Name: 클릭 화학을 이용한 지방 아실화 단백질의 검출을 위한 알키닐 지방산 유사체의 최적화된 혼입 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: 학습하세요 클릭 화학을 이용한 지방 아실화 단백질 검출 방법을 HEK-293T 세포에서. 비독성 BSA 복합체를 활용한 알키닐 지방산 유사체 혼입으로 긴 사슬 지방산의 검출 효율과 민감도를 크게 향상시킵니다.

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이 연구는 국가 과학 및 공학 연구위원회 (NSERC; RGPIN-2019-04617). Lucia Liao는 워털루 대학의 생물학과를 통해 Ram and Lekha Tumkur Memorial Scholarship과 IODE Ontario를 통한 Lucy Morrison Memorial Bursary의 자금 지원을 받았으며 워털루 대학교의 대학원 연구 기금 외에도 대학원 연구 학생 (50503-11072), 과학 대학원 상 및 대학원 조교로 구성됩니다. 저자들은 마틴 연구소의 모든 구성원들이이 원고를 준비하는 데 도움을 준 것에 대해 감사 드리며, 특히 스테파니 라이올, 할린 길 (Harleen Gill), 사디아 칸 (Sadia Khan)은 이러한 연구를 준비하기 위해 마틴 연구소를 처음 설립하는 데 도움을주었습니다. 저자들은 또한 ctHTT-GFP 구조물의 친절한 선물에 대해 Luc Berthiaume 박사와 원고 준비에 중요한 의견을 주신 Shaun Sanders 박사에게 감사하고 싶습니다. 그림 3은 BioRender.com 로 작성되었습니다.

