Name: 에체리치아 대장균의 유전코드 확장을 이용한 뉴클레오소성 재구성을 위한 히스톤의 특정 리신 아세틸화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: 배우세요 에체리치아 대장균에서 유전코드 확장을 이용한 히스톤 H3의 특정 리신 아세틸화 방법입니다. 아세틸화된 단일 뉴클레오소몬을 재구성하여 후성유전학적 메커니즘과 단백질 상호작용 연구에 활용할 수 있습니다.

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웨슬리 왕 박사에게 이 프로토콜과 그의 소중한 멘토링에 대한 기초를 마련해 주신 것에 감사드립니다. 이 작품은 부분적으로 건강의 국가 학회에 의해 지원되었다 (보조금 R01GM127575 및 R01GM121584) 및 웰치 재단 (그랜트 A-1715).

1. 플라스미드 건설
<ol><li>어떤 히스톤 단백질이 아세틸화되고 어떤 리신 부위를 결정할지 결정하십시오. 사이트 지시 돌연변이 발생을 사용하여 황색 정지 코돈 (TAG)에 사이트를 돌연변이. 참고: 히스톤 단백질의 발현에 활용된 4개의 이전에 디자인된 플라스미드가 있습니다. 4개의 히스톤 단백질은 모두 N-단말 히스티딘 태그로 pETDuet-1 벡터로 복제하였다. Histone H4에는 또한 SUMO 태그, 약 40의 카피 번호가 있는 복제 colE1의 기원, 암피실린 내성 및 T7 프로모터가 포함되어 있습니다.<ol>
<li>4개의 히스톤 단백질 플라스미드 중 하나에서 원하는 부위(기존 리신 코동을 호박스톱 코돈으로 교체)에서 TAG 돌연변이를 포함하는 전방 및 역프라이머를 설계한다.</li>
		<li>플라스미드가 포함된 태그를 증폭시키기 위해 전체 플라스미드 PCR을 사용합니다. 프라이머에 적합한 어닐링 온도를 결정합니다. 일반적으로, 프라이머의 용융온도(Tm)는5°C를 뺀 값으로 충분할 것이다. 어려움이 PCR 생성물을 얻는 데 어려움이 있는 경우, Tm-5°C 주위의 온도 그라데이션을 사용하여 증폭을 위한 어닐링 온도를 최적화할 수 있습니다. 참고:본 실험에서 사내 발현PFU 폴리머라제는 30초(데니션레이션), 30초동안 의 온도 34°C, 6분 동안 72°C(또는 킬로베이스 쌍당 1분)를 사용하여 30사이클에 사용되었다. PCR 방법의이 유형에 대한 자세한 내용은 리우와 나이 스미스7을참조하십시오.</li>
		<li>제조업체의 프로토콜을 따라 PCR 정리 키트로 PCR 제품을 정리합니다. 아가로즈 젤 전기포진및 후속 에디튬 브로마이드 염색에 의해 PCR 제품을 분석한다.</li>
		<li>16°C에서 하룻밤 사이에 T4 리게아제로 배양하여 플라스미드를 리게이트합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>먼저 플라스미드(AmpR)를함유한 태그를 화학적으로 유능한 대장균으로 변환한다. 변환에서 최소 4 개의 식민지를 선택하고 플라스미드를 정화합니다. 표준 방법을 사용하여 글리세롤을 사용하여 각각의 세포 주식을 만들고 -80 °C에 보관하십시오. 원하는 TAG 돌연변이를 확인하기 위해 시퀀싱을 위해 보냅니다.</li>
	<li>시퀀스가 확인되면, PEVOL-AckRS(ChlR)를사용하여 태그 함유 플라스미드(AmpR)를화학적으로 유능한 CobB로 공동 변환합니다(대장균에 알려진 유일한 히스톤 리신 deacetylase)을 열 쇼크 방법을 사용하여 BL21 세포를 삭제한다. pEVOL은 낮은 복사 번호 p15A 원점으로 중간 복사 번호가 있는 플라스미드입니다. 참고: 플라스미드의 pEVOL 시리즈는 정형간 aaRS/tRNA티르 쌍의 증가발현을 보여 준 이전 연구를 기반으로 생성되었으며 단백질 잘림을 감소시키고 돌연변이단백질8의 전반적인 수율을 증가시키는 데 효과적이었다. CobB 삭제 세포가 접근할 수 없는 경우 화학적으로 유능한 BL21 세포를 진행하십시오. CobB는 시르투인과 같은 히스톤 리신 데아실라제와 니코티닌아미드를 5mM 최종 농도로 첨가하여 CobB를 대체접근법9로억제할 수 있다.</li>
	<li>셀 스톡을 만들고 -80 °C에 보관하십시오.</li>
</ol>2. 아세틸화 히스톤 단백질 발현
<ol><li>문화 플라스크에서 오토클레이브 2YT 미디어(또는 선택량)의 L 1L을 준비합니다.</li>
	<li>태그 함유 플라스미드(AmpR)및 pEVOL-AckRS(ChlR)를가지는 공동 변형된 세포 육수와 적절한 항생제를 함유하고 있으며, 37°C에서 OD=0.6(4-6h)으로 성장시키는 2YT 매체의 20mL을 접종한다.</li>
