Name: 포유류 세포에서 안정적인 광유전학적 유전자 회로를 안정적으로 엔지니어링하고 제어합니다. (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 배우세요 포유류 세포에서 광유전학적 유전자 회로를 설계하고 안정적인 세포주를 구축하는 방법을. 정확한 시공간적 유전자 발현 제어와 노이즈 감소를 통해 암 생물학 및 조직 분화 연구에 활용할 수 있습니다.

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우리는 의견과 제안에 대한 Balázsi 실험실, 첫 번째 LPA를 구성하는 데 도움을 준 Karl P. Gerhardt 박사와 Jeffrey J. Tabor 박사, LOV2-degron 플라스미드를 공유 한 Wilfried Weber 박사에게 감사드립니다. 이 연구는 국립 보건원 [R35 GM122561 및 T32 GM008444]의 지원을 받았다. The Laufer Center for Physical and Quantitative Biology; 그리고 국방 과학 및 공학 대학원 (NDSEG) 펠로우십. 오픈 액세스 요금에 대한 자금 조달 : NIH [R35 GM122561].
저자 기여도 : M.T.G.와 G.B.가 프로젝트를 구상했습니다. M.T.G., D.C., L.G.는 실험을 수행했다. M.T.G., D..C., L.G., G.B.는 데이터를 분석하고 원고를 준비했습니다. G.B.와 M.T.G.는 프로젝트를 감독했습니다.

저자들은 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

이 기사의 독자는 1) 유전자 회로 설계, 구축 및 검증을 포함하여 광유전학 유전자 회로 (및 다른 유전자 발현 시스템)를 특성화하는 데 필수적인 단계에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 2) 안정한 세포주 내로 유전자 회로를 도입하기 위한 세포 공학 (예를 들어, Flp-FRT 재조합); 3) LPA와 같은 광기반 플랫폼을 이용한 조작된 세포의 유도; 4) 형광 현미경을 통한 광 유도 분석의 초기 특성화; 및 5) 유세포 분석, 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR) 또는 면역형광 분석을 포함하는 다양한 분석을 통한 최종 유전자 발현 특성화.
추가적으로, 상기 요약된 방법들은 본질적으로 관심있는 유전자들을 발현하는 임의의 유전자 회로 아키텍처에 대해 고도로 모듈화되며, 회로 구축 단계 및 분석이 수행되는 주요 잠재적 프로토콜 변형을 갖는다. 유전자 회로 구축의 경우, 분자 클로닝의 유연성은 관심있는 모든 유전자가 프라이머 설계 또는 어셈블리 프로토콜에 대한 사소한 변형으로 형광 ...