1. 세포 배양
<ol><li>세포 배양을 위해 DMEM(둘베코 변형 이글 배지)을 보충하려면 10% 태아 소 혈청(FBS), 1x 페니실린-스트렙토마이신, 2mM L-글루타민 및 100mM 소듐 피루베이트(1% vol/vol)를 추가합니다.</li>
	<li>6-웰 조직 배양 접시의 약 5 x 105 HEK293T 세포/웰을 플레이트하고, 5% CO2가 있는 37°C 가습 인큐베이터에서 18시간 동안 성장시켜 75%-80% 컨플루언시에 도달한다.</li>
	<li>지방산 혈청 박탈<ol>
<li>라벨링 배지를 준비하려면 10% FBS가 없는 위와 같이 DMEM(단계 1.1)을 준비합니다. FBS를 5% 덱스트란 숯 코팅 FBS(DCC-FBS)로 교체합니다. 사용 전에 37°C로 미리 예온합니다.</li>
		<li>세포를 실온에서 1x 포스페이트 완충 식염수(PBS)로 부드럽게 세척하고 표지 배지로 교체한다. 참고: HEK293T 세포는 조직 배양 플레이트에서 쉽게 분리됩니다. 세포를 세척하고 배지를 교체 할 때주의하십시오. 가능한 한 인큐베이터를 오가는 동안 교반을 최소화하십시오.</li>
		<li>세포를 5% CO2 로 37°C 인큐베이터로 되돌리고, 지방산으로 대사 표지를 진행하기 전에 약 45분(최소 15분이 효과적임)까지 60분 동안 배양한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 지방산 유사체의 제조 및 비누화
<ol><li>알키닐 지방산의 스톡 용액을 DMSO에 가용화하여 미리 준비하여 다음과 같은 농도를 달성하고 -20°C에서 저장한다. 필요에 따라 실온에서 해동하십시오. 최상의 성능을 위해 준비물을 N2 또는 Ar에 보관하십시오. 알키닐-미리스테이트 (13-테트라데시노산, 13-TDYA): 25 mM 알키닐팔미테이트(15-헥사데시노산; 15-HDYA): 100 mM 알키닐-스테아레이트 (17-옥타데시노산; 17-ODYA): 100 mM
</li>
	<li>20% 무지방산 BSA(FAFBSA)를 제조하기 위해, 50 mL 일회용 튜브에 FAFBSA 2 g을 칭량한다.<ol>
<li>미리 가온된(37°C) DMEM으로 최대 10mL를 가져온다.</li>
		<li>엔드-오버-엔드 회전에 의해 또는 볼텍싱에 의해 혼합하고, FAFBSA를 완전히 용해시키기 위해 37°C 수조에 놓는다.</li>
		<li>0.2 μm 필터를 사용하여 배지를 여과하십시오.</li>
		<li>분취량을 대략 1 mL 부피로 -20°C에서 저장한다. 필요에 따라 해동하고 사용 전에 수조에서 37°C로 따뜻하게 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>지방산 및 지방산 유사체의 용해도를 강화시키기 위해, 3 mL 유리 원뿔형 반응 바이알에서 20% 몰 과량의 수산화칼륨(KOH)과 함께 인큐베이션함으로써 비누화시킨다. 참고: 이 바이알은 FAFBSA가 고열로부터 응고되지 않도록 하면서 염이 용해성을 유지할 수 있도록 합니다. 유리를 사용하면 지방산이 플라스틱에 달라 붙는 것을 방지 할 수 있습니다.<ol>
<li>적어도 2 μL의 알키닐 지방산 유사체를 3 mL 원뿔형 반응 바이알의 바닥에 직접 피펫팅한다. 사용된 6-웰 플레이트의 웰당 2 μL의 지질을 준비한다( 표 1 참조). 참고 : 지방산의 소수성으로 인해 반응 바이알에 분배하기 전에 원하는 부피를 여러 번 그려서 피펫의 끝을 코팅하는 것이 가장 좋습니다.</li>
		<li>1 M KOH를 20% 몰 과량의 알키닐 지방산 라벨 (13-TDYA의 경우 30 mM, 15-HDYA 및 17-ODYA의 경우 120 mM)과 동일한 농도로 희석한다.</li>
		<li>동량의 희석된 KOH (1 μL:1 μL 지방산:KOH)를 유리의 가장자리에 있는 반응 바이알의 바닥에 가깝게 피펫 아웃하고, KOH의 분배된 부피가 지방산과 혼합되도록 한다.</li>
		<li>바이알의 뚜껑을 닫고 부드럽게 탭하여 용액을 혼합하십시오. 참고: 혼합물은 특히 지방산의 탄화수소 사슬의 길이가 증가함에 따라 빠르게 응고될 수 있습니다. 고체를 피펫팅하지 않도록주의하십시오 (즉, 피펫팅으로 혼합하지 마십시오).</li>
		<li>반응 바이알을 65°C에서 약 5분 동안 가열하거나, 지방산이 혼입되자마자 가열한다(용액이 맑아진다). 참고: 스테아레이트(17-ODYA)와 같이 탄소 수가 많고 용해도가 감소된 지방산은 65°C에서 KOH에 완전히 혼입되기 위해 더 긴 인큐베이션 시간이 필요할 수 있습니다. 필요한 경우 온도를 70 °C로 올립니다. 수조가 가장 좋습니다. 액체가 너무 많이 증발하지 않도록주의하십시오.</li>
		<li>일단 지방산이 용액으로 들어가고 가시적인 고체가 남아 있지 않으면, 피펫은 지방산의 부피비가 1:1:50이 되도록 20% FAFBSA를 예열하여 BSA 결합 알키닐 지방산의 최종 농도 20x를 달성하였다.</li>
		<li>위아래로 피펫팅하여 혼합하십시오. 용액은 일반적으로 눈에 보이는 고체가 없는 선명하게 보입니다. 참고: 전형적으로, 임의의 작은 고체는 37°C에서 인큐베이션 후에 용액으로 들어갈 것이다.</li>
		<li>지방산 및 FAFBSA를 37°C에서 15분 동안 인큐베이션한다. 참고: 이 시점에서 비누화 라벨은 15분 이상 안정적입니다. 
		 </li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>총 매체 부피(mL)</td>
			<td>Vol. 지방산 또는 지방산 유사체 (μL)</td>
			<td>권. KOH (μL)</td>
			<td>Vol. 20% FAFBSA (μL)</td>
			<td>BSA 컨쥬게이션 비누화 라벨(μL)의 총 vol.</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>4</td>
			<td>4</td>
			<td>200</td>
			<td>208</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>100</td>
			<td>104</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 비누화 지방산 표지 비율. 사용된 배지의 부피에 따른 지방산 라벨의 비누화를 위한 지방산, KOH, 및 FAFBSA의 실험적 부피.
<ol start="4"><li>컨트롤로 2.3단계를 반복합니다. 알킨 라벨이없는 지방산.</li>
	<li>세포를 20x 지방산-BSA 접합체의 1/20 부피로 기아 배지 (전형적으로, 2 mL 배지/세포에서 100 μL)에 직접 라벨링하여 알키닐-미리스테이트의 경우 1% BSA 및 25 μM의 최종 농도를 달성하고, 알키닐-팔미테이트 및 알키닐-스테아레이트의 경우 100 μM을 달성한다. 참고: 부착된 세포에 대한 물리적 교란의 양을 최소화하려면 피펫 끝에 배지에 직접 피펫팅하는 대신 피펫 표면에 가까운 물방울을 형성하십시오. 아실화 억제제를 사용하는 경우, 표지된 지방산에 적어도 15분 전에 첨가한다. 시간은 사용되는 세포 또는 억제제에 따라 달라질 수 있다. 이 단계에서도 비누화를 사용하는 것이 좋습니다28.<ol>
<li>비교를 위해, 표지되지 않은 지방산의 2 μL (또는 사폰화된 부피와 동등한)를 기아 배지에 직접 피펫팅함으로써 비누화되지 않은 지질을 첨가한다.</li>
		<li>세포를 다시 배양기에 넣고 3-6 시간 동안 배양하십시오. 참고: 최적의 라벨링 타이밍은 각 세포 유형 또는 실험 조건에 대해 결정되어야 할 수도 있습니다. 더 긴 인큐베이션 시간은 잠재적으로 β산화 및/또는 인지질28과 같은 다른 지질 그룹으로의 혼입에 의한 지방산의 분해로 이어질 수 있다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세포를 실온에서 1x PBS로 부드럽게 세척한다.</li>
	<li>세포를 500 μL 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) 무함유 변형 방사선면역침전 검정 (RIPA) 완충액 (0.1% SDS, 50 mM N-2-히드록시에틸피페라진-N-에탄술폰산 (HEPES) pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% 비변성 세제, 0.5% 소듐 데옥시콜레이트, 2 mM MgCl2 와 갓 첨가된 1 mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드 (PMSF), 및 10 μg/μL 펩스타틴 A (또는 EDTA-프리 완전 프로테아제 억제제 칵테일)로 세포를 수확하고 용해시켜 용해물을 4°C에서 15분 동안 흔들었다.<ol>
<li>용해물을 4°C에서 10분 동안 16,000 x g 에서 원심분리한다.</li>
		<li>상층액을 1.7 mL 마이크로 원심분리 튜브에 수집하고, 클릭 반응을 진행할 준비가 될 때까지 -20°C에서 보관한다. 참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 용해물은 -20°C에서 최대 1개월 동안 안정하다. 그러나 적시에 클릭 반응을 진행하는 것이 좋습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세제 상용성(DC) 분석과 같은 제조자의 프로토콜에 따라 적절한 검정을 사용하여 단백질 농도를 정량화한다.</li>
</ol>3. 세포 용해물에 대한 클릭 반응
<ol><li>클릭 화학을 위해 시약을 준비하십시오.<ol>
<li>트리스-(벤질트리아졸릴메틸)아민(TBTA)을 DMSO에 2 mM로 용해시킨다. 건조제와 함께 작은 분취량을 -20 °C에서 최대 2-3 개월 동안 보관하십시오. N2 또는 Ar 아래에 저장되는 것이 가장 좋습니다.</li>
		<li>CuSO4를 ddH2O 물에 녹여 50mM을 달성하십시오. 실온에서 최대 2 개월 동안 보관하십시오.</li>
		<li>트리스카르복시에틸포스핀(TCEP)을 ddH2O 물에 250 mM로 용해시킨다. 4°C의 어둠 속에 보관하고 클릭 반응 직전에 신선한 50mM 희석액을 만듭니다.</li>
		<li>DMSO에서 2 mM 아지드를 준비한다. 건조제와 함께 작은 분취량을 -20°C에서 최대 6개월 동안 보관하십시오. N2 또는 Ar 아래에 저장되는 것이 가장 좋습니다. 참고 : 세 개 이상의 폴리에틸렌 글리콜 그룹을 가진 제품이 비오틴과 가장 잘 작동한다는 것이 관찰되었습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>50-100 μg의 단백질 용해물을 1.7 mL 마이크로원심분리 튜브에 넣고 위와 동일한 용해 완충액을 사용하여 동일한 부피로 옮긴다. 참고: 반응 부피를 가능한 한 작게 유지하십시오 (20-100 μL).<ol>
<li>각 샘플에 소듐 도데실 설페이트(SDS)를 첨가하여 최종 1% 농도를 달성한다.</li>
		<li>용해물에 첨가된 후 최종 농도가 100 μM TBTA (2 mM 스톡), 1 mM CuSO4, (50 mM 스톡) 1 mM TCEP (50 mM 스톡), 및 100 μM 아지드 프로브 (2 mM 스톡)가 되도록 클릭 시약의 마스터 믹스를 준비한다. 그에 따라 스톡 솔루션을 결합하십시오(표 2 참조). 참고: 순서는 중요합니다. 각 성분을 첨가 한 후 완전히 혼합하십시오.</li>
		<li>용해물에 적절한 양의 마스터 믹스를 추가하십시오. 위아래로 피펫팅하여 혼합하십시오.</li>
		<li>37°C 수조에서 어둠 속에서 30분 동안 인큐베이션한다. 때때로 동요 / 혼합.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>총 반응 vol (μL)</td>
			<td>Vol. 단백질 (μL)</td>
			<td>Vol. TBTA (2 mM) (μL)</td>
			<td>전압. CuSO4 (50 mM) (μL)</td>
			<td>권. TCEP (50 mM) (μL)</td>
			<td>Vol. 아지도 프로브 (2 mM) (μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>50</td>
			<td>43</td>
			<td>2.5</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>100</td>
			<td>86</td>
			<td>5</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>5</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 시약 및 단백질 부피비를 클릭합니다. 클릭 화학 시약의 실험 부피 및 상응하는 스톡 농도, 단백질 샘플의 부피 이외에.
4. 면역침전 단백질에 대한 클릭 반응
<ol><li>대안적으로, 비드 위 또는 오프 면역침전 (IP) 단백질 에 대한 클릭 반응을 수행할 수 있다. 참고: 일반적으로 비드 를 클릭하는 것은 배경이 가장 적고 관심있는 새로운 단백질을 테스트 할 때 가장 좋습니다.<ol>
<li>관심있는 단백질에 대해 트랜스펙션된 세포는, 이 경우, 야생형 미리스토일화 C-말단 헌팅틴(HTT)이 G2A 치환과 함께 GFP(myr-ctHTT-GFP) 및 ctHTT-GFP에 융합되고, 앞서 기술된 바와 같이 인산칼슘 DNA 공침전을 사용하여41.<ol>
<li>플레이트 2.5 x 105 세포/웰을 6-웰 조직 배양 플레이트에 넣고 하룻밤 동안 ~70-80% 컨플루언시까지 성장시킨다.</li>
			<li>1.7 mL 마이크로원심분리 튜브에 99.75 μL 분자 등급 H2O와 함께 10 μL의 DNA 2.5 μg을 첨가하여 DNA 믹스를 제조하였다. 이어서, CaCl2 15.25 μL를 DNA 믹스에 적가한다.</li>
			<li>DNA/CaCl2 혼합물을 125 μL 2x HEPES 완충 식염수(HBS, pH 7.0)가 들어있는 별도의 튜브에 혼합하면서 적가하여 첨가한다.</li>
			<li>DNA/CaCl2/HBS 믹스를 세포에 천천히 첨가하십시오. 2-4 시간 후, 배지를 교체하고 밤새 인큐베이션하십시오. 1.3-2.8단계부터 레이블링을 진행합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>용해 완충액에 동일한 부피의 500 μg 단백질을 준비하십시오.</li>
		<li>4°C에서 밤새 회전하는 ctHTT-GFP에 대해 토끼 항-GFP와 함께 인큐베이션함으로써 IP를 수행한다.</li>
		<li>용해 완충액으로 미리 평형화된 15-20 μL 단백질 G 비드를 각 튜브에 첨가하고, 4°C에서 3시간 동안 엔드-오버 엔드-엔드-엔드-오버-엔드-오버-엔드-엔드-오버-엔드-엔드</li>
		<li>비드를 용해 완충액으로 세척하고 45 μL 1% SDS 50 mM HEPES 완충액에 재현탁시켰다.</li>
		<li>비드를 80°C에서 15분 동안 가열하고 튜브를 반전시키거나 대략 5분마다 교반한다. 튜브를 잠깐 회전시키고 80°C로 복귀시킨다.</li>
		<li>샘플이 여전히 따뜻할 때 단백질을 포함하는 상청액을 수집하십시오. 참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있으며 클릭 화학에 즉시 사용하지 않을 경우 면역침전된 샘플을 -20°C 또는 -80°C에서 저장할 수 있습니다.</li>
		<li>43 μL의 상청액이 클릭 시약의 7 μL 마스터 믹스와 반응하도록 허용한다.</li>
		<li>단계 3.2.3에 명시된 바와 같이 반응을 진행한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅
<ol><li>반응을 중지시키고 25 mM 디티오트레이톨(DTT)을 함유하는 1x 샘플 로딩 버퍼를 첨가하고 95°C에서 5분 동안 가열함으로써 변성시킨다. 참고: 최대 100mM DTT를 사용할 수 있습니다28. 티오에스테르 결합을 가수분해하고 클릭된 지방산 유사체를 제거할 수 있으므로 β-메르캅토에탄올을 S-아실화 단백질과 함께 사용하지 마십시오.</li>
	<li>샘플을 간단히 스핀다운합니다.</li>
	<li>폴리아크릴아미드 겔 상에서 SDS-PAGE로 단백질을 중복하여 분리한다. 참고 : 티오에스테르 결합의 존재를 확인하기 위해 KOH로 알칼리성 처리를 위해 두 개의 젤이 필요합니다. 형광 아지드 프로브를 사용하는 경우, 아실화는 지시된 여기 채널을 사용하여 겔 내 또는 전사 후에 검출될 수 있다.</li>
	<li>폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF) 멤브레인 (메탄올에서 활성화되고 ddH2O에서 헹구어 - 각각 5 분)으로 25V, 1.0 A (상수)에서 30 분 동안 반건조 전달 장치로 옮깁니다.</li>
	<li>ddH2O로 멤브레인을 간단히 헹구어 낸 후, 한 복제 멤브레인을 메탄올 / 물 (9:1 v / v)의 0.1 M KOH (9 : 1 v / v)에 담그고 다른 하나는 메탄올 / 물 (9 : 1 v / v)의 0.1 M Tris-HCl pH 7.0에 담가 비알칼리성 대조군으로 실온에서 60 분 동안 부드럽게 흔들어 놓습니다.</li>
	<li>멤브레인을 ddH2O 물에서 간단히 헹구고, PBS-T (1x PBS, 0.1% 트윈 20)로 5분간 6회 세척하였다. 참고: 철저히 씻으십시오.</li>
	<li>멤브레인을 5% 탈지유 차단 완충액(1x PBS, 0.1% Tween20)에서 하룻밤 동안 차단한다.</li>
</ol>6. 웨스턴 블롯 수행
<ol><li>지시된 경우, 형광 태그가 붙은 스트렙타비딘 (1:5000) 및 로딩 대조군, 항-GAPDH 로다민 (1:5000)을 5% BSA 차단 완충액 (0.01% SDS, 1x PBS, 0.1% Tween20)으로 실온에서 45-60분 동안 어둠 속에서 부드럽게 흔들면서 프로브.<ol>
<li>면역침전된 단백질 블롯을 먼저 5% 탈지유 차단 완충액 중의 일차 항-GFP 항체로 조사한 다음, 단계 6.1에서와 같이 5% BSA에서 적절한 이차 항체로 프로브한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>멤브레인을 PBS-T (1x PBS, 0.1% Tween20)로 5분 동안 세척하고 총 네 번의 반복으로 영상화하기 전에 ddH2O 물로 헹구었다.</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