	<li>20mL 스타터 배양으로 1L의 오토클레이브 2YT 배지에 적절한 항생제를 추가하고 접종한다. 37°C에서 OD = 0.6-0.8(2-3h)으로 성장한다.</li>
	<li>IPTG 1 mM, 0.2% 아라비노스 및 AcK 5 mMM의 최종 농도에 유도 제및 아세틸리신(AcK)을 첨가합니다.</li>
	<li>6-8 h에 대한 37 °C에서 배양 성장.</li>
	<li>펠릿 셀은 15 분 동안 2,700 x g에서. </li>
	<li>셀 펠릿을 하룻밤 -80°C에 보관합니다.</li>
	<li>이 단계에서부터 는 항상 얼음에 샘플을 유지합니다. 세포의 1L당 히스톤 용해 버퍼의 50mL에 셀 펠릿을 용해시키십시오.</li>
	<li>다음 주기에 따라 초음파 처리: 1 에, 1 s off, 정시에 총: 3 분 에 60% 진폭.</li>
	<li>펠릿 포함 바디 41,600 x g 45 분 동안.</li>
	<li>상체를 버리고 포함 바디를 히스톤 리시스 버퍼의 30mL로 재일시 중단합니다. 펠릿 포함 몸통은 41,600 x g에서 30 분 동안.</li>
	<li>상체를 버리고 펠릿 세척 버퍼의 30 mL에 포함 시체를 다시 중단합니다. 펠릿 포함 바디는 41,600 x g에서 30 분 동안.</li>
	<li>6M 구아니딘 염산염(GuHCl) 버퍼의 25mL에 초상체를 폐기하고 포함 체체를 용해한다. 1 h에 대 한 37°C에서 교반으로 배양. 참고: 필요한 경우 포함 바디는 4°C에서 하룻밤 사이에 교반으로 배양될 수 있습니다.</li>
	<li>펠릿 포함 몸통 41,600 x g 45 분. 2h에 대한 6 M GuHCl 버퍼와 함께 평형 Ni-NTA 수지의 1 mL와 상류층을 배양.</li>
	<li>변성 조건하에서 Ni-NTA 정화를 진행합니다. 열 세척 버퍼의 3 열 볼륨으로 열을 세척합니다. 엘루테 아세틸리히스톤 단백질10mL용출버퍼. 참고 : 여기에 단백질을 집중하려고 시도하는 것은 옵션이지만 아세틸화 된 히스톤은 매우 예측할 수 없으며 쉽게 침전 할 수 있습니다. 총 부피 2mL를 지나서 집중하지 않는 것이 좋습니다.</li>
	<li>염을 제거하기 위해 5 % 아세트산 버퍼에 대한 아세틸화 히스톤 단백질을 광범위하게 투석합니다. 4°C에서 한 번에 3시간 동안 투석하여 최소 6회 신선한 버퍼로 교환합니다. 참고: 단백질 순도향상을 위해 순수한 물과 투석을 할 수 있는 옵션이 있습니다. 그러나, 이것은 낮은 항복 아세틸화 히스톤 단백질에 대 한 바람직하지 않을 수 있습니다 수율에 상당한 강수량 및 감소를 일으키는 원인이.</li>
	<li>알리쿼트와 리오필화 단백질을 - 80°C에서 무기한 보관하십시오. 야생 형 히스톤 단백질은 일반적으로 10-50 mg /L을 산출하는 반면 아세틸화 히스톤 단백질은 특정 lysine 부위에 따라 10 mg / L 미만을 산출합니다. 예를 들어, H3K79Ac 평균 5 mg/L.</li>
</ol>3. 와일드 타입 히스톤 단백질 발현
<ol><li>전체 뉴클레오좀을 조립하려면 4개의 히스톤 단백질을 모두 표현하십시오. 야생 형 히스톤을 표현하고 정화 할 때 프로토콜은 다음을 제외하고 아세틸화 된 히스톤과 동일합니다.<ol>
<li>공동 변환을 수행하지 마십시오. 야생 형 히스톤 표현에 pEVOL-AcKRS를 사용하지 마십시오. 그에 따라 항생제를 조정합니다.</li>
		<li>세포 발현을 유도하는 동안 CobB 삭제 세포주를 사용하거나 니코티나미드, AcK 또는 아라비노스를 추가하지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 601 DNA 준비
참고: 이전에 설계된 최적화된 DNA 서열이 핵분포지셔닝을 지시하여 히스톤 옥타머로 조립되어 고효율의 단핵구를 생성합니다. 이 서열은 601 DNA 또는 Widom 서열이라고 합니다. 이 서열은 크로마티닌 리모델링 소세포에서 단일 분자측정(10)에이르는 뉴클레오좀의 체외 연구를 위한 표준 DNA 서열이 되었다.
<ol><li>뉴클레오소성 어셈블리를 위한 601 DNA의 상당량을 준비하려면 pGEM-3z/601을 상위 10개 세포로 변환하고 플라스미드 증폭 및 추출을 위한 10mL의 배양을 성장시킨다. 플라스미드 추출 키트를 사용하고 제조업체의 권장 사항을 따르십시오.</li>
