와 같은 복잡한 지형을 가진 살아있는 세포의 표면의 시간 경과 이미징을 단일 나노미터 해상도로 샘플과 물리적접촉을 하지 않고도 할 수 있습니다. HPICM은 유리 나노피펫을 통과하는 전류를 사용하여 파이펫 가까이에서 셀 표면을 감지하고 3D 포지셔닝 압전 시스템은 표면을 스캔하고 이미지를 생성합니다. HPICM을 사용하면 눈에 띄는 손상없이 몇 시간 동안 살아있는 청각 헤어 셀에서 스테레오실리아를 상호 연결하는 스테레오실리와 연결 된 링크를 이미지 할 수있었습니다. 우리는 HPICM의 사용이 그들의 기능을 더 잘 이해하기 위해 살아있는 머리 세포의 스테레오실리에 있는 초구조적인 변경의 직접적인 탐구를 허용할 것으로 예상합니다.

이 논문에 제시된 프로토콜은 복잡한 지형을 가진 살아있는 세포를 시각화하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 단계에 따라, 우리는 일상적으로 살아있는 쥐 청각 머리 세포 번들의 이미지를 얻을 수 있습니다(그림 6B,D). SEM 이미지와 비교할 때 X-Y 해상도가 낮음에도 불구하고, 우리의 HPICM 이미지는 입체화의 다른 행, 스테레오실리아 팁의 모양, 심지어 인접한 스테레오실리아(도 6F)를연결하는 작은 링크 (직경 5 nm)를 성공적으로 해결할 수 있습니다. 또한 HPICM 이미지는 SEM 이미지가 부족하다는 정보를 3D로 가지고 있습니다. 이러한 유형의 이미징 기술의 비접촉 특성을 감안할 때, 우리는 또한 번들 응집력을 손상시키지 않고 몇 시간 동안 동일한 헤어 셀 번들의 연속 타임랩스 HPICM 이미징(예: 5-6 h)을 수행할 수있었다(도 7).<...

여기서 우리는 호핑 프로브 이온 전도 현미경 검사법 (HPICM)에 대한 프로토콜을 제시, 라이브 청각 헤어 셀에서 스테레오실리의 나노 스케일 이미징을 허용하는 비 접촉 스캐닝 프로브 기술.

Inner ear hair cells detect sound-induced displacements and transduce these stimuli into electrical signals in a hair bundle that consists of stereocilia ...

