포유류 세포에서 안정적인 광유전학적 유전자 회로를 안정적으로 엔지니어링하고 제어합니다.

표준화 된 광유전학 프로토콜은 조작 된 포유류 세포 시스템에서 세포 특성을 제어하기 위해 빛을 자극으로 사용하는 데 관심이있는 실험실을 위해 설계되었습니다. 이 프로토콜은 광유전학에 익숙하지 않은 실험실에서 구현하기 쉽고 조작 된 생물학적 시스템의 정확한 공간 시간 제어를위한 방법을 제공합니다. 이 방법은 암 생물학, 시스템 생물학 및 조직 분화를 포함하여 시공간 정보가 중요 할 수있는 특정 연구 분야에서 광범위한 응용 프로그램을 가지고 있습니다.

우선, 단일 유전자 회로 또는 플라스미드에 결합할 유전자 성분을 선택한다. 예를 들어, 포유동물 DNA 통합 부위, 광반응 요소, 또는 기능적 유전자. 시작 코돈, 조절 또는 번역 서열과 같은 필요한 모든 기능을 조립하고 검사 한 후 유전 공학 및 분자 클로닝 소프트웨어를 사용하고 나중에 사용할 수 있도록 DNA 서열에 주석을 달고 저장합니다.

내장된 분자 클로닝 소프트웨어 기능, 예를 들어 서열 정렬을 통해 플라스미드 구축을 위한 프라이머를 계산적으로 검증한다. 안정한 세포주를 생성하기 위해, 유전자 회로 DNA의 리포좀 혼합물을 적절한 재조합효소와 함께 사용하여 설계 유전자 회로 및 목적 세포를 형질감염시킨다. 세포가 80 내지 100% 합류한 후, 세포를 45%오래된 배지, 45%신선한 배지 및 10%DMSO의 혼합으로 동결시킨다.

나머지 세포를 멸균 튜브로 옮기고 단일 세포 분류를 수행하여 단일클론 세포를 96-웰 플레이트로 분리한다. 모노클로날 분류 후 약 두세 주 후, 96-웰 플레이트 내의 웰에는 초점이 있어야합니다. 50 ~ 60 %의 컨플루언시가 달성되면 세포를 12 웰 플레이트로 분할하십시오.

마이크로 컨트롤러 프로그래머를 사용하여 조립된 LPA 회로에 펌웨어를 추가합니다. 그런 다음 장착 플레이트, 회로 기판, LED 스페이서, 플레이트 어댑터, 24웰 플레이트, 플레이트 뚜껑, 장착 볼트, 윙 너트 및 스태킹 구성 요소를 사용하여 조립 된 회로 기판에 3D 인쇄 된 부품을 결합하십시오. 광유전학 실험을 시작하려면 Tabor Lab 웹 사이트에서 사용할 수 있는 아이리스 소프트웨어를 사용하여 LPA용 SD 카드를 프로그래밍하고 적절한 조명 조건을 탐색합니다.

그런 다음 원하는 실험 개요에 대한 기술 반복실험으로 강도 값을 입력합니다. 총 부피 500 마이크로리터의 24웰 블랙 플레이트에 웰당 약 75,000개의 세포를 첨가한 다음, 세포를 5% 이산화탄소가 있는 가습 배양기에 넣어 2~6시간 동안 침전시킬 수 있도록 한다. 배양이 끝날 때 조직 배양 후드에서 세포를 옮긴 후, 플라스틱 뚜껑을 제거하고 플레이트 상단에 접착 호일 스트립을 추가하여 웰 사이의 광 전달을 최소화하여 빛이 웰 하단에 위치한 LED를 통해서만 들어갈 수 있도록 합니다.

플레이트를 LPA의 장착된 3D 부품에 놓은 다음 각 모서리의 장치 나사 위에 맞는 3D 인쇄된 LPA 뚜껑으로 플레이트를 덮습니다. 장치를 전원에 연결하고 LPA 장치의 재설정 버튼을 눌러 업데이트된 LPA 실험 설정이 적용되었는지 확인하고 셀을 인큐베이션합니다. 배양 후, 조직 배양 후드 내부에서, 플레이트로부터 호일 스트립을 제거하고, 플라스틱 뚜껑 상에 응축이 형성되는 것을 방지하기 위해 플레이트를 하나 내지 이분 동안 앉히게 한다.