	<li>이 증폭 프로토콜에 대해 사내 발현 PFU 폴리머라제(보다 효율적)를 사용하십시오. PCR 반응 설정: 250 μL 반응의 경우 207.5 μL 오토클레이브 MQ H2O, 25 μL 10x PFU 버퍼, 5 μL 포워드 프라이머: ctggagaatcccggtgccg, 5 μL 역 프라이머: 아카게타타트타트ctgacacg, 5μL dNTP 믹스, 2.5 μL PFU를 사용하십시오. 우리는 일반적으로 조립하기에 충분한 DNA를 얻기 위하여 한 번에 60의 반응을 실행합니다.</li>
	<li>PFU 폴리머라아제사용시 30s의 연장 시간 동안 52°C의 어닐링 온도를 사용하고 30s의 연장 시간을 사용한다. 그렇지 않으면 제조업체권장 조건을 따릅니다.</li>
	<li>PCR이 완료되면 PCR 제품을 정화하기 위해 선택한 PCR 정리 키트를 사용합니다.</li>
</ol>5. 히스톤 옥타머 의 조립
<ol><li>히스톤 단백질 펠릿 H2A, H2B, H3 및 H4의 알리쿼트를 용해하여 GuHCl 버퍼에 각 히스톤 단백질의 별도의 재고가 100 μL의 총 부피를 가지게 된다.</li>
	<li>A280 흡광도를 측정하여 각 히스톤 단백질의 농도를 계산합니다.</li>
	<li>흡수율이 단백질에 대해 1보다 크면 GuHCl 버퍼로 희석하여 보다 정확한 농도를 얻습니다.</li>
	<li>H2A와 H2B 단백질을 1:1 어어 비율로 결합하고 총 단백질 농도4 μg/μL로 희석합니다.</li>
	<li>하룻밤 동안 2M TE 버퍼에 대해 4 °C에서 순차적으로 투석하고, 2 h용 1 M TE 버퍼, 5 h용 0.5 M TE 버퍼. 참고: 투석의 두 번째 및 세 번째 단계는 단백질의 불안정한 적합성을 유발하여 밖으로 침전시합니다. 이 단계에서 무거운 강수량을 볼 것으로 예상된다.</li>
	<li>4°C에서 16,800 x g에서 원심분리로 침전을 제거합니다.</li>
	<li>다시, A280 흡광도를 측정하는 히스톤 디머(H2A/H2B 혼합물) 및 테트라머(H3/H4 혼합물)의 농도를 계산한다.</li>
	<li>1:1 어어 비율로 디머와 테트라머를 혼합하고 솔리드 NaCl을 추가하여 NaCl에서 2M로 조정합니다.</li>
	<li>히스톤 옥타머는 4°C에서 보관할 수 있으며 디머와 테트라머보다 더 안정적입니다. 이 분해를 일으킬 수 있으므로 히스톤 옥타머를 동결하지 마십시오.</li>
	<li>아세틸화 히스톤으로 조립하는 경우 야생 단백질을 절차에서 아세틸화 단백질로 교체하기만 하면 됩니다.</li>
</ol>6. 뉴클레오소이스 어셈블리
<ol><li>100x TE 버퍼와 솔리드 NaCl을 사용하여 601 DNA를 2M TE 버퍼로 조정합니다. 0.85:1 ~0.90:1의 어금니 비율로 히스톤 옥타머에 2M TE 버퍼로 601 DNA를 추가합니다. 무료 DNA가 젤 시프트 분석에 존재하는 경우 DNA의 낮은 비율이 추가될 수 있다.</li>
	<li>DNA-히스톤 혼합물을 투석 봉투를 옮기고 약 200mL의 2M TE 버퍼(또는 여러 샘플을 조립하는 경우) 4°C에서 매우 부드럽게 저어줍니다.</li>
	<li>연동 펌프를 설정하여 소금 TE 버퍼없이 천천히 떨어 뜨립니다. 볼륨이 약 두 배가되면 볼륨의 절반을 부어 넣습니다. 총 4회 이상 이 작업을 수행합니다. 펌프를 사용하면 시작 볼륨에 따라 4-8 h가 걸릴 수 있습니다. 핵소는 염분 농도가 150mMM로 감소될 때 형성됩니다(염도 계측기로 측정).</li>
	<li>염 농도가 150mM로 감소한 후 밤새 20mM TE 버퍼에 대해 투석한다.</li>
	<li>원심분리에 의한 침전을 제거하고 플레이트 판독기를 사용하여 A260 을 판독하여 뉴클레오좀의 농도를 측정한다.</li>
	<li>그의-TEV 프로테아제 (TEV를 추가 : 뉴클레오소1:30, w :w) 모든 히스티딘 태그를 제거하기 위해 4 ° C에서 하룻밤 배양. Ni-NTA 수지풀다운에 의한 뉴클레오소성 용액으로부터 히스티딘 태그 불순물을 제거합니다.</li>
	<li>뉴클레오좀을 배치하고 시료를 균질화하기 위해, 1 h에 대해 60°C에서 배양한다. 참고: 특히 불안정한 아세틸화된 사이트의 경우 이 단계를 권장하지 않을 수 있습니다.</li>
	<li>4°C에서 단기(몇 주)에 뉴클레오좀을 저장한다.</li>
	<li>장기 저장을 위해, 저장 버퍼에 대한 뉴클레오좀을 투석하고 -80 °C에 저장합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자중 누구도 선언할 경쟁적인 재정적 이해관계는 없습니다.