배양물에서 세포에 지방산을 직접 첨가하면 불용성, 지질의 침전 및 지방 독성40이 발생할 수 있습니다. 결과적으로, 지방산을 세포에 직접 첨가하는 것은 불량한 세포 흡수 및 지방산 라벨의 낮은 이용가능성을 초래할 뿐만 아니라, 하류 분석을 위한 생존 가능한 세포의 수 감소뿐만 아니라 오프 타겟 경로의 활성화를 초래할 수 있다. 그러나, 클릭 화학 검출을 위한 많은 대사 라벨링 프로토콜은 지방산의 직접 첨가 및 현재까지 클릭 화학 검출을 이용한 많은 수의 팔미토일-프로테옴 연구를 수반하며, 지방산 라벨을 비누화하거나 BSA8,36으로 인큐베이션하는 경우는 거의 없다. 지방-아실화 단백질의 클릭 화학 검출의 효율 및 민감성이 지방산 유사체의 충분한 세포 흡수에 의존한다는 사실을 고려하는 것이 중요하다. 따라서, 많은 S-아실화 단백질이 세포 내로의 불량한 혼입으로부터 지방산 라벨의 낮은 이용가능성, 특히 장쇄 지방산 17-ODYA가 사용되었을 때 프로테오믹 연구에서 검출을 회피했을 수 있다고 추측하는 것이 합리적이다. 17-ODYA, 또는 알키닐 스테아레이트는 상업적 이용 가능성과 초기 사용으로 인해 여러 연구에서 널리 사용되는 라벨이었습니다8,36. 그러나, 이 프로토콜의 결과는 17-ODYA의 비누화는 팔미테이트 또는 미리스테이트와 같은 더 짧은 사슬 지방산과 비교하여 S-아실화 단백질의 검출에서 가장 큰 증가를 초래한다는 것을 입증한다. 따라서, 비누화 라벨로 이러한 실험을 반복하는 것은 이전에 간과되었을 수 있는 S-아실화의 추가적인 기질을 산출할 수 있다. 또한, 대부분의 팔미토일 아실트랜스퍼라제는 S-아실화를 위해 팔미테이트를 선호하는 반면, 일부는 스테아레이트15,38,44와 같은 지방산의 다른 길이에 대한 선호도를 갖는다. 또한, 일부 단백질 또는 단백질 내의 특정 부위는 다른 지방산보다 하나의 지방산을 선호합니다15,45. 따라서 17-ODYA를 사용한 연구는 팔미테이트가 아닌 스테아레이트로 아실화된 S-아실화 단백질에 대한 편향성을 가질 수 있으며, 낮은 검출로 인해 이러한 단백질을 과소 나타낼 수도 있습니다.
클릭 화학에 대한 향상된 대사 표지 효율은 지질의 비누화 및 FAFBSA 단계와의 인큐베이션, 뿐만 아니라 탈지된 FBS에 의존한다. 모든 지방산은 FAFBSA와의 인큐베이션을 진행하기 전에 남아있는 가시적 인 고체없이 KOH에서 완전히 비누화되어야합니다. 이것은 어려운 단계가 될 수 있으며 타이밍이 중요합니다. 비누화 지방산이 65°C에서 용액으로 들어간 후, 추가 가열이 지방산으로부터 DMSO의 증발을 야기할 때 즉시 따뜻한 BSA를 첨가한다. 또한, 비누화 된 라벨은 냉각되기 시작하자마자 다시 응고되기 시작합니다. 따라서 FAFBSA는 소금이 용해 된 후에 따뜻하고 신속하게 첨가되어야합니다. 유리 반응 바이알 및 그 모양은이 단계에서 중요합니다. 그들은 비누화 된 지질이 가용성을 유지할만큼 충분히 따뜻할 수있게하고, FAFBSA가 혼잡하지 않도록 충분히 차갑게합니다. 이 단계에서 피펫팅을 통한 충분한 혼합은 라벨링을 위한 균질한 용액을 보장하기 위해 또한 중요하다.
클릭 화학을 위한 시약은 전형적으로 건조제와 함께 또는 -20 °C 내지 -80°C에서 N2 또는 Ar 가스 하에 적절하게 저장되어야 한다. 아실화 신호 또는 약한 신호의 부족은 불안정한 시약, 특히 오래된 TBTA 및 아지드 원액 때문일 수 있다. 또한, 형광 아지드 원액은 가능한 한 빛으로부터 보호되어야 합니다. 또한, 지질 박탈 방법 및 라벨링 시간과 같은 변수는 사용되는 세포의 유형에 따라 최적의 조건을 결정하기 위해 테스트되어야 할 수도 있다. 예를 들어, 신경 세포는 배지 변화와 지질 박탈이 어렵기 때문에 더 긴 라벨링 시간이 필요할 수 있습니다 (게시되지 않음).
이 프로토콜의 이점은 장쇄 지방산에 사용될 때 가장 극적입니다. 더 짧은 체인의 경우, 신호 강도의 증가는 덜 극적이되지만 여전히 세포에 보호 될 가능성이 큽니다. 제안된 변형은 일반적으로 단백질 아실화 검출을 개선하지만, 클릭 화학은 여전히 안정하게 S-아실화 단백질이 아닌 동적으로 검출하는 것으로 제한되는 지질 중심 방법1으로 간주된다1. 고려해야 할 다른 제한은 라벨링을 촉진하기 위한 지방산 박탈의 요건, 및 S-아실화16의 아실비오틴 교환(ABE) 검출과 비교할 때 상용성인 세포 유형의 비교적 제한된 범위를 포함한다. 이러한 한계에도 불구하고, 클릭 화학 검출은 대부분의 아실 교환 분석보다 빠르며 아실 교환 분석에 필요한 반복적 인 단백질 침전 단계를 용납하지 않는 단백질의 검출에 더 적합합니다. 또한, 이러한 접근법은 펄스-체이스 분석(pulse-chase analysis)38과 같은 다른 클릭 분석을 사용하는 동시 라벨링과 조합될 수 있다.
클릭 화학을 위한 대사 표지를 위한 이러한 변형의 사용은 클릭 화학과 함께 사용되는 다양한 프로테오믹 기술을 통해 아실화 단백질, 특히 S-아실화의 전반적인 검출을 증가시켰다. 도시된 바와 같이, 플루오르겐 검출은 비오틴의 대안으로서 사용될 수 있다(도 1)28. 이는 세포 용해물에 내인성 형광 단백질이 없기 때문에 특히 유용하다. 또한, 클릭화 후에만 활성화되는 형광단이 사용될 수 있다46. 클릭 화학 라벨링을 위한 비누화 및 FAFBSA 결합 지방산은 세포에서 사용 가능한 라벨의 양이 전반적으로 증가하고 배지에 지방산을 직접 첨가하는 독성 효과를 제한함으로써 관심있는 단백질을 검출하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다. 또한 질량 분광법(mass spectrometry27)과 함께 활용되어 저풍부 단백질의 검출을 증가시킬 수 있으며, 특히 가장 풍부한 단백질의 검출을 선호하는 기존의 데이터 의존적 수집과는 달리, 낮은 풍부 단백질에 대한 민감도를 높이기 위해 중복 측정을 방지하는 기계 학습 알고리즘을 사용하는 최근의 발전과 함께 취해질 때 특히 그렇습니다47 . 또한, 클릭 화학은 세포 배양 (SILAC) 및 펄스 체이스 방법에서 아미노산을 이용한 안정한 동위원소 표지와 결합하여 동적 단백질 S-아실화27에 대한 정량화 가능한 데이터를 생성 할 수 있습니다. 마지막으로, Hannoush 그룹은 클릭 화학과 근접 결찰 분석 (PLA)을 결합하여 팔미토일화 단백질의 아세포 분포에 대한 단일 세포 시각화 및 검사를 허용합니다43,48.