다른 공학 분야와 마찬가지로, 합성 생물학은 프로토콜을 표준화하는 것을 목표로하며, 재현성이 높은 기능을 가진 도구를 생물학적 시스템과 관련된 질문을 탐구하는 데 활용할 수 있도록합니다1,2. 많은 조절 시스템이 구축된 합성 생물학의 한 도메인은 유전자 발현 조절3,4의 영역이다. 유전자 발현 조절은 단백질 수준과 가변성 (잡음 또는 변동 계수, CV = σ / μ, 평균에 대한 표준 편차로 측정)을 모두 타겟팅 할 수 있으며, 이는 생리 학적 및 병리학 적 세포 상태에서의 역할로 인해 중요한 세포 특성입니다5,6,7,8. 단백질 수준과 소음4,9,10,11,12을 제어할 수 있는 많은 합성 시스템이 설계되어 여러 도구에서 프로토콜을 표준화할 수 있는 기회를 창출했습니다.
최근에 등장한 유전자 네트워크를 제어 할 수있는 새로운 도구 세트 중 하나는 광유전학으로, 빛을 사용하여 유전자 발현을 제어 할 수 있습니다13,14,15,16,17. 그들의 화학적 전임자들과 유사하게, 광유전학적 유전자 회로는 박테리아에서 포유동물에 이르기까지 모든 세포 유형에 도입될 수 있어, 관심있는 임의의 하류 유전자의 발현을 허용한다18,19. 그러나, 새로운 광유전학적 도구의 급속한 생성으로 인해, 유전 회로 아키텍처, 발현 메카니즘(예를 들어, 플라스미드 기반 대 바이러스 통합) 및 광공급 제어 장비11,16,20,21,22,23,24,25에서 다양한 시스템이 등장하였다. . 따라서 이것은 유전자 회로 구축 및 최적화, 시스템 활용 방법 (예 : 통합 대 일시적인 발현), 유도에 사용되는 실험 도구 및 결과 분석과 같은 광유전 적 기능의 표준화를위한 여지를 남겨 둡니다.
포유동물 세포에서 광유전학 프로토콜의 표준화에 대한 진전을 이루기 위해, 이 프로토콜은 HEK293 세포(인간 배아 신장 세포주)에 통합된 음성 피드백(NF) 유전자 회로를 사용하여 포유동물 세포에서 광유전학 시스템을 엔지니어링하기 위한 실험 파이프라인을 기술한다. NF는 자연 계26,27,28이 매우 풍부하기 때문에 표준화를 입증하기에 이상적인 시스템으로, 단백질 수준을 조정하고 노이즈를 최소화할 수 있습니다. 간단히 말해서, NF는 그 자신의 발현을 충분히 빠르게 감소시키는 리프레서에 의한 정밀한 유전자 발현 조절을 허용하여, 정상 상태로부터 떨어져 있는 임의의 변화를 제한한다. 정상 상태는 각 유도제 농도에 대해 새로운 정상 상태에 도달 할 때까지 더 많은 단백질 생산을 허용하기 위해 리프레서를 비활성화하거나 제거하는 유도제에 의해 변경 될 수 있습니다. 최근에, 유전자 발현의 넓은 동적 반응을 생성하고, 저잡음을 유지하며, 공간 유전자 발현 제어의 잠재력을 허용하는 광 자극에 반응할 수 있는 조작된 NF 광유전학 시스템이 생성되었다11. 광유도성 튜너(LITers)로 알려진 이 도구들은 살아있는 세포4,10,29,30에서 유전자 발현 조절을 허용하고 장기적인 유전자 발현 조절을 보장하기 위해 인간 세포주에 안정적으로 통합된 초기 시스템에서 영감을 얻었다.
여기서, LITer를 일례로 사용하여, 광반응성 유전자 회로를 생성하고, 광플레이트 장치(LPA, 광유전학적 유도 하드웨어)31로 유전자 발현을 유도하고, 맞춤형 광 자극에 대한 조작된, 광유전학적으로 제어가능한 세포주의 반응을 분석하기 위한 프로토콜이 개략적으로 요약된다. 이 프로토콜을 통해 사용자는 탐색하려는 모든 기능 유전자에 대해 LITer 도구를 활용할 수 있습니다. 또한 아래에 요약된 방법 및 광유전학 장비를 통합함으로써 다양한 회로 아키텍처(예를 들어, 포지티브 피드백, 네거티브 조절 등)를 갖는 다른 광유전학 시스템에 적응될 수 있다. 다른 합성 생물학 프로토콜과 유사하게, 여기에 요약된 비디오 기록 및 광유전학 프로토콜은 암 생물학, 배아 발달 및 조직 분화를 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 분야의 단일 세포 연구에 적용될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>0.2 mL PCR 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>951010006</td><td>PCR</td></tr><tr><td>0.25% 트립신 EDTA 1X</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td> 포<td>유류 세포 0.5-10 & 수확을 위한 MT25053CI 시약</td></tr><tr><td>; L 조절 가능한 볼륨 피펫</td><td>Eppendorf</td><td>3123000020</td><td>피펫팅 반응에 사용되는 도구</td></tr><tr><td>100-1000 &mu; L 조절 가능한 부피 피펫</td><td>Eppendorf</td><td>3123000039</td><td>피펫팅 반응에 사용되는 도구</td></tr><tr><td>20-200 &mu; L 조절 가능한 부피 피펫</td><td>Eppendorf</td><td>3123000055</td><td>피펫팅 반응에 사용되는 도구</td></tr><tr><td>2-20 &mu; L 부피 조절 가능한 피펫</td><td>Eppendorf</td><td>3123000039</td><td>피펫 반응에 사용되는 도구</td></tr><tr><td>5 mL 폴리스티엔 라운드 바텀 튜브(Cell Strainer Cap 포함</td>) <td>Corning</td><td>352235</td><td>유세포분석용</td></tr><tr><td>시약 5702R Centrifuge, 4 x 100 로터, 15 및 50 mL 어댑터, 120 V</td><td>Eppendorf</td><td>22628113</td><td>포유류 배양 작업용 장비</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Denville Scientific</td><td>GR140-500</td><td>겔 전기영동용 시약</td></tr><tr><td>96웰 플레이트용 알루미늄 호일</td><td>VWR&reg;</td><td>60941-126</td><td>광 유도 실험에서 플레이트를 덮는 데 사용되는 도구</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9518-5G</td><td>시약 올바른 플라스미드로 박테리아를 선택하기 위한</td></tr><tr><td>아날로그 와류 믹서 Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>02215365PR</td><td>PCR, 형질전환 또는 겔 추출 반응을 운반하는 도구</td></tr><tr><td>Bacto Dehydrated Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0140010</td><td>시약 