실험 중에 이 프로토콜을 모든 세부 사항으로 따르는 것이 필수적입니다. 뉴클레오좀은 매우 안정적이지 않으며 많은 시행착오가 이 프로토콜을 결정하는 데 들어갔습니다. 미립자가 조립 공정을 쉽게 방해할 수 있기 때문에 모든 단계(또는 관찰 될 때마다)에서 침전을 제거하는 것이 중요합니다. 항상 얼음에 히스톤 샘플을 유지합니다. 뉴클레오좀이 너무 오래 4°C로 저장되면 자발적으로 분해될 수 있습니다. 어떤 실험에서 사용하기 전에 4 °C에 저장된 경우 네이티브 PAGE에 의해 어떤 샘플을 확인해야합니다. 이것은 또한 분해하는 원인이 될 수 있기 때문에 옥타머와 뉴클레오좀을 소용돌이피하십시오. 문제가 어렴풋이 조립 발생 하는 경우, 테트라머, 또는 옥타머이것은 일반적으로 가난한 단백질 품질을 나타냅니다. 단백질 품질을 15% SDS-PAGE로 확인합니다. 단백질 순도가 낮으면 단백질을 순수한 물에 투석하는 것입니다. 이것은 무거운 강수량을 일으키는 원인이 되고 단백질 수율을 크게 감소시킬 것입니다, 그러나 더 순수한 견본을 생성할 것입...