지방 아실화는 단백질에 지방산을 공유적으로 첨가하는 것을 포함하며 단백질-막 상호작용을 촉진하는 데 그 중요성으로 잘 알려져 있지만, 단백질-단백질 상호작용, 형태적 변화를 촉진하고 효소의 촉매 부위를 조절하는 것으로 밝혀졌다1,2,3,4,5,6,7 . 지방 아실화는 감염, 암, 염증 및 신경 변성을 포함한 무수한 질병에서 잠재적 인 약물 표적으로 부상했으며, 팔미토일화의 중단이 문서화되었습니다8,9,10,11,12,13. 이것은 주로 S-아실화 단백질 표적의 대규모 식별을 가능하게 하는 새로운 화학적 검출 방법의 개발에 의해 촉진되었다.
지방 아실화는 포화 및 불포화 지방산의 공유 첨가를 수반하는 다양한 변형을 포함할 수 있지만, 전형적으로 N-미리스토일화 및 S-아실화를 지칭한다. N-미리스토일화는 단백질 분해 절단 후 새로 노출된 N 말단 글리신 상에서 초기 폴리펩티드 상에서 공동 번역적으로 또는 번역 후 N-말단 글리신에 미리스트산을 첨가하는 것을 지칭한다2,14. N-미리스토일화는 비가역적인 아미드 결합을 통해 일어난다. 한편, S-아실화는 전형적으로 티오에스테르 결합을 통해 시스테인 잔기에 장쇄 지방산의 가역적 첨가를 지칭한다. 이러한 변형의 가장 일반적인 형태는 팔미테이트의 혼입을 포함하며, 따라서, 일반적으로 S-팔미토일화, 또는 단순히 팔미토일화11,15로 지칭된다. 여러면에서 S-팔미토일화는 인산화와 유사합니다. 그것은 역동적이고, 효소적으로 조절되며, 매우 다루기 쉬운 것으로 입증되었습니다.
지난 십 년 동안까지, 지방 아실화를 연구하는 것은 방사성으로 표지된 지방산을 필요로 하는 제한된 검출 방법에 의해 방해를 받았다. 여기에는 비용, 안전 문제 및 매우 긴 탐지 시간을 포함하여 몇 가지 단점이있었습니다. 전형적으로, 트리티화 또는 요오드화 팔미테이트가 S-아실화16의 검출을 위해 사용되었다. 삼중수소화 팔미테이트는 자가방사선 촬영 필름으로 긴 검출 기간이 필요했는데, 이는 몇 주에서 몇 달이 걸릴 수 있습니다. [125I] 요오도지방산 유사체는 검출 시간을 단축시켰지만, 훨씬 더 높은 안전 위험을 제시하고 실험자의 갑상선 모니터링을 면밀히 필요로 했다. 또한, 이들 방법은 비정량적이었기 때문에, 동적 팔미토일화를 측정하는 능력을 제한하고, 또한 추가적인 개인 보호 장비 및 방사성 모니터링으로 인해 셋업 및 청소에 시간이 많이 걸린다. 마지막으로, 방사성 표지는 프로테오믹 연구에 적합하지 않았으며 일반적으로 관심있는 특정 단백질의 낮은 처리량 검출로 제한되었습니다. 더 많은 기질이 검출되고 필연적으로 각 변형을 매개하는 효소가 확인됨에 따라 새로운 검출 방법이 필요하다는 것이 분명해졌습니다.17,18,19,20,21. 거의 동시에, 지방 아실화 단백질의 검출을위한 몇 가지 새로운 방법이 생겨났습니다. 첫 번째는 S-아실화의 티오에스테르 결합의 가역성 및 반응성을 이용한다. 아실-비오틴 교환(ABE) 분석은 아비딘 아가로스 비드를 사용한 S-아실화 단백질의 후속 풀다운과 웨스턴 블롯22,23,24에 의한 직접 검출을 위해 팔미테이트를 비오틴으로 화학적으로 대체한다. 다음으로, 지방산의 생체 직교 라벨링 및 태그 또는 핸들에 대한 화학적 선택적 첨가가 Staudinger 라이게이션 및 클릭 화학의 사용을 포함하는 개발되었다25,26,27,28,29,30,31,32,33 . 마지막으로, ABE와 유사하게, 아실-수지 보조 포획(RAC)은 본질적으로 S-아실화 부위를 S-아실화 단백질의 포획 및 검출을 위한 티올-반응성 비드로 대체한다34,35. 함께, 교환 및 클릭-화학-기반 분석은 하류 분석을 위한 아실화 검출 및 친화성 정제의 보다 효율적이고 민감한 방법을 제공하였고, 그 후 수천 개의 S-아실화 단백질8,36의 발견을 이끌었다.
용어 클릭 화학은 화학 반응의 그룹을 포함하지만, 가장 일반적으로 알키닐 그룹과 아지도기 사이의 Cu(I)-촉매화된 아지도-알킨[3+2] 시클로부가반응 메카니즘을 지칭한다27,28,37. 특히, 지방 아실화의 경우, 클릭 화학은 생체직교 16-탄소 알키닐-팔미테이트(15-헥사데시노산; 15-HDYA) 또는 14-탄소 알키닐-미리스테이트(13-테트라데시노산; 13-TDYA)를 각각 세포 내인성으로 표지하기 위해 세포 내로 혼입시킴으로써 S-팔미토일화 또는 N-미리스틸화의 검출을 수반한다28 . 관심있는 단백질의 세포 용해 및 면역침전 후, 웨스턴 블롯28,37에 의한 검출을 위해 친화성 프로브, 전형적으로 비오틴에 결합하기 위해 클릭 화학 반응 (알킨과 아지드 사이의 공유 결합)이 수행된다. 대안적으로, 클릭 화학은 전체 세포 용해물에 대해 수행될 수 있고, 지방 아실화 단백질은 질량 분광법에 의한 확인을 위해 친화성 정제될 수 있다. 아지도-비오틴을 사용한 초기 클릭 화학 반응은 방사능에 비해 백만 배 이상 탐지의 선택성과 민감도를 증가시켰다2. 클릭 화학의 또 다른 장점은 정량 분석을 위해 아지도-호모알라닌을 사용하는 단백질 회전율의 펄스 체이스 분석과 같은 다른 고전적인 라벨링 방법과 결합될 수 있다는 것이다38. 또한, 단백질 국재화를 검사하기 위해 비오틴 또는 FLAG 또는 Myc 태그와 같은 다른 생화학적 프로브 대신에 형광 프로브를 사용할 수 있습니다16,28,39.
클릭 화학의 상대적 사용 용이성에도 불구하고, 검출은 세포 배양물에서 장쇄 유리 지방산을 사용하는 낮은 용해도 및 잠재적 독성에 의해 제한될 수 있다40. 특히, 대부분의 단백질에 대한 S-아실화 동안 팔미테이트의 선호에도 불구하고, 많은 연구들은 S-아실화 단백질을 검출하기 위해 팔미테이트(15-HDYA) 보다는 18-탄소 스테아레이트(17-옥타데시노산-17-ODYA)를 사용했는데, 이는 이의 상업적 이용가능성과 상대적으로 저렴한 비용으로 인한 것이다. 그러나 17-ODYA는 매우 불용성이며 사용할 때 특별한주의가 필요합니다. 또한, 클릭 화학은 화학 물질의 미묘한 준비와 저장이 필요할 수 있습니다. 본원에서, 프로토콜은 지방산의 비누화, 지방산 유리 BSA를 사용한 전달, 및 탈지화된 태아 소 혈청(FBS)을 사용하여 전달을 최적화하여 용해도를 증가시키고 세포에 유리 지방산을 첨가하는 잠재적 독성 효과를 우회하는 라벨링 접근법을 기술한다28. 이 방법은 다양한 세포 유형에서 작동하며 심지어 살아있는 동물에서도 사용되었습니다28.