성장하는 박테리아</td></tr><tr><td>BD LSRAria</td><td>BD</td><td>656700</td><td>조작된 세포주를 단클론 집단으로 분류하기 위한 도구</td></tr><tr><td>BD LSRFortessa</td><td>BD</td><td>649225</td><td>조작된 세포주 BSA</td></tr><tr><td>, 소 혈청 알부민</td><td>정부 과학 IF</td><td>배양 완충액</td><td></td></tr><tr><td>용 SIGA4919-1G 시약세포 배양 플레이트 12-well, 투명, 평평한 바닥(뚜껑 포함), 폴리스티렌, 비발열성, 표준 TC</td><td>Corning</td><td>353043</td><td>플레이트 단클론 세포 성장에 사용됨</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>VWR</td><td>22628113</td><td>포유류 세포 배양용</td></tr><tr><td>기기 화학적 흄 후드</td><td>N/A</td><td>IF 반응 수행을 위한 N</td><td>/A</td> 기기</tr><tr><td>투명 세포 배양 플레이트 24 웰 평평한 바닥(뚜껑 포함</td>) <td>BD</td><td>353047</td><td>단클론 세포 성장에 사용되는 플레이트</td></tr><tr><td>CytoOne T25 필터 캡 TC 플라스크</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-4825</td><td>포유류 세포 성장용 용기</td></tr><tr><td>디메틸설폭사이드(DMSO)</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP231-100</td><td>엔지니어링 포유류 세포 동결에 사용되는 시약</td></tr><tr><td>Ethidium Bromide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15-585-011</td><td>겔 전기영동</td></tr><tr><td>용 시약Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, 뚜껑 포함</td><td>Corning</td><td></td><td>분류된 단클론 세포 성장을 위한 353072 용기</td></tr><tr><td>FCS Express</td><td>De Novo 소프트웨어:</td><td>유세포 분석 데이터 특성화를 위한 N</td><td>/A</td> 소프트웨어</tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 포</td><td>유류 세포</td><td></td><td></td> 성장을 위한 500 mL Corning 35-010-CV 시약</tr><tr><td>Fisherbrand 투명 뚜껑이 있는 페트리 접시 - 돌출된 능선; 100 x 15 mm</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>FB0875712</td><td>세균 성장 장비</td></tr><tr><td>Gibco&nbsp; DMEM, High Glucose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11-965-092</td> KRAS 동형 <td>포유류 세포 Hs00932330_m1 시약</td></tr><tr><td>Taqman 유전자 발현 분석</td><td>Life Technologies</td><td>4331182</td><td>qPCR 프로브</td></tr><tr><td>Hygromycin B(50mg/mL), 20mL</td><td>Life Technologies</td><td>10687-010</td><td>적절한 유전자 회로 통합으로 세포 선택을 위한 시약</td></tr><tr><td>iScript 역전사 슈퍼믹스</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1708890</td><td>RNA를 cDNA Laboratory Freezer로 전환하기 위한 시약</td></tr><tr><td>-20 &deg; C</td><td>VWR</td><td>76210-392</td><td>실험 시약 보관 장비</td></tr><tr><td>실험실 냉동고 -80 &deg; C</td><td>Panasonic</td><td>MDF-U74VC</td><td>실험 시약 보관용 장비</td></tr><tr><td>실험실 냉장고 +4 &deg; C</td><td>VWR</td><td>76359-220</td><td>실험 시약 보관용 장비</td></tr><tr><td>LB Broth(Lennox), 1kg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022-250G</td><td>박테리아 증식용 시약</td></tr><tr><td>LIPOFECTAMINE 3000</td><td>Life Technologies</td><td>L3000008</td><td>유전자 회로를 포유류 세포에 형질주입하기 위한 reagemt</td></tr><tr><td>MATLAB 2019</td><td>MathWorks</td> 실험 <td>데이터</td><td></td></tr> <tr><td>분석을 위한 N/A 소프트웨어</td><td>면역형광 반응용</td>메탄올 <td>Acros 유기물</td><td>413775000</td> 시약</tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브, 폴리프로필렌 1.7mL</td><td>VWR</td><td>20170-333</td><td>플라스틱 용기</td></tr><tr><td>Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman 유전자 발현 분석</td><td>Life Technologies</td><td>4331182</td><td>qPCR 프로브</td></tr><tr><td>MultiTherm Shaker</td><td>벤치마크 Scientific</td><td>H5000-HC</td><td>장비 박테리아 </td></tr><tr><td>DNA/RNA 농도 측정을 위한</td>변환<td>NanoDrop Lite 분광 광도계</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-NDL-US-CAN</td> 장비</tr><tr><td>NEB Q5 고충실도 DNA 중합효소 2x 마스터 믹스</td><td>NEB</td><td>M0492S</td><td>유전자 회로 단편 PCR용</td></tr><tr><td>시약 NEB10-beta 유능한 대장균(고효율)</td><td>New England