우리는 PylRS와 tRNAPyl을 사용하여 사이트 특정 아세틸화 히스톤으로 재구성된 단핵구를 합성하고 조립했습니다. PylRS는 포스트 번역 변형 (PTM)을 가진 단백질을 생성하는 유전 코드 확장 도구로 귀중한 입증하고 약 200 다른 ncAA를 통합하기 위해 유전적으로 진화되었습니다. PylRS는 호박색 정지 코돈에 통합되어 번역 중에 다른 아미노산에서 경쟁을 제거합니다. PylRS는 메탄원성 고고학에서 처음 발견되었으며, 이후 화학 생물학에서 새로운 반응성 화학 그룹을 단백질1,2에통합하는 데 활용되었습니다.
MmAcKRS1은 메타노사르키나 미제이 PylRS로부터 진화하고 아세틸화된 단백질3,4,5,6의합성을 위해 실험실에서 자주 사용되었다. MmAcKRS1은 대장균에서 번역하는 동안 선택되는 mRNA에 있는 호박색 돌연변이 부위에서 AcK를 전달한다. 이 기술은 이전에 K4, K9, K14, K18, K23, K27, K36, K56, K64, K79 히스톤 H3 리신 부위에 AcK를 통합하여 1, 2, 6, 7의 아세트 모노뉴클레오솜4,5,6의AcK를 통합하는 데 사용되었습니다. 여기서 우리는 아세틸화 된 히스톤을 발현하고 아세틸화 뉴클레오좀을 재구성하는이 방법을 자세히 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>0.5 M TE 완충액</td><td>NA</td><td></td><td>0.5 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8</td></tr><tr><td>1 M TE 완충액</td><td>NA</td><td></td><td>NA 1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8</td></tr><tr><td>100x TE 완충액</td><td>NA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 M TE 완충액</td><td>NA</td><td>NA</td><td>2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8</td></tr><tr><td>20 mM TE 완충액</td><td>NA</td><td></td><td>NA 20 mM NaCl, 20 mM 트리스, 1 mM EDTA, pH 7.8</td></tr><tr><td>6 M GuHCl</td><td></td><td></td><td>6M 구아니디늄 클로라이드, 20 mM 트리스, 500 mM NaCl, pH 8.0</td></tr><tr><td>아세틸리신</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>컬럼 세척 버퍼</td><td>NA</td><td>NA</td><td>6 M 요소, 500 mM NaCl, 20 mM 트리스, 20 mM 이미다졸 pH 7.8</td></tr><tr><td>용리 버퍼</td><td>NA</td><td>NA Fisherbrand</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 가변 흐름 화학 물질 이송 펌프</td><td>Fischer Scientific</td><td>15-077-67</td><td></td></tr><tr><td>His-TEV 프로테아제</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>히스톤 용해 완충액</td><td>NA</td><td></td><td>NA 60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8.0</td></tr><tr><td>Ni-NTA 수지</td><td></td><td></td><td>6 M 요소, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM 이미다졸, pH 7.8</td></tr><tr><td>PCR 클린업 키트</td><td>Epoch Life Sicences</td><td>2360050</td><td></td></tr><tr><td>펠렛 세척 완충액</td><td>NA</td><td></td><td>NA 60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0</td></tr><tr><td>petDUET-His-SUMO-TEV-H4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>petDUET-His-TEV-H2A</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>petDUET-His-TEV-H2B</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>petDUET-His-TEV-H3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pEVOL-AckRS</td><td>Addgene</td><td>137976</td><td></td></tr><tr><td>pGEM-3z/601</td><td>Addgene</td><td>26656</td><td></td></tr><tr><td>저장 버퍼</td><td>NA</td><td></td><td>NA 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% 글리세롤, pH 7.8</td></tr><tr><td>열순환기</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