<table><tbody><tr><td>13-테트라데시노산(알키닐 미리스트산)(25mM)</td><td>Click Chemistry Tools</td><td>1164</td><td></td></tr><tr><td>15-hexadecynoic acid (alkynyl palmitic acid) (100mM)</td><td>Click Chemistry Tools</td><td>1165</td><td></td></tr><tr><td>17-octadecynoic acid (alkynyl stearic acid) (100 mM)</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>90270</td><td></td></tr><tr><td>30% 아크릴아미드/비스 용액 29:1</td><td>Biorad</td><td>1610156</td><td></td></tr><tr><td>96웰 플레이트 리더</td><td>Biorad</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>AFDye 647 azide plus</td><td>Click Chemistry Tools</td><td>1482</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate (APS)</td><td>Biorad</td><td>1610700</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GAPDH hFAB Rhodamine</td><td>Biorad</td><td>12004167</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rabbit Alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11034</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Tubulin hFAB Rhodamine</td><td>Biorad</td><td></td><td></td>12004166</tr><tr><td>비오틴 아지드</td><td>클릭 화학 도구</td><td>1265</td><td></td></tr><tr><td>Bis-tris, 초순수</td><td>VWR</td><td>715</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>J.T. 베이커</td><td>1332-1</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 16,000xg, 4&deg; C</td><td>Thermo Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>숯 STRP FBS 원샷(DCC-FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>A3382101</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc Imager</td><td>Biorad</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>황산구리(1mM)</td><td>VWR</td><td>BDH9312</td><td></td></tr><tr><td>데옥시콜산, 나트륨염 일수화물</td><td>MP Biomedicals</td><td>102906</td><td></td></tr><tr><td>세제 호환(DC) 분석</td>, <td>Biorad</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>디메틸설폭사이드(DMSO)</td><td>VWR</td><td>0231-500 mL</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 1x</td><td>Wisent Inc</td><td>319015CL</td><td></td></tr><tr><td>에탄올, 무수</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td></td></tr><tr><td>지방산 무함유 BSA</td><td>MP Biomedicals</td><td>219989950</td><td></td></tr><tr><td>패스트 블롯 터보 반건조 전사</td><td>Biorad</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>FluoroTrans W PVDF(폴리비닐리덴 플루오라이드) 전달 멤브레인</td><td>Pall Life Sciences</td><td>BSP0161</td><td></td></tr><tr><td>HEPES(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-ethanesulfonic) 산</td><td>VWR</td><td>5011</td><td></td></tr><tr><td>37°°C의 가습 인큐베이터; C 및 5% CO2</td><td>VWR</td><td>해당 없음</td><td></td></tr><tr><td>Igepal CA-630</td><td>Alfa Aesar</td><td>J61055</td><td></td></tr><tr><td>이미지 랩 소프트웨어</td><td>Biorad</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민 보충제 솔루션</td><td>Wisent Inc</td><td>609-065-EL</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>VWR</td><td>BDH1135</td><td></td></tr><tr><td>미리스틱산(25mM)</td><td>VWR</td><td>M0476-25G</td><td></td></tr><tr><td>팔미트산(100m)</td><td>VWR</td><td>P0002-25G</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신, 10x</td><td>Wisent Inc</td><td>450201EL</td><td></td></tr><tr><td>펩스타틴 A(합성)</td><td>엔조 생명과학</td><td>ALX-260-085-M005</td><td></td></tr><tr><td>페닐메틸설포닐 플루오라이드</td><td>엔조 생명과학</td><td>ALX-270-184-G005</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수, 10x, pH 7.4</td><td>VWR</td><td>75801-000</td><td></td></tr><tr><td>GFP에 대한 다클론 염소 항체(Affinity Purified)</td><td>Eusera</td><td>EU4</td><td></td></tr><tr><td>FluoroTrans W PVDF(폴리비닐리덴 플루오라이드) 전달 멤브레인</td><td>Pall Life Sciences</td><td>BSP0161</td><td></td></tr><tr><td>수산화칼</td>륨 <td>Ward's Science</td><td>470302-100</td><td></td></tr><tr>GFP Eusera<td>에 대한 토끼 다클론 항체</td><td></td><td>EU1</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>VWR</td><td>0241-1KG</td><td></td></tr><tr><td>도데실황산나트륨(SDS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166-500</td><td></td></tr><tr><td>피루브산나트륨</td><td>Wisent Inc</td><td>600-110-EL</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Alexa Fluor 680 conjugate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S21378</td><td></td></tr><tr><td>Tris-(benzyltriazolylmethyl)amine (TBTA) (100 uM)</td><td>Click 화학 도구</td><td>1061</td><td></td></tr><tr><td>Tris-(2-carboxyethyl)phosphine HCl (TCEP) (1mM)</td><td>Soltec Ventures</td><td>M115</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Wisent Inc</td><td>325-043-CL</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 시약 등급 1L</td><td>VWR</td><td>97062-332</td><td></td></tr><tr><td>WHEATON NextGen V 바이알 3 mL</td><td>VWR</td><td>89085-424</td><td></td></tr></tbody></table>