다음으로, 원래의 플라스틱 뚜껑을 다시 플레이트 위에 놓고 적절한 위상 대비 또는 형광 현미경으로 세포를 이미지화하십시오. 유도 후 24 내지 72시간 후, 트립신화에 이어서, 약 500 마이크로리터의 각 웰의 전체 내용물을 세포 스트레이너가 장착된 표지된 튜브로 옮긴다. 그런 다음 적절한 유세포 분석기 소프트웨어를 사용하여 전방 및 측면 산란 게이트를 만들어 파편과 세포 덩어리를 배제하기 위해 적절한 크기와 세분성의 단일 세포를 캡처합니다.

게이트가 설정되면 적절한 게이트로 약 10, 000개의 세포를 포획하고 필요한 세포 데이터의 양에 따라 세포 수를 조정하고 각 튜브에서 실험 세포를 반복적으로 포획합니다. 유도 및 트립신화 후, 약 500 마이크로리터의 각 웰의 전체 내용물을 표지된 튜브로 옮긴다. 세포를 400회 G에서 5분 동안 원심분리하여 상층액을 버린 후, 샘플을 화학 흄 후드로 옮긴다.

PBS에 희석된 750 내지 1, 000 마이크로리터의 4%PFA에 세포를 재현탁시키고 피펫을 여러 번 상하로 재현탁하여 세포 덩어리를 부수었다. 15분 배양 후, 750 내지 1, 000 마이크로리터의 PBS를 첨가하고, 다시 피펫을 여러 번 상하로 한 다음, 실온에서 400배 G에서 5분 동안 세포를 펠릿 다운시킨다. 상청액을 버린 후, 샘플을 화학적 흄 후드로 옮기고 입증된 바와 같이 세포를 750 내지 1, 000 마이크로리터의 얼음처럼 차가운 메탄올에 재현탁시키고, 세포를 섭씨 영하 20도 냉동고에서 30분 동안 앉히도록 한다.

인큐베이션 후, 750 내지 1, 000 마이크로리터의 PBS를 첨가하면서 여러 번 위아래로 피펫팅하였다. 그 후 세포를 400배 G에서 5분 동안 원심분리한 후, 상층액을 버리고 샘플을 화학 흄 후드로 옮긴다. 세포를 100 마이크로리터 또는 다른 적합한 희석된 표지된 일차 항체 및 피펫을 여섯 내지 여덟 번 상하로 재현탁시킨 다음, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다.

다음으로, 750 내지 1, 000 마이크로리터의 인큐베이션 버퍼 및 피펫 용액을 여러 번 상하로 가한 다음, 세포를 400회 G.Next에서 5분 동안 원심분리한 다음, 세포를 500 마이크로리터의 PBS에 재현탁시키고, 여러 번 위아래로 피펫팅하여 덩어리를 깨뜨린다. 각 튜브의 전체 내용물을 세포 스트레이너가있는 표지 된 튜브로 옮깁니다. 세포를 올바른 파장의 레이저로 적절한 유세포 측정 장비로 가져 오십시오.

장치에 대해 광학 보정을 수행하였다. 획득한 이미지를 사용하여 LED에 대한 보정 값을 계산하고, 배경 신호를 빼고, 픽셀 강도를 추론했습니다. 변동 계수는 96웰 사이에서 최소였다.

보정 소프트웨어는 위치별 LED 변화를 시연하고 각 LED가 동일한 강도로 정규화되도록 그레이스케일 조정을 생성했습니다. 유전자 발현은 LPA 상의 상이한 광 펄스 지속기간에서 형광 현미경을 통해 조작된 라이터 세포에서 유도되었고, 세포를 브라이트필드 및 GFP 발현에 대해 이미지화하였다. 유세포 분석기를 사용하여, 세포를 상이한 펄스 길이 값에서 유도하였고, 유도되지 않은 상태로부터의 네 배 이상의 변화의 집단 수준에서 정량화된 유전자 발현의 용량 반응을 나타내었다.

다섯 배 이상의 유전자 발현 잡음 감소에 걸쳐 달성된 음성 피드백은 라이터 시스템에 대한 다양한 광 강도 값과 생생하거나 가벼운 것에 대한 비교함으로써 보여지는 바와 같다. qPCR 분석은 조작된 라이터 세포가 유도되지 않은 상태로부터의 열 배 이상의 유도와 함께 용량-반응성 방식으로 RNA 수준을 발현하고, 유세포 측정법 정량화와 일치한다는 것을 보여주었다. 조작된 라이터 유전자 회로는 청색광의 양이 증가하여 KRAS 단백질 수준과 인산화된 ERK 수치가 증가한 것으로 나타났습니다.

성장, 세포 운동성, 상처 치유, 증식, 또는 침윤 검정을 포함하는 몇몇 기능적 분석이 수행될 수 있다. 이러한 방법은 암 생물학, 조직 분화 또는 약물 내성의 메커니즘에 대한 구체적인 통찰력을 제공 할 수 있습니다.