에체리치아 대장균의 유전코드 확장을 이용한 뉴클레오소성 재구성을 위한 히스톤의 특정 리신 아세틸화

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

아세틸화 히스톤 단백질은 돌연변이, N ε-아세틸-리신(AcK)-특이적 메타노사르시나 마지 피롤리신 tRNA-synthetase(MmAcKRS1) 및 그 코그네이트 tRNA(tRNAPyl)를결합하여 재구성한 단핵형 특이적 군수로 재구성할 수 있는 에셀리치아 대장균에서 용이하게 발현될 수 있다. MmAcKRS1 및 tRNAPyl은 대장균에서 번역하는 동안 선택되는 mRNA에 있는 황색 돌연변이 부위에서 AcK를 전달한다. 이 기술은 H3 lysine 사이트에 AcK를 통합하는 데 광범위하게 사용되었습니다. Pyrrolysyl-tRNA synthetase (PylRS)는 또한 사이트 특정 단백질 수정 또는 기능화를 위한 다른 비카노마이컬 아미노산(ncAA)을 통합하도록 쉽게 진화될 수 있다. 여기서 우리는 MmAcKRS1 시스템을 사용하여 AcK를 히스톤 H3에 통합하고 아세틸화 된 H3 단백질을 재구성 된 단핵구로 통합하는 방법을 자세히 설명합니다. 아세틸화 재구성 된 단핵구는 생화학 적 및 결합 적 반응, 구조 결정 등에 사용될 수 있습니다. 수정된 단핵구를 얻는 것은 새로운 상호 작용을 발견하고 후성 유전학을 이해하는 관련있는 실험을 디자인하기 위해 중요합니다.

디머, 테트라머 및 옥타머는 12% SDS PAGE젤(그림 1 및 도 2)을실행하여 평가할 수 있다. 여기서 당신은 아세틸화 테트라머중 일부가 다른 테트라머보다 낮은 수율을 가지고 있음을 알 수 있습니다(그림 1). 사실, 코어 영역에 가까울수록 수율이 낮아집니다. 이것은 가장 가능성이 있기 때문에 테트라머의 조립을 방해 하는 아 세 틸 화 코어 영역에 가까이. 옥타머를 조립한 후 유사한 영향을 관찰한다(도2). 601 DNA 서열로 옥타머를 조립한 후, 뉴클레오닉은 에티듐 브로마이드로 염색한 후 5% 1x TBE 네이티브 PAGE 젤을 사용하여 평가될 수있다(도 3). TEV 소화 전에 뉴클레오소성 대역은...

여기서 우리는 유전 코드 확장을 사용하여 아세틸화 히스톤 단백질을 발현하고 체외에서 재구성된 뉴클레오좀을 조립하는 방법을 제시한다.

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...