Biolabs (NEB)</td><td>C3019H</td><td>유전자 회로 증폭을 위한 박테리아 세포 관심</td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td><td>New England Biolabs (NEB)</td><td>E2621L</td><td>유전자 회로 균열 결합용 시약</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti-E 도립 현미경과 DS-Qi2 카메라</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>유전자 발현을 정량화하는 N</td><td>/A</td> 기기</tr><tr><td>NIS-Elements</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td></td><td>형광 현미경 검사 데이터</td></tr><tr><td>올리고뉴클레오티드</td><td>IDT</td> 특성화를 위한 N/A <td>유전자 회로 구성 요소의 PCR에 사용되는 N</td><td>/A</td> 시약</tr><tr><td>Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ 시리즈 CO2 UV 및 H2O2 Control</td><td>Panasonic</td><td>MCO-170AICUVHL-PA</td><td>포유류 세포</td></tr> <tr><td>성장을 위한 기기파라포름알데히드, 16% 전자 현미경 등급</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15710-S</td><td>시약</td></tr><tr><td>PBS, 둘베코의 인산염 완충 식염수(D-PBS) (1x)</td><td>포</td><td>유류 세포 배양을 위한 인14190144 시약, IF 배양 완충액</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)</td>용 시약, 포<td>유류 세포</td><td></td><td></td> 성장을 위한 100x Fisher Scientific 15140-122 시약</tr><tr><td>1차 ERK 항체</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>4370S</td><td>면역형광을 위한 1차 ERK</td></tr><tr><td>항체 1차 KRAS 항체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WH0003845M1</td><td>면역형광을 위한 1차 KRAS 항체</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>정제 유전자 회로 플라스미드용 시약 키트</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>유전자 회로 단편 정제를 위한 시약 키트</td></tr><tr><td>QuantStudio 3 Real-Time PCR 시스템</td><td>Eppendorf</td><td>A28137</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>관련 정량 분석 앱</td>용 장비 <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>RNA</td><td>/cDNA 정량화를 위한 소프트웨어 N/A amplificaiton</td></tr><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td>키트, 조작된 포유류 세포의 RNA 추출을 위한</td></tr> 키트 <tr><td>2차 ERK 항체</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>8889S</td><td>면역형광용 2차 ERK 항체</td></tr><tr><td>2차 KRAS 항체</td><td>Invitrogen</td><td>A11005</td><td>면역형광용 2차 KRAS 항체</td></tr><tr><td>혈청학적 피펫 5.0mL</td><td>Olympus Plastics</td> 다양한 <td>화학 반응 설정에 사용되는</td><td>12-102</td> 시약</tr><tr><td>SmartView Pro Imager 시스템</td><td>주요 과학</td><td>UVCI-1200</td><td>올바른 PCR 밴드 이미징을 위한 도구</td></tr><tr><td>SnapGene Viewer(무료) 또는</td><td>SnapGene SnapGene</td><td>N/A</td><td>소프트웨어 DNA 염기서열 설계 및 분석</td></tr><tr><td>스테이지 상단 인큐베이터</td><td>Tokai Hit</td><td>INU-TIZ</td><td>PCR, 형질전환 또는 겔 추출 반응을 운반하는 도구</td></tr><tr><td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td><td>유전자 회로 단편의</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>PCR을 위한 Thermo Fisher Scientific 4444557 시약TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxn</td><td>Life Technologies</td><td>4326317E</td><td>qPCR probe</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Bio-1851148 Rad</td><td></td><td>PCR, 형질전환 또는 겔 추출 반응 운반용 도구</td></tr><tr><td>VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture Treated</td><td>PerkinElmer</td><td>1450-605</td><td>plate 광 유도에 사용 실험</td></tr><tr><td>VWR 일회용 파스퇴르 피펫, 유리, 붕규산 유리 피펫, 짧은 팁, 용량=2mL, 전체 길이=14.6cm</td><td>포유류 세포 배양을 위한</td><td>VWR</td><td>14673-010</td> 시약</tr><tr><td>VWR Mini 수평 전기영동 시스템, Mini10 겔 시스템</td><td>VWR</td><td>89032-290</td><td>DNA 겔 전기영동을 위한 장비</td></tr><tr><td>Flp-In 293</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R75007</td><td>FRT를 사용한 엔지니어링 세포주 사이트</td></tr></tbody></table>