이 실용적인 우리가 헤어 셀 스테레오실리의 표면에 기계 전기 변환 기계의 나노 구조 구성 요소의 동적 변화를 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단일 나노미터 해상도에서 복잡한 지형을 가진 살아있는 세포의 표면의 시간 경과 이미징이며 시료와 물리적 접촉을하지 않고. 이 기술은 거의 모든 살아있는 세포에 적용될 수 있습니다.우리는 이전에 바이러스에 감염된 폐 상피 세포주 표면을 일치, 근육 세포, 곧 내 이미지 박테리아에서. 각 이미징 세션의 시작 부분에서 나노 피펫을 테스트합니다. 나노피펫을 제작한 후, 거품을 확인하고, 거품을 제거하고, 나노피펫을 호핑 프로브 에 장착하여 이온 전도도 현미경 피펫 홀더에 장착한다.챔버에 목욕 용액의 4 밀리리터에서 HPICM 단계에 챔버를 배치합니다. 접지 전극을 목욕 용액에 도입하고 패치 클램프 증폭기를 통해 파이펫에 적용되는 전압이 0인지 확인합니다. 마이크로 조작기를 수직 위치에 놓은 후 액체에 닿을 때까지 Z의 파이펫을 이동하고 증폭기를 0으로 설정한 후 100밀리볼트를 추가하여 파이펫 전류를 확인합니다.실리콘 접착제를 사용하여 AFM 교정 표준을 챔버에 부착하고 4 밀리리터의 HBSS로 샘플을 덮습니다. 양면 테이프를 사용하여 HPICM 설정의 X Y 단계에 챔버를 고정하고 입증된 대로 새 나노피펫을 홀더에 로드합니다. 나노피펫 저항성 및 직경을 테스트한 후 전류를 1나노 앰프로 설정합니다.거친 패치 클램프 조작기를 사용하여 나노파이펫을 교정 표준의 중앙 위에 위치시키고 세트점을 늘리면서 Z 압전액액터의 센서로부터 실시간으로 신호를 모니터링한다. 안정적인 반복 가능한 Z 접근 주기를 설정한 후, 세트점을 불안정 지점 바로 바로 위에 있는 값으로 줄이고 피펫을 초당 약 5미크론의 속도로 아래로 이동하여 시료에 도달할 때까지 한다. 실시간 Z 위치 신호의 바닥 수준이 증가하여 샘플 표면을 감지하여 나노피펫이 철회되었음을 나타냅니다.AFM 표준에 고르지 않은 장착으로 인해 관심 영역의 가장 높은 지점은 알 수 없습니다. 따라서 파이펫 후퇴의 진폭을 적어도 200 내지 500 나노미터로 설정한다. Z 압압 액추에이터 운동의 상한을 초과하지 않도록주의, 낮은 해상도에서 이미징을 시작합니다.이미징 영역에서 샘플의 가장 높은 지점이 확인되면, 새로운 X Y 위치로 이동하기 전에 샘플과의 원치 않는 충돌을 방지하기 위해 Z 축을 따라 약 200 미크론홉 진폭을 감소시키고 파이펫을 철회한다. 관심 영역이 위치했을 때 더 높은 해상도로 이미징을 시작합니다. 청각 헤어 셀 이미징의 경우 치과 치실 또는 유연한 유리 파이펫을 사용하여 코르티의 갓 분리 된 장기를 챔버에 단단히 고정하십시오.양면 테이프를 사용하여 X Y 압전 스테이지에 챔버를 단단히 고정하고 입증된 대로 새로운 나노피펫을 홀더에 로드합니다. 나노피펫 저항성을 확인한 후, 패치 클램프 마이크로 조작기를 사용하여 코티 X 식물의 장기를 반전된 현미경으로 관찰하면서 모발 세포 부위 위에 나노피펫을 배치한다. 기록, 오실로스코프상의 실시간 전류 및 Z 위치 신호는 시스템이 0.5%6or 이하의 세트 포인트로 안정적인지 확인하고, 입증된 바와 같이 최적의 설정점을 결정하고 시료에 접근한다.적어도 6~8미크론의 홉 진폭을 사용하여 입증된 바와 같이 시료의 저해상도 이미징을 수행한다. 나노 피펫이 새로운 X Y 위치로 이동해야하는 경우, 조직 내의 키가 큰 특징과의 충돌을 피하기 위해 약 500 나노미터의 파이펫을 철회하고 모발 세포가 있는 관심 영역까지 저해상도 HPICM 이미징을 반복하십시오. 그런 다음 관심 영역을 15분 이내에 더 높은 해상도로 이미지화합니다.HPICM 프로토콜은 살아있는 쥐 청각 머리 세포 번들과 같은 복잡한 지형을 가진 모든 살아있는 세포를 시각화하는 데 사용될 수 있습니다. HPICM 이미지는 전자 현미경 이미지를 스캔하는 것에 비해 X Y 해상도가 낮지만 다양한 입체 계열을 성공적으로 해결할 수 있습니다. 스테레오실리아 팁의 모양과 인접한 스테레오실리아를 연결하는 작은 5 나노미터 링크.HPICM 이미징의 비접촉 특성을 감안할 때, 동일한 모발 세포 번들의 연속 타임랩스 이미징은 번들 응집력을 손상시키지 않고 몇 시간 동안 수행될 수 있다. 설정점이 매우 낮을 수록 시스템은 전류의 작은 변동을 셀 표면을 발생시키는 것으로 해석하여 이미지에서 백색 도트 노이즈로 이어질 수 있습니다. 마찬가지로, 큰 홉 진폭은 파이펫의 측면 공명을 증가시킬 수 있으며, 이로 인해 시끄러운 픽셀이 생성될 수도 있습니다.대조적으로, 홉 진폭이 너무 작거나 설정점이 너무 높으면 나노피펫이 샘플과 충돌하여 이미징 아티팩트 또는 모발 번들 손상이 발생할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때 기억해야 할 가장 중요한 것은 살아있는 세포로 작업할 때 모발 세포 번들 당 15분 미만을 지출하는 것입니다. 헤어 번들의 이미지를 얻은 후, 하나는 메카노 트랜스듀션 채널 속성에 대한 질문에 대답하기 위해 스테레오실리아의 표면에 특정 위치에서 단일 채널 녹음을 얻으려고 시도 할 수 있습니다.