변형된 모노뉴클레오솜을 얻는 것은 후성유전학적 실험을 설계하는 데 중요합니다. 당사의 프로토콜은 생화학 및 결합 분석, 구조 결정 등에 사용할 수 있는 아세틸화 재구성 모노뉴클레오솜을 제공합니다. 우리 기술의 주요 장점은 다양성입니다.이 시스템은 여러 유형의 변형을 단핵소체에 통합하도록 쉽게 수정할 수 있습니다. 배양 플라스크에서 1리터의 오토클레이브 2YT 배지를 준비하는 것으로 시작합니다. 적절한 항생제를 함유한 배지 20ml에 플라스미드 및 pEVOL-AckRS를 함유한 태그가 있는 동시 형질전환된 세포주를 접종하고 섭씨 37도에서 성장시켜 0.6의 OD를 얻습니다.1리터의 오토클레이브 2YT 배지에 적절한 항생제를 첨가하고 20ml의 스타터 배양액을 접종합니다. 섭씨 37도에서 2-3시간 동안 배양물을 성장시켜 0.6, 2.8의 OD를 얻습니다. 유도제와 AcK를 첨가하여 최종 농도를 1 millimolar IPTG, 0.2% arabinose 및 5 millimolar AcK로 유도합니다.섭씨 37도에서 6-8시간 동안 배양물을 배양합니다. 그런 다음 2, 700 x g에서 15분 동안 세포를 펠릿화하고 섭씨 영하 80도에서 밤새 보관합니다. 펠릿을 배양 1 리터 당 50 밀리리터의 히스톤 용해 완충액에 용해시키고 1 초 켜기 및 1 초 간격으로 3 분 동안 60 % 진폭으로 세포를 초음파 처리합니다.41, 600 x g에서 45분 동안 펠렛 개재물체. 상등액을 버리고 봉입체를 히스톤 용해 완충액 30ml에 재현탁시킨 다음 다시 30분 동안 원심분리합니다. 30ml의 펠릿 세척 완충액에 개재물을 다시 현탁시키고 원심분리를 반복합니다.다음으로, 25ml의 6몰 구아니딘 염산염 완충액에 개재물을 용해시킵니다. 37도에서 1시간 동안 교반하면서 배양한 다음 45분 동안 원심분리기합니다. 상등액을 1ml의 니클-NTA 수지로 6개의 몰 구아니디늄 하이드로클로라이드 완충액으로 2시간 동안 배양하고 변성 조건에서 니클-NTA 정제를 진행합니다.3 컬럼 부피의 세척 완충액으로 컬럼을 세척한 다음 10ml의 용리 완충액으로 아세틸화 히스톤 단백질을 용리화합니다. 아세틸화 히스톤 단백질을 5% 아세트산 완충액에 투석하여 섭씨 4도에서 3시간 동안 염을 제거하고 완충액을 최소 6회 교환합니다. 부분 표본 및 lipolyze 단백질은 영하 80도에서 무기한 보관됩니다.히스톤 단백질 펠릿 H2A, H2B, H3 및 H4의 분취액을 용해하여 총 부피 100 마이크로 리터에 대해 guanidinium hydrochloride buffer에 각 히스톤 단백질의 별도 재고가 있도록 합니다. 280 나노 미터에서 흡수제를 측정하여 각 히스톤 단백질의 농도를 계산하십시오. 단백질에 대해 흡광도가 1보다 크면 보다 정확한 농도를 얻기 위해 구아니디늄 염산염 완충액으로 희석하십시오.H2A와 H2B 및 H3와 H4 단백질을 1:1의 몰비로 결합하고 마이크로리터당 4마이크로그램의 총 단백질 농도로 희석합니다. 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 2개의 몰 TE 완충액, 1개의 몰 TE 완충액에 대해 2시간 동안, 0.5몰 TE 완충액에 대해 5시간 동안 순차적으로 투석합니다. 완료되면 섭씨 4도에서 16, 800 x g에서 원심분리하여 침전물을 제거합니다.히스톤 이량체와 사량체의 농도는 280 나노미터에서 흡광도를 측정하여 계산합니다. 이량체와 사량체를 1:1 몰 비율로 혼합하고 염화나트륨 농도를 2M로 조정합니다. 100X TE 완충액과 고체 염화나트륨을 사용하여 601 DNA를 2몰 TE 완충액으로 조정합니다.용액을 히스톤 옥타머에 0.85, 2.9 대 1의 몰 비율로 첨가합니다. DNA 히스톤 혼합물을 투석 백에 옮기고 섭씨 4도에서 매우 부드럽게 저으면서 약 200ml의 2몰 TE 완충액에 놓습니다. 연동 펌프를 설정하여 무염 TE 버퍼에 천천히 떨어뜨립니다.볼륨이 약 두 배가 되면 볼륨의 절반을 붓습니다. 이 작업을 최소 4회 수행하며, 시작 볼륨에 따라 4시간에서 8시간이 걸릴 수 있습니다. 염 농도를 150 millimolar로 줄인 후 밤새 20 millimolar TE 완충액에 대해 투석합니다.원심분리로 침전물을 제거하고 플레이트 리더로 뉴클레오솜의 농도를 측정합니다. his-TEV 프로테아제를 첨가하고 섭씨 4도에서 밤새 배양하여 모든 히스티딘 태그를 제거합니다. 그런 다음 니켈-NTA 수지 풀다운으로 뉴클레오솜 용액에서 히스티딘 태그 불순물을 제거합니다.섭씨 60도에서 1시간 동안 배양하여 뉴클레오솜을 배치하고 샘플을 균질화합니다. 뉴클레오솜은 단기적으로 섭씨 4도에서 보관하십시오. 장기 보관의 경우 보관 버퍼에 뉴클레오솜을 투석하고 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.일부 아세틸화 사량체는 12%SDS-PAGE 겔을 실행하여 평가한 바와 같이 다른 것보다 수율이 낮았습니다. 코어 영역에 가까울수록 관찰된 수율이 낮아집니다. 이것은 옥타머 어셈블리를 방해하는 아세틸화 때문일 가능성이 가장 높습니다.601 DNA 염기서열로 옥타머를 조립한 후 5%1X TBE 네이티브 PAGE 겔을 사용하여 뉴클레오솜을 평가한 후 브롬화 에티듐으로 염색할 수 있습니다. 열 포지셔닝 전에 관찰된 뉴클레오솜 띠는 매우 넓고 줄무늬가 있을 수 있습니다. 이 프로토콜을 수행할 때는 항상 단백질을 얼음 위에 두십시오.조립된 이량체, 사합체 및 뉴클레오솜을 유지하는 것이 중요합니다. 이 절차를 통해 연구자들은 아세틸 라이신 부위를 특히 단핵체에 설치할 수 있게 되어 염색질 맥락에서 번역 후 변형을 연구할 수 있는 문을 열었습니다. 비표준 아미노산을 원하는 만큼 설치하도록 쉽게 조정할 수 있습니다.

site-specific-lysine-acetylation-histones-for-nucleosome

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

우리는 라이신 methylation의 변화를 계량하는 데 든 질량 분광법과 reductive methylation 화학을 사용하는 방법을 제시한다.