포유류 세포에서 안정적인 광유전학적 유전자 회로를 안정적으로 엔지니어링하고 제어합니다.

Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells

포유동물 세포에서 신뢰할 수 있는 유전자 발현 조절은 사용된 방법에 관계없이 높은 배수 변화, 낮은 잡음 및 결정된 입출력 전달 기능을 갖는 도구를 필요로 한다. 이 목표를 향해, 광유전학적 유전자 발현 시스템은 지난 십 년 동안 포유동물 세포에서 단백질 수준의 시공간적 조절을 위해 많은 주목을 받았다. 그러나, 광유도 유전자 발현을 조절하는 대부분의 기존 회로는 구조적으로 다양하고, 플라스미드로부터 발현되며, 가변 광유전학 장비를 이용하여, 안정한 세포주에서 광유전학적 성분의 특성화 및 표준화를 탐구할 필요성을 창출한다. 여기서, 본 연구는 사례로서 음성 피드백 광유전학 회로를 이용하여 포유동물 세포에서 광유도성 유전자 발현을 조절하기 위한 신뢰할 수 있는 유전자 회로 구축, 통합 및 특성화의 실험 파이프라인을 제공한다. 이 프로토콜은 또한 광유전학 장비 및 광 정권을 표준화하는 것이 유전자 발현 잡음 및 단백질 발현 크기와 같은 유전자 회로 특징을 어떻게 확실하게 나타낼 수 있는지를 보여줍니다. 마지막으로,이 논문은 그러한 기술을 채택하고자하는 광유전학에 익숙하지 않은 실험실에 유용 할 수 있습니다. 여기에 설명된 파이프라인은 포유동물 세포에서 다른 광유전학 회로를 적용하여, 포유동물 세포에서 전사, 프로테오믹 및 궁극적으로 표현형 수준에서 유전자 발현의 보다 안정적이고 상세한 특성화 및 조절을 허용해야 한다.

유전자 회로 어셈블리 및 본 문서 내의 안정한 세포주 생성은 전사 활성, 단일 안정한 FRT 부위를 함유하는 상업적이고 변형된 HEK-293 세포에 기초하였다 (도 1). 유전자 회로는 플라스미드 내에 FRT 부위가 있는 벡터로 구축되어 HEK-293 세포 게놈 내로의 Flp-FRT 통합을 허용하였다. 이 접근법은 FRT 부위가 CRISPR/Cas950과 같은 DNA 편집 기술을 사용하여 게놈의 어느 곳에서나 관심있는 세포주에 추가될 수 있기 때문에 Flp-In 세포에만 국한되지 않습니다.
일단 적절한 세포주가 구축되고 정확한 삽입을 위해 검증되면, LPA 및 IRIS 소프트웨어는 유전자 발현31,51의 광 유도를 위한 표준화된 프로토콜로서 선택되었다. LPA 시스템은 광도, 펄스...

광-반응성 포유동물 세포를 안정적으로 제어하려면 광유전학적 방법의 표준화가 필요하다. 이러한 목표를 향하여, 본 연구는 유전자 회로 구축, 세포 공학, 광유전학 장비 운영 및 검증 분석의 파이프라인을 개괄하여 네거티브 피드백 광유전학 유전자 회로를 이용한 광유도 유전자 발현 연구를 사례 연구로 표준화한다.

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, ...