stereocilia-bundle-imaging-with-nanoscale-resolution-live-mammalian

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

포유류의 달팽이관에있는 내부 헤어 셀 리본 버렸네에서 청각 신경 섬유 dendrites에서 전체 세포 패치 - 클램프 녹음.

달팽이 내부 세포에 문의 수입 성의 Dendrites에서 Postsynaptic 레코딩 : 리본 시냅스에서 모니터링 Multivesicular 릴리스

electromotility, 슬로우 운동성 및 굽힘을 포함한 외부 머리카락 세포 (OHC) 운동성이있는 응답을, 조사를 위해 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다. OHC의 운동성는 외부 교류 전기장과 자극에 의​​해 elicited 및 방법은 고속 영상 녹화, LED 기반의 조명, 그리고 마지막 세대 이미지 분석 소프트웨어를 활용합니다.

외부 교류 전기 필드 자극 및 고속 이미지 분석의 조합 아웃터 헤어 셀 운동성를 조사

출처: Lukasz, D., et al. 유충 제브라피쉬의 측면 선 유모 세포의 생체 내 칼슘 이미징. J. Vis. 경험. (2018년)이 비디오는 공초점 현미경을 사용하여 마비된 형질전환 제브라피쉬 유충의 측면 선 유모 세포에서 칼슘 유입의 실시간 이미징을 보여줍니다. 유체 펄스를 통한 모발 다발의 기계적 자극은 기계적 전달 채널과 전압 개폐 채널을 통해 칼슘 유입을 유도하며, 이는 형광 지시약을 사용하여 실시간으로 시각화됩니다. 이 방법은 신경비만 유모 세포의 정점 및 기저 칼슘 역학을 강조하여 물 이동 감지에서의 역할을 밝힙니다.

유충 제브라피쉬의 측면 선 유모 세포에서 칼슘 역학 이미징

일차 섬모는 다양한 신호 경로에 영향을 미칩니다. 포유류 달팽이관은 평면 세포 극성(PCP) 신호 전달을 검사하는 데 이상적입니다. 섬모 기능 장애는 달팽이관 성장, 세포 패터닝 및 유모 세포 방향, PCP 판독에 영향을 미칩니다. 우리의 목표는 표현형 분석, 면역조직화학 및 주사 전자 현미경을 통해 마우스 달팽이관의 PCP 신호 전달을 분석하는 것입니다.

Ciliopathy 마우스 돌연변이 달팽이관의 평면 셀 극성 표현형의 평가

미국 황소 개구리의 (모이 catesbeiana) sacculus 머리 세포 생리학의 직접 검사를 허용합니다. 여기에 해부 및 생물 물리학 연구의 황소 개구리의 sacculus의 준비를 설명한다. 우리는 자발적인 운동의 번들의 힘 - 변위 관계의 계산과 측정을 포함하여이 유모 세포에서 대표적인 실험을 보여줍니다.

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신생아 마우스의 일차 달팽이관 유모 세포의 분리 및 배양

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