클릭 화학을 이용한 지방 아실화 단백질의 검출을 위한 알키닐 지방산 유사체의 최적화된 혼입

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

단백질 기질에 포화 지방산을 공유적으로 첨가하는 지방 아실화는 암 및 신경 퇴행성 질환에 미치는 영향 외에도 무수한 세포 기능을 조절하는 데 중요합니다. 지방 아실화 검출 방법의 최근 개발은 특히 생체 직교 표지를 사용한 클릭 화학의 사용을 통해 지방 아실화 단백질의 효율적이고 위험하지 않은 검출을 가능하게했습니다. 그러나, 클릭 화학 검출은 세포 배양에 장쇄 지방산을 첨가하는 불량한 용해도 및 잠재적인 독성 효과에 의해 제한될 수 있다. 여기에 기재된 것은 지방-유리 BSA 뿐만 아니라 탈지된 매질과 조합된 비누화된 지방산을 사용하여 최적화된 전달을 갖는 라벨링 접근법이며, 이는 검출하기 어려운 지방 아실화 단백질의 검출을 향상시킬 수 있다. 이 효과는 알키닐-스테아레이트 유사체인 17-ODYA로 가장 뚜렷하게 나타났으며, 이는 아실화 단백질의 클릭화학 검출에 가장 일반적으로 사용되는 지방산 유사체였다. 이 변형은 세포 혼입을 개선하고 아실화 단백질 검출에 대한 민감도를 증가시킵니다. 또한, 이러한 접근법은 다양한 세포 유형에 적용될 수 있으며, 펄스-체이스 분석, 세포 배양물에서 아미노산을 이용한 안정한 동위원소 표지, 지방 아실화 단백질의 정량적 프로파일링을 위한 질량 분광분석법과 같은 다른 분석과 조합될 수 있다.

클릭 화학 검출을 위한 비누화 및 비사포화(non-sap) 알키닐 지방산 사이의 라벨링 효율의 차이는 웨스턴 블롯을 통해 지방 아실화 단백질의 신호 강도에 의해 시각화되고 비교될 수 있다(도 1). 아실 사슬의 길이가 증가함에 따라 눈에 띄는 효과가 관찰되었습니다. 알키닐-스테아레이트(alk-stear)로 표지된 세포에서, 지방산의 비누화 및 대사 표지를 위한 BSA로의 전달은 클릭 화학을 통한 S-아실화 단백질 신호의 검출을 급격히 증가시키고 형광 아지도프로브에 의한 검출을 증가시켰으며(도 1, 오른쪽), 알키닐 지방산 표지의 세포 혼입의 전반적인 증가를 시사한다. 반대로, 가장 짧고 가장 가용성인 지방산인 알키닐-미리스테이트(alk-myr; 13-테트라데시노산 또는 13-TDYA)로 처리된 세포에서는 눈에 띄는 차이가 관찰되지 않았다. 알키닐-팔미테이트로 표지된 세포(도 1, 중간)는 알키닐-미리스테이트(13-TDYA)에 비해 중간 표지의 증가를 보였지만, 알키닐-스테아레이트보다 적었다.
중요하게도, PVDF 막을 0.1 M KOH로 처리하면 알키닐-팔미테이트 및 알키닐-스테아레이트와 함께 배양된 세포로부터 지방산 라벨이 크게 제거되었고, 대부분의 신호가 에스테르 또는 티오에스테르 결합을 통해 이루어졌음을 확인하였다(도 1, 중간 및 오른쪽, 하단 패널). 예상한 바와 같이, 알키닐-미리스테이트의 혼입은 아미드 결합을 통해 단백질에 미리스테이트의 부착으로 인해 대부분 알칼리 내성(도 1, 왼쪽, 하단 패널)이었다.
도 2는 면역침전된 단백질의 지방 아실화를 검출하기 위한 클릭 화학의 다양성 및 민감성을 입증한다. HEK293T 세포를 GFP (myr-ctHTT-GFP)에 융합된 미리스토일화 C 말단 헌팅틴 (HTT)으로 형질감염시키고, 앞서 기술된 바와 같이 알키닐-미리스테이트로 표지하였다18. 면역침전 후, ctHTT-GFP를 비드로부터 방출하고 용해물과 함께 클릭 화학을 실시하였다. 야생형(WT) myr-ctHTT-GFP의 미리스토일화가 면역침전물에서 검출되었을 뿐만 아니라, 용해물에서 강하게 검출된 반면, G2A 돌연변이는 ctHTT-GFP의 미리스토일화를 완전히 차단하였다(도 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62107/62107fig01.jpg"> 그림 1: 클릭 화학을 이용한 지방 아실화 단백질의 검출. HEK293T 세포를 지시된 지방산과 직접 (non-sap) 또는 이어서 비누화 (sap)와 함께 인큐베이션하고, 프로토콜 2.1-2.7에 기재된 바와 같이 운반체 단백질 BSA와 함께 인큐베이션하였다. 알키닐-지방산은 100 μg의 단백질 용해물을 클릭 화학에 적용하고, SDS-PAGE로 분리하고, PVDF 막으로 옮겨짐으로써 형광 아지드에 연결되었다. 0.1 M 트리스 pH 7.0 또는 0.1 M KOH로 처리한 후, 티오에스테르 결합을 역전시키기 위해, 지방 아실화를 형광 아지드를 사용하여 검출하였다. GAPDH를 로딩 대조군으로 사용하였고; 항-GAPDH 로다민 (1:5,000). 알크-미르 = 13-TDYA, 알크-팔 = 15-HDYA, 알크-스테 = 17-ODYA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62107/62107fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62107/62107fig2v3.jpg"> 그림 2: 클릭 화학을 이용한 N-미리스토일화 ctHTT-GFP의 검출. HEK293T 세포를 C-말단 절단(ct) 및 미리스토이터블 형태의 HTT(myr-ctHTT-GFP)로 형질감염시키고, 알키닐-미리스테이트로 표지하였다. 알라닌으로 대체된 필수 글리신을 갖는 비미리스토릴성 형태(G2A)가 포함되었다. 수확 및 용해 후, ctHTT-GFP를 염소 항-GFP를 사용하여 면역침전시켰다. 용해물은 비드로부터의 방출 후 면역침전물뿐만 아니라 클릭 화학 반응(왼쪽)을 실시하였다. 미리스토일화는 스트렙타비딘 알렉사 680 (SA680)을 사용하여 검출하였다. GFP는 항토끼 알렉사 488과 조합된 토끼 항-GFP를 사용하여 검출되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62107/62107fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62107/62107fig3v4.jpg"> 그림 3: 실험 프로토콜의 워크플로우 체계. 프로토콜의 주요 실험 단계에 대한 워크플로 개요입니다. 프로토콜이 일시 중지될 수 있는 몇 가지 지점이 주목됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62107/62107fig3v3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