표준화 된 광유전학 프로토콜은 조작 된 포유류 세포 시스템에서 세포 특성을 제어하기 위해 빛을 자극으로 사용하는 데 관심이있는 실험실을 위해 설계되었습니다. 이 프로토콜은 광유전학에 익숙하지 않은 실험실에서 구현하기 쉽고 조작 된 생물학적 시스템의 정확한 공간 시간 제어를위한 방법을 제공합니다. 이 방법은 암 생물학, 시스템 생물학 및 조직 분화를 포함하여 시공간 정보가 중요 할 수있는 특정 연구 분야에서 광범위한 응용 프로그램을 가지고 있습니다.우선, 단일 유전자 회로 또는 플라스미드에 결합할 유전자 성분을 선택한다. 예를 들어, 포유동물 DNA 통합 부위, 광반응 요소, 또는 기능적 유전자. 시작 코돈, 조절 또는 번역 서열과 같은 필요한 모든 기능을 조립하고 검사 한 후 유전 공학 및 분자 클로닝 소프트웨어를 사용하고 나중에 사용할 수 있도록 DNA 서열에 주석을 달고 저장합니다.내장된 분자 클로닝 소프트웨어 기능, 예를 들어 서열 정렬을 통해 플라스미드 구축을 위한 프라이머를 계산적으로 검증한다. 안정한 세포주를 생성하기 위해, 유전자 회로 DNA의 리포좀 혼합물을 적절한 재조합효소와 함께 사용하여 설계 유전자 회로 및 목적 세포를 형질감염시킨다. 세포가 80 내지 100% 합류한 후, 세포를 45%오래된 배지, 45%신선한 배지 및 10%DMSO의 혼합으로 동결시킨다.나머지 세포를 멸균 튜브로 옮기고 단일 세포 분류를 수행하여 단일클론 세포를 96-웰 플레이트로 분리한다. 모노클로날 분류 후 약 두세 주 후, 96-웰 플레이트 내의 웰에는 초점이 있어야합니다. 50 ~ 60 %의 컨플루언시가 달성되면 세포를 12 웰 플레이트로 분할하십시오.마이크로 컨트롤러 프로그래머를 사용하여 조립된 LPA 회로에 펌웨어를 추가합니다. 그런 다음 장착 플레이트, 회로 기판, LED 스페이서, 플레이트 어댑터, 24웰 플레이트, 플레이트 뚜껑, 장착 볼트, 윙 너트 및 스태킹 구성 요소를 사용하여 조립 된 회로 기판에 3D 인쇄 된 부품을 결합하십시오. 광유전학 실험을 시작하려면 Tabor Lab 웹 사이트에서 사용할 수 있는 아이리스 소프트웨어를 사용하여 LPA용 SD 카드를 프로그래밍하고 적절한 조명 조건을 탐색합니다.그런 다음 원하는 실험 개요에 대한 기술 반복실험으로 강도 값을 입력합니다. 총 부피 500 마이크로리터의 24웰 블랙 플레이트에 웰당 약 75,000개의 세포를 첨가한 다음, 세포를 5% 이산화탄소가 있는 가습 배양기에 넣어 2~6시간 동안 침전시킬 수 있도록 한다. 배양이 끝날 때 조직 배양 후드에서 세포를 옮긴 후, 플라스틱 뚜껑을 제거하고 플레이트 상단에 접착 호일 스트립을 추가하여 웰 사이의 광 전달을 최소화하여 빛이 웰 하단에 위치한 LED를 통해서만 들어갈 수 있도록 합니다.플레이트를 LPA의 장착된 3D 부품에 놓은 다음 각 모서리의 장치 나사 위에 맞는 3D 인쇄된 LPA 뚜껑으로 플레이트를 덮습니다. 장치를 전원에 연결하고 LPA 장치의 재설정 버튼을 눌러 업데이트된 LPA 실험 설정이 적용되었는지 확인하고 셀을 인큐베이션합니다. 배양 후, 조직 배양 후드 내부에서, 플레이트로부터 호일 스트립을 제거하고, 플라스틱 뚜껑 상에 응축이 형성되는 것을 방지하기 위해 플레이트를 하나 내지 이분 동안 앉히게 한다.다음으로, 원래의 플라스틱 뚜껑을 다시 플레이트 위에 놓고 적절한 위상 대비 또는 형광 현미경으로 세포를 이미지화하십시오. 유도 후 24 내지 72시간 후, 트립신화에 이어서, 약 500 마이크로리터의 각 웰의 전체 내용물을 세포 스트레이너가 장착된 표지된 튜브로 옮긴다. 그런 다음 적절한 유세포 분석기 소프트웨어를 사용하여 전방 및 측면 산란 게이트를 만들어 파편과 세포 덩어리를 배제하기 위해 적절한 크기와 세분성의 단일 세포를 캡처합니다.