Name: 아라비도시스에서 지역 및 전신 상처 신호의 넓은 필드, 실시간 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: 학습하세요 아라비도시스에서 기계적 상처에 반응하여 칼슘과 글루타메이트 역학을 실시간 이미징하는 방법을. 이 프로토콜은 식물 전신 신호 전달의 시공간적 특성을 연구하는 강력한 도구를 제공합니다.

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이 작품은 일본과학진흥협회(17H05007 및 18H05491)에서 MT, 국립과학재단(IOS1557899, MCB20161777) 및 국립항공우주청(NNX14AT25G 및 80NSSSCC191K19)에 보조금을 지원했다.

1. 식물 재료 준비
<ol><li>1.5mL 마이크로튜브에서 표면은 GCaMP3 또는 CHIB-iGluSnFR을 3분 동안 20%(v/v) NaClO로 흔들어 서 아기방시스 탈리아나(Col-0 accession) 식물의 씨앗을 살균한 다음 멸균 증류수로 5회 세척합니다. 참고: GCaMP3 또는 CHIB-iGluSnFR을 표현하는 애기장염의 형질전환선은 이전에설명되었습니다 6.</li>
	<li>멸균 후드에 30mL 멸균(autoclaved) 무라시게와 스쿠그(MS) 매체[1x MS 염)로 채워진 10cm 정사각형 플라스틱 페트리 접시에 13개의 표면 멸균 씨앗을 뿌리고, 1% (w/v) 자당, 0.01% (w/v) myoinositol, 0.05% (w/v) MES 및 0.5% (w/v) 겔란 껌; pH 5.7 조정 1N KOH]. 뚜껑을 교체하고 수술 용 테이프로 포장하십시오.</li>
	<li>2일 동안 4°C에서 어두움으로 배양한 후, 연속광(90-100 μmolm-2 s-1)에서22°C로 수평으로 플레이트를 배치하여 사용하기 전에 약 2주 동안 한다. 2 주 후, 가장 오래된에서 막내44 (그림 1)에서 아라비도시스 잎의 수를 계산합니다. 상처 응답은 손상된 잎(n)에서 번호n ± 3 및 n ± 56로우선적으로 이동한다. 참고 : 이 프로토콜에서, 페트리 접시는 형광 현미경의 밑에 상처 및 글루타민트 효력을 화상 진찰을 위해 열립니다. 따라서 이 실험의 후속 단계는 온도 및 습도 조절 실 조건하에서 수행되어야 합니다. 이는 Ca2+ 신호도 이러한 환경 조건의 변화에 의해 유도되기 때문입니다. 또한 바이오센서 단백질의 형광을 기록하는 동안 현미경으로부터 방출되는 청색광은 세포색 Ca2+ 농도(45)의 증가를 유도할 수 있으므로 식물은 실험을 시작하기 전에 몇 분 동안 청색 광 조사에 적응해야 한다.</li>
</ol>2. 화학 적 준비
<ol><li>액체 성장 매체 [1/2x MS 염, 1% (w/v) 자당 및 0.05% (w/v) MES; pH 5.1 1 1N KOH로 조정] 100 mM 작업 솔루션을 만들기 위해 용해. 참고: Ca2+ 역학에 대한 잠재적인 양이온 관련 효과를 방지하기 위해 글루타민산나트륨과 같은 글루타민염의 사용을 피하십시오.</li>
</ol>3. 현미경 설정 및 실시간 이미징 수행
<ol><li>1x 목표 렌즈(NA = 0.156) 및 sCMOS카메라(그림 2)가장착된 전동 형광 스테레오현미경을 켜고 470/40 nm 흥분광으로 조사하고 535/50 nm 필터를 통과하는 방출 광을 획득하도록 장치 설정을 구성한다. 참고: 모든 GFP 에 민감한 형광 현미경은 GCaMP3 및 iGluSnFR 신호를 실시간으로 감지하는 데 사용할 수 있지만, 넓은 sCMOS 칩을 갖춘 저전력 객관적렌즈와 고감도 카메라는 전체 플랜트에서 신호를 획득하는 것이 좋습니다. 저전력 목표를 통해 전체 Arabidopsis 플랜트의 반응과 매우 민감한 카메라의 사용을 통해 상처 트리거된 Ca2+ 웨이브의 빠른 시간 과정을 캡처하는 데 필요한 빠른 데이터 수집이 가능합니다. 이 연구에서 사용되는 형광 현미경의 경우, 시야 및 측두해상도 분야의 최대 값은 각각 초당 3cm x 3cm 및 30 프레임(fps)입니다.</li>
	<li>뚜껑을 제거하고 접시를 객관적인 렌즈 아래에 놓습니다.</li>