지방 아실화에 대한 연구는 세포 단백질 상호 작용 및 질병에 중요한 영향을 미칩니다. 여기에 제시된 것은 지방 아실화 단백질의 클릭 화학 검출을 개선하기위한 변형 된 프로토콜이며, 이는 다양한 세포 유형에 적용될 수 있으며 펄스 체이스 및 질량 분광법을 포함한 다른 분석과 결합 될 수 있습니다.

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

이 방법은 세포로의 지방산 전달을 개선하고 유리 지방산 전달의 독성 영향으로부터 지방산을 보호하여보다 일관된 라벨링을 보장합니다. 클릭 화학 검출의 민감도 및 효율은 지방산 라벨의 효과적인 흡수에 의존한다. 우리는 이것이 크게 개선 될 수 있음을 보여주었습니다.프로토콜의 몇 가지 단계는 매우 구체적이며 면밀히 따라야합니다. 시각적 데모는 예를 들어 라벨링 믹스에서 고체의 형성을 피하는 방법을 명확히하고 보여줄 수 있습니다. 라벨링 배지를 준비하려면 DMEM에 5%덱스트란/숯으로 코팅된 FBS, 1X 페니실린 스트렙토마이신, 2밀리몰 L-글루타민 및 100밀리몰 소듐 피루베이트로 보충한 다음 사용하기 전에 섭씨 37도까지 예열하십시오.여섯 웰 조직 배양 접시에서 하루 전에 플레이팅된 HEK-293 T 세포를 PBS로 부드럽게 세척한 다음, PBS를 표지 배지로 교체한다. 지방산으로 대사 표지를 진행하기 전에 세포를 섭씨 37도에서 약 45분 동안 5% 이산화탄소로 배양한다. 지방산 유사체를 비누화하기 위해, 적어도 두 마이크로리터의 알키닐 지방산 유사체를 세 밀리리터 원뿔형 반응 바이알의 바닥에 직접 피펫한다.유리의 가장자리에 반응 바이알의 바닥에 가까운 동량의 희석된 수산화칼륨을 피펫팅하여 분배된 부피의 수산화칼륨이 지방산과 혼합되도록 한다. 바이알의 뚜껑을 닫고 부드럽게 탭하여 용액을 혼합하십시오. 반응 바이알을 섭씨 65도에서 약 5분 동안 또는 용액이 맑아질 때까지 가열하여 지방산이 혼입되었음을 나타냅니다.그러나 액체가 너무 많이 증발하지 않도록주의하십시오. 다음으로, 피펫은 20% 무지방산 BSA를 가온하여 지방산 비함유 BSA에 대한 수산화칼륨에 대한 지방산의 부피비가 1-1-50이 되도록 하여, 20X BSA 결합 알키닐 지방산의 최종 농도를 달성하였다. 용액을 위아래로 피펫팅하여 섞은 다음 섭씨 37도에서 15 분 동안 배양하십시오.HEK-293 T 세포를 20X 지방산 BSA 접합체를 기아 배지에 직접 첨가하여 25 마이크로몰 알키닐 미리스테이트 또는 100 마이크로몰 알키닐 팔미테이트 및 알키닐 스테아레이트 중의 1%BSA의 최종 농도를 달성함으로써 표지한다. 비교를 위해, 라벨이 붙지 않은 지방산 두 마이크로리터를 기아 배지에 직접 피펫팅하여 비누화되지 않은 액체를 첨가한 다음, 세포를 다시 세 시간에서 여섯 시간 동안 배양기에 넣는다. 인큐베이션이 완료된 후, 세포를 실온에서 PBS로 부드럽게 세척한 다음, 500 마이크로리터의 EDTA-free 변형된 RIPA 완충액을 첨가하고, 용해물을 섭씨 네 도에서 15분 동안 회전시켜 세포를 수확하고 용해시킨다.용해물을 섭씨 4도에서 16, 000배 G에서 10분 동안 원심분리한 다음, 1.7밀리리터 마이크로원심분리 튜브에 상층액을 수집하여 영하 20도에 보관한다. EDTA가 없는 변형된 RIPA 버퍼를 사용하여 1.7밀리리터 마이크로원심분리 튜브에 50 내지 100 마이크로그램의 단백질 용해물을 동일한 부피로 가져온다. 반응 부피를 가능한 한 작게 유지하십시오.각 샘플에 STS를 추가하여 최종 농도 1%클릭 시약의 마스터 믹스를 준비하고 용해물에 적절한 부피를 추가한 다음 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 용해물을 가끔 혼합하여 섭씨 37도 수조에서 30 분 동안 어둠 속에서 배양하십시오. 면역 침전을 위해, 용해물을 토끼 항-GFP와 혼합하고 섭씨 네 도에서 회전하면서 밤새 배양하십시오.0.1%SDS RIPA로 미리 평형화된 15~20마이크로리터의 마그네틱 비드를 각 튜브에 넣고 섭씨 네 도에서 끝까지 3시간 동안 반응할 수 있도록 합니다. 비드를 용해 완충액으로 세척하고 1%SDS를 함유하는 50밀리몰 HEPES 완충액 45마이크로리터에 재현탁시킨다. 구슬을 섭씨 80도에서 15 분 동안 가열하십시오.인큐베이션 동안, 대략 다섯 분마다 튜브를 반전 또는 교반한 다음, 모든 튜브를 간단히 회전시킨다. 샘플이 여전히 따뜻하면 단백질을 함유 한 상청액을 수집하십시오. 상청액 43 마이크로 리터와 클릭 시약 마스터 믹스 7 마이크로 리터를 결합하고 섭씨 37도에서 30 분 동안 어둠 속에서 반응하게하십시오.웨스턴 플롯에서, 아실 사슬의 길이가 증가함에 따라 비누화 알키닐 지방산과 비누화되지 않은 알키닐 지방산 사이의 클릭 화학 검출을 위한 라벨링 효율에서 눈에 띄는 효과가 관찰되었다. 알키닐 스테아레이트로 표지된 세포에서, 지방산의 비누화 및 대사 표지를 위한 BSA로의 전달은 클릭 화학을 통한 S-아실화 단백질 신호의 검출 및 형광 아지토프로브에 의한 검출을 급격히 증가시켰으며, 이는 알키닐 지방산 표지의 세포 혼입의 전반적인 증가를 시사한다. 반대로, 가장 짧고 가장 가용성 지방산인 알키닐 미리스테이트로 처리된 세포에서는 눈에 띄는 차이가 관찰되지 않았다.알키닐 팔미테이트로 표지된 세포는 알키닐 미리스테이트에 비해 표지의 중간 증가를 나타내었지만, 알키닐 스테아레이트보다 적었다. 중요하게도, PVDF 막을 0.1몰 수산화칼륨으로 처리하면 알키닐 팔미테이트 및 알키닐 스테아레이트와 함께 배양된 세포로부터 지방산 라벨이 크게 제거되었고, 대부분의 신호가 에스테르 또는 티오에스테르 결합을 통해 이루어졌음을 확인하였다. 예상한 바와 같이, 알키닐 미리스테이트의 혼입은 아미드 결합을 통해 단백질에 미리스테이트의 부착으로 인해 대부분 알칼리 내성이었다.클릭 화학에 이어서, 야생형 미리스토일화 C-말단 헌팅턴 GFP의 미리스토일화는 용해물뿐만 아니라 면역침전물에서도 검출된 반면, G2A 돌연변이는 C-말단 헌팅턴 GFP의 미리스토일화를 완전히 차단하였다. 클릭 화학에 이어서, 우리는 질량 분광법을 위해 지방 아실화 단백질의 친화성 정제를 수행 할 수 있습니다. 이것은 독성으로부터 세포를 보호함으로써 지방 아실화 단백질의 상이한 프로파일을 산출할 수 있다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