게이트가 설정되면 적절한 게이트로 약 10, 000개의 세포를 포획하고 필요한 세포 데이터의 양에 따라 세포 수를 조정하고 각 튜브에서 실험 세포를 반복적으로 포획합니다. 유도 및 트립신화 후, 약 500 마이크로리터의 각 웰의 전체 내용물을 표지된 튜브로 옮긴다. 세포를 400회 G에서 5분 동안 원심분리하여 상층액을 버린 후, 샘플을 화학 흄 후드로 옮긴다.PBS에 희석된 750 내지 1, 000 마이크로리터의 4%PFA에 세포를 재현탁시키고 피펫을 여러 번 상하로 재현탁하여 세포 덩어리를 부수었다. 15분 배양 후, 750 내지 1, 000 마이크로리터의 PBS를 첨가하고, 다시 피펫을 여러 번 상하로 한 다음, 실온에서 400배 G에서 5분 동안 세포를 펠릿 다운시킨다. 상청액을 버린 후, 샘플을 화학적 흄 후드로 옮기고 입증된 바와 같이 세포를 750 내지 1, 000 마이크로리터의 얼음처럼 차가운 메탄올에 재현탁시키고, 세포를 섭씨 영하 20도 냉동고에서 30분 동안 앉히도록 한다.인큐베이션 후, 750 내지 1, 000 마이크로리터의 PBS를 첨가하면서 여러 번 위아래로 피펫팅하였다. 그 후 세포를 400배 G에서 5분 동안 원심분리한 후, 상층액을 버리고 샘플을 화학 흄 후드로 옮긴다. 세포를 100 마이크로리터 또는 다른 적합한 희석된 표지된 일차 항체 및 피펫을 여섯 내지 여덟 번 상하로 재현탁시킨 다음, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다.다음으로, 750 내지 1, 000 마이크로리터의 인큐베이션 버퍼 및 피펫 용액을 여러 번 상하로 가한 다음, 세포를 400회 G.Next에서 5분 동안 원심분리한 다음, 세포를 500 마이크로리터의 PBS에 재현탁시키고, 여러 번 위아래로 피펫팅하여 덩어리를 깨뜨린다. 각 튜브의 전체 내용물을 세포 스트레이너가있는 표지 된 튜브로 옮깁니다. 세포를 올바른 파장의 레이저로 적절한 유세포 측정 장비로 가져 오십시오.장치에 대해 광학 보정을 수행하였다. 획득한 이미지를 사용하여 LED에 대한 보정 값을 계산하고, 배경 신호를 빼고, 픽셀 강도를 추론했습니다. 변동 계수는 96웰 사이에서 최소였다.보정 소프트웨어는 위치별 LED 변화를 시연하고 각 LED가 동일한 강도로 정규화되도록 그레이스케일 조정을 생성했습니다. 유전자 발현은 LPA 상의 상이한 광 펄스 지속기간에서 형광 현미경을 통해 조작된 라이터 세포에서 유도되었고, 세포를 브라이트필드 및 GFP 발현에 대해 이미지화하였다. 유세포 분석기를 사용하여, 세포를 상이한 펄스 길이 값에서 유도하였고, 유도되지 않은 상태로부터의 네 배 이상의 변화의 집단 수준에서 정량화된 유전자 발현의 용량 반응을 나타내었다.다섯 배 이상의 유전자 발현 잡음 감소에 걸쳐 달성된 음성 피드백은 라이터 시스템에 대한 다양한 광 강도 값과 생생하거나 가벼운 것에 대한 비교함으로써 보여지는 바와 같다. qPCR 분석은 조작된 라이터 세포가 유도되지 않은 상태로부터의 열 배 이상의 유도와 함께 용량-반응성 방식으로 RNA 수준을 발현하고, 유세포 측정법 정량화와 일치한다는 것을 보여주었다. 조작된 라이터 유전자 회로는 청색광의 양이 증가하여 KRAS 단백질 수준과 인산화된 ERK 수치가 증가한 것으로 나타났습니다.성장, 세포 운동성, 상처 치유, 증식, 또는 침윤 검정을 포함하는 몇몇 기능적 분석이 수행될 수 있다. 이러한 방법은 암 생물학, 조직 분화 또는 약물 내성의 메커니즘에 대한 구체적인 통찰력을 제공 할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