라이신 Demethylase 활동의 양적 측정을위한 MassSQUIRM의 응용

다운스트림 분석을 포함하여 비표준 아미노산 유사체를 단백질에 잔류물 특이적으로 통합하기 위한 사용하기 쉬운 무세포 발현 프로토콜이 의료, 제약, 구조 및 기능 연구를 위해 제시됩니다.

를 사용하여 모델 단백질로 비정규 아미노산의 잔류 특정 법인 설립<em&gt; 대장균</em&gt; 휴대없는 전사 번역 시스템

이 프로토콜은 차등 동위 원소 표지 자매 히스톤를 포함하는 뉴 클레오의 재구성에 대해 설명합니다. 동시에, 비대칭 번역 후 개질은 뉴 클레오 히스톤 premodified 복사를 사용한 후 발생 될 수있다. 이러한 제제는 즉시 고해상도 NMR 분광법을 이용하여 두 자매 히스톤 동시에, 수정 누화 메커니즘을 연구하는데 사용될 수있다.

된 유의 동위 원소 표지 자매 히스톤과 뉴 클레오의 재구성

이 원고는 히스톤 및 그 번역 후 변형을 인식하는 항체의 특이성 프로파일 링에 펩타이드 마이크로 어레이 기술을 적용하는 방법을 설명합니다.

펩티드 Microarrays를 가진 Histone 항체 특이성의 분석

우리 신경 조상 세포의 히스톤 3 리 79 dimethylation (H3K79me2)-내에 있는 히스톤 마크 chromatin immunoprecipitation (칩)에 대 한 미 발달 및 출생 후 뇌 조직에서 문화를 격리 하는 효과적이 고 재현 가능한 방법을 제시는 히스톤 3의 구형 도메인입니다.

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유전자 코드 확장 acetylation 단백질을 포함 한 생물 학적 과정의 넓은 범위를 공부 하는 강력한 도구 역할을 합니다. 여기 균질 생성 하기 위한이 기술을 악용 하는 손쉬운 프로토콜 acetylated 단백질 대장균 세포에 특정 사이트에 설명 합니다.

Site-Specifically 생성 하는 손쉬운 프로토콜 Acetylated 대장균 에서 단백질

여기, 우리가 특정 단백질 acetylation 또는 succinylation 인 (산출할) 생 수정 수정 후 도입의 비율 분석을 통해 전체 프로테옴의의 편견된 정량화 제시 양적 화학 acylation 안정 동위 원소 표시 된 anhydrides를 사용 하 여입니다. 함께 중요 한 독립적인 데이터 수집 질량 분석, 정확한 사이트 인 측정 얻을 수 있습니다.

사이트별 단백질 Lysine Acetylation 및 Succinylation 산출할 데이터 독립적인 수집 질량 분석을 사용 하 여 정량화

Chromatin 환경 규칙은 적절 한 유전자 발현에 필요한 필수적인 과정 이다. 우리가 chromatin 수정의 채용을 통해 유전자 발현을 제어 하기 위한 메서드를 설명 하는 여기, 유전자 및 가역 방식 기계.

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이 연구는 유전 암호 확장을 활용하여 대 장균 과 포유류 세포에서 인간 에놀라제-1(hENO1)과 슈퍼폴더 GFP(sfGFP)의 특정 부위에 락틸-라이신(Klac)을 성공적으로 통합하는 방법을 확립했습니다.

대 장균 과 포유류 세포에서 유전 암호 확장을 통한 부위 특이적 라이신 락틸화

배우세요 에체리치아 대장균에서 유전코드 확장을 이용한 히스톤 H3의 특정 리신 아세틸화 방법입니다. 아세틸화된 단일 뉴클레오소몬을 재구성하여 후성유전학적 메커니즘과 단백질 상호작용 연구에 활용할 수 있습니다.

에체리치아 대장균의 유전코드 확장을 이용한 뉴클레오소성 재구성을 위한 히스톤의 특정 리신 아세틸화

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