아데노 바이러스 입자는 변칙적인 아미노산 아나로그의 azidohomoalanine 또는 azido 설탕 중 하나를 포함할 수 있도록...

Bioorthogonal 클릭 화학을 통해 바이러스성 표면 Chemoselective 변경

DNA 및 단백질 서열 특히 친 화성 또는 DNA 또는 단백질 methyltransferases 및 합성 보조 인자 (cofactor) 유사체를 사용하여 형광 기자 그룹으로 표시됩니다. 효소, 아지리 딘 또는 이중 활성 보조 인자 유사체의 특이성 팩터에 따라서는 1 또는 2 단계의 표시에 이용된다.

Methyltransferases과 공동 인자 유사체와 핵산과 단백질의 순서 특정 레이블

여기에서는 광친화성 라벨링을 사용하여 소분자 결합 단백질을 식별하는 방법을 설명합니다. 이 기술의 장점은 살아있는 세포 환경 내에서 표적 단백질의 결합 및 공유 라벨링이 발생하여 세포 용해 시 네이티브 단백질 구조 및 결합 조건을 파괴할 위험을 제거한다는 것입니다.

라이브 셀 Photoaffinity 라벨에 의해 기본 셀룰러 환경에서 작은 분자 결합 단백질의 식별

여기서는 활동 기반 프로브의 제조 및 사용을 설명 (ARN14686, 운데 10 ynyl- N - [(3- S) -2- oxoazetidin -3- 일] 카르 바 메이트)의 검출 및 정량화를 허용 염증성 효소 N -acylethanolamine 산 아미 다 아제의 활성 형태 (NAAA), 모두 생체 외 및 생체있다.

준비 및<em&gt; 생체</em&gt; 액티비티 기반 프로브의 사용을위한<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine 산 아미 다제

여기에서는 아지드 함유 아미노산을 유전적으로 통합한 후 균주 촉진 아지드-알킨 고리첨가(SPAAC)에 의해 아지드를 화학 프로브와 결합하여 항체 조각에 화학적 프로브를 부위 특이적으로 도입하는 프로토콜을 제시합니다.

효율적이고 사이트 별 스트레인 승진 아 지드 - 알킨 사이클로에 의해 항체 라벨링

손쉬운 형광 분석 결과 포유류 세포에 표현 된 단백질에 비정규-아미노산 (ncAAs)를 통합 하는 아미노-acyl-tRNA-합성/tRNA 쌍의 효율성을 평가 하 여. G-단백질 결합 수용 체 (GPCRs) 공부 ncAAs의 응용 프로그램, 바인딩 사이트 및 bioorthogonal GPCR 라이브 셀 라벨의 사진-가교 매핑을 포함 하 여 설명 합니다.

사진-가교 매핑 및 라이브 포유류 세포에서 Bioorthogonal 화학 GPCRs에 프로브 화학의 유전 결합을 최적화

증식은 세포 기능의 중요한 부분이며, 신약의 잠재적 독성을 평가하는 데 사용되는 일반적인 판독값입니다. 따라서 증식 측정은 세포 생물학에서 자주 사용되는 분석입니다. 여기에서 우리는 부착 및 비 부착 세포에서 사용될 수 있는 증식을 측정하는 간단하고 다양한 방법을 제시합니다.

클릭 화학을 사용하여 혈관 평활근 세포의 증식 측정

아실-RAC(Acyl-Resin Assisted Capture)는 다양한 생물학적 샘플에서 시스테인 잔류물(S-acylation)의 가역적 지질 변형을 검출하는 매우 민감하고 신뢰할 수 있으며 수행하기 쉬운 방법입니다.

아실-레신 보조 포획을 이용한 단백질 S-아실레이션 검출

여기에 제시된 것은 클릭 화학을 통해 디아실글리세릴 펩타이드와 알킨-인지질을 기질로 사용하여 아포지단백질 N-아실트랜스퍼라제 활성을 모니터링하기 위한 민감한 형광 분석입니다.

효소 특성화에서 고처리량 스크리닝까지 아포지단백질 N-아실트랜스퍼라제에 대한 클릭 화학 기반 형광 분석

이 프로토콜은 돌연변이 L274G-메티오닌 tRNA 신테타제(MetRS*)를 발현하는 마우스 라인을 사용하여 아지도노르류신(ANL)으로 세포 유형 특이적 단백질 표지를 수행하는 방법과 표지된 세포 유형 특이적 단백질 분리에 필요한 단계를 설명합니다. 살아있는 마우스에서 (1) 식수와 (2) 복강 주사로 두 가지 가능한 ANL 투여 경로를 설명합니다.

돌연변이 메티오닌 tRNA 신테타제 마우스 라인을 사용한 복합 조직으로부터의 세포형 특이적 단백질 정제 및 식별

특정 억제제를 스크리닝하기 위한 빠르고 정확한 화학 분석은 약물 개발 무기고에서 중요한 도구입니다. 여기에서는 HAT1 아세틸화 활성의 억제를 측정하기 위한 확장 가능한 아세틸 클릭 화학 분석을 제시합니다.

히스톤 아세틸전이효소 1 아세틸화를 측정하기 위한 아세틸 클릭 화학 분석

학습하세요 클릭 화학을 이용한 지방 아실화 단백질 검출 방법을 HEK-293T 세포에서. 비독성 BSA 복합체를 활용한 알키닐 지방산 유사체 혼입으로 긴 사슬 지방산의 검출 효율과 민감도를 크게 향상시킵니다.

클릭 화학을 이용한 지방 아실화 단백질의 검출을 위한 알키닐 지방산 유사체의 최적화된 혼입

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