유전학과 광학을 결합 신경 과학 도구의 최근 개발, 공간 및 시간 해상도의 전례없는 수준의 신경 회로의 활동을 제어 할 수 있습니다, "optogenetics"라고. 여기에서 우리는 전두엽 피질과 subicular 피라미드 뉴런의 유전 정의 된 부분 집합의 optogenetic 조작과 생체 녹화에 통합하기위한 프로토콜을 제공합니다.

개별 피라미드 뉴런의 고 충실도 Optogenetic 제어하는​​ 방법<em&gt; 생체 내</em

우리는 시험관 내에서 신경 세포 집단을 광자극하기 위해 광유전학적 접근 방식을 사용하여 전뇌 회로의 기능적 지형 및 시냅스 특성을 특성화하는 방법을 설명합니다.

광유전학적으로 표적화된 전뇌 회로의 레이저 스캐닝 광자극

광유전학은 행동 신경과학 실험에 사용할 수 있는 강력한 도구가 되었습니다. 이 프로토콜은 레이저 시스템의 설계 및 설정에 대한 단계별 가이드를 제공하며, 대부분의 설치류 행동 테스트 패러다임과 호환되는 다중 및 동시 생체 내 광유전학적 자극을 수행하기 위한 전체 프로토콜을 제공합니다.

설치류 중추 신경계의 생체 Optogenetic 자극

이 프로토콜은 광유전학적 기능적 자기공명영상(ofMRI)을 성공적으로 수행하는 데 필요한 단계와 데이터 분석을 설명합니다. ofMRI는 고자기장 fMRI 판독과 광유전학적 자극을 결합한 새로운 기술로, 살아있는 뇌 전체에 걸쳐 기능적 신경 회로와 그 역학의 세포 유형별 매핑을 가능하게 합니다.

Optogenetic 기능 MRI

이 프로토콜은 세포 분화 및 Xenopus 배아 발달 동안 mitogen - 활성화 단백질 키니 아제 (MAPK) 활동을 조절하는 optogenetic 전략을 설명합니다. 이 방법은 포유류 세포 배양 및 높은 공간적 및 시간적 해상도를 갖는 Xenopus 태아와 같은 다세포 생균에서 MAPK 신호 전달 경로의 가역적 활성화를 허용한다.

세포 분화 동안 미토 겐 활성 단백질 키나아제 경로의 광 매개 가역적 변조<em&gt; Xenopus</em&gt; 배아 발달

여기, 우리 optogenetic 컨트롤의 진동 정보 셀 전송 분석 및 유전자 발현의 모니터링 라이브 프로토콜을 제시. 이 방법은 다세포 시스템에서 동적 유전자 식 프로그램의 기능적 중요성을 테스트 하려면 독특한 플랫폼을 제공 합니다.

제어 하 고 셀 상호 작용에서 유전자 표현 패턴을 분석 하는 Optogenetic 메서드

여기에서 우리는 마우스에 있는 optogenetics를 사용하여 장소 환경 설정 패러다임에 대한 2개의 따르기 쉬운 단계별 프로토콜을 제시합니다. 이러한 두 가지 설정을 사용하여, 선호도 및 회피 거동은 높은 공간 및 시간 선택성을 가진 동일한 장치 내에서, 그리고 간단한 방식으로 단단히 평가될 수 있다.

마우스의 복부 테그멘탈 영역 내에서 광유전학을 사용하는 두 가지 실시간 장소 선호 패러다임

특정 신경 인구 또는 뇌 영역의 광유전학 적 조작으로, 행동은 자유롭게 움직이는 동물에 있는 높은 시간 및 공간 해상도로 수정될 수 있습니다. 만성 이식 된 광섬유와 함께 다른 광유전학 도구를 사용하여 다양한 신경 변조 및 행동 테스트를 수행 할 수 있습니다.

자유롭게 움직이는 마우스에 있는 행동을 조절하기 위하여 신경 활동의 광유전학 조작

미생물 대사의 광유전학적 조절은 발효 과정에 대한 유연한 동적 제어를 제공합니다. 여기의 프로토콜은 다양한 부피 규모에서 화학 및 단백질 생산을위한 청색광 조절 발효를 설정하는 방법을 보여줍니다.

미생물 화학 및 단백질 생산을 위한 광 조절 발효

이 프로토콜은 단백질 활성의 가역적 시공간 제어를 위해 엔지니어링된 청색광 활성화 알로스테릭 스위치(LightR) 도메인의 적용을 설명합니다. 이 연구는 Src 티로신 키나아제를 모델로 활용하여 광 조절 Src(LightR-Src)를 개발하고 특성화하기 위한 정교한 프로토콜을 제공합니다. 이는 효소 종류 전반에 걸쳐 이 접근법의 다양성을 보여줍니다.

Optogenetic Allosteric Regulation을 통한 단백질 활성의 시공간 제어

이 연구는 HEK293T 세포에서 빛 유도 유전자 발현을 최적화하기 위해 3D 프린팅 LED 어레이를 사용하는 고처리량 실험 방법을 설명합니다.

포유류 유전자 발현을 제어하기 위한 광유도 시스템의 신속한 최적화

배우세요 포유류 세포에서 광유전학적 유전자 회로를 설계하고 안정적인 세포주를 구축하는 방법을. 정확한 시공간적 유전자 발현 제어와 노이즈 감소를 통해 암 생물학 및 조직 분화 연구에 활용할 수 있습니다.

포유류 세포에서 안정적인 광유전학적 유전자 회로를 안정적으로 엔지니어링하고 제어합니다.

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