	<li>식물의 형광 신호를 확인한 다음 식물이 새로운 환경 조건에 적응할 때까지 어둠 속에서 약 30 분 동안 기다립니다. 이 적응 단계는 습도의 변화가 상처 관련 사건을 방해할 수 있는 식물의 [Ca2+]시동 고도를 유도하기 때문에 필요합니다.</li>
	<li>초점과 배율을 조정하여 시야에서 전체 식물을 볼 수 있습니다. 현재 프로토콜에서 0.63배배율이 사용되었습니다.</li>
	<li>실시간 이미징을 시작하기 전에 현미경 이미징 소프트웨어를 사용하여 형광 신호를 감지하기 위해 획득 매개 변수를 설정합니다. 현재 프로토콜에서 이미징을 위한 설정은 노출 및 간격 시간이 각각 1.8s 및 2s(즉, 0.5fps)로 설정됩니다. 녹화 시간을 11분으로 설정합니다.</li>
	<li>현미경으로부터 청색광 조사에 식물을 적응시키기 위해 실험을 시작하기 전에 5 분 동안의 이미지는 Run Now를클릭하여 기록을 시작한 다음 사용 중인 현미경 소프트웨어에서 이와 동등한 명령을 클릭하여 녹음을 시작합니다. 평균 기준선 형광을 확인하려면 상처 또는 글루타민트 응용 프로그램(섹션 4 참조)전에 최소 10프레임(즉, 현재 프로토콜에서 최소 20s)을 기록하십시오.<ol>
<li>상처 유발 [Ca2+]시동 및 [글루]아포 변화의 실시간 이미징을 위해, 가위로 잎 L1의 쁘띠올 또는 중간 부위를 잘라냅니다(도3 및 도 4).</li>
		<li>글루타민산염 [Ca2+]cyt 변경의 실시간 이미징을 위해 가위로 메인 정맥을 가로질러 잎 1의 가장자리(끝에서 약 1mm)를 자른다. 적어도 20분 의 회복 기간 후에, 잎의 절단 표면에 100mM 글루타민산염의 10 μL을 적용한다(그림5). 참고: 이 사전 절단은 응답을 트리거하기 위해 송과미잎 아포플라스트에 대한 글루타메이트 액세스를 허용하는 데 필요했습니다. 또한, 잎 L1의 절단 표면에 증류수 한 방울을 가하는 것은 글루타민을 적용하기 전에 회수 중에 시료가 건조되는 것을 방지하는 데 중요한 것으로 나타났다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>11분 녹화를 마친 후 데이터를 저장합니다.</li>
</ol>4. 데이터 분석
<ol><li>시간이 지남에 따라 형광 강도 분석을 위해 형광 강도가 분석되어야 하는 장소에서 관심 영역(ROI)을 정의합니다(도6 및 도 7). Ca2+ 웨이브의 속도 계산을 위해 분석을 위해 2개의 ROI(ROI1 및 ROI2)를 정의합니다. 이미징 소프트웨어에서 시간 측정 | 클릭하십시오. | 정의 원. 주석 및 측정 | 클릭하여 ROI1과 ROI2 사이의 거리를 측정합니다. 길이 | 간단한 선 (그림 6).</li>
	<li>측정값을 클릭하여 시간이 지남에 따라 각 ROI에서 원시 형광 값(F)을 측정합니다. 원시 데이터를 스프레드시트 소프트웨어로 내보내 모든 것을 Excel| 클릭하여 각 시점에서 형광 신호를 숫자로 변환합니다. 내보내기.</li>
	<li>기록된 데이터에서 처음 10프레임(즉, 치료 전)에 대한 F의 평균을 계산하여 F0으로정의되는 기준형 형광 값을 결정한다.</li>
	<li>ΔF가 형광의 시간 의존적 변화인 방정식 ΔF/F =(F−F0)/F0을사용하여 F 데이터(ΔF/F를 계산하여)를 정규화합니다.</li>
	<li>Ca2+ 파속도 파의 경우, 통계 소프트웨어를 사용하여 F0 데이터에서 계산되는 표준 편차(× 2x SD)의 기준을 사용하여 각 ROI(t1 및 t2)의Ca2+ 증가를 나타내는 것으로 사전 자극된 값 보다 중요한 신호 상승 점을 정의합니다. F0 데이터의 95%는 평균에서 2배 SD 내에 속하며, 이는 우연히 이 수준 이상의 신호 증가가 ≤5%임을 나타냅니다. ROI1과 ROI2 사이의 Ca2+ 증가의 시차를 계산하고 ROI1과 ROI2 사이의 거리를 측정한 다음 Ca2+ 웨이브의 속도를 결정합니다. </li>
</ol>

저자는 이해 상충이 없습니다.

발전소는 지역화된 외부 환경 자극에 대응한 다음 전체 식물 수준에서 항상성을 유지하는 데 중요합니다. 동물과 같은 첨단 신경계를 장착하지는 않지만, 이동식 전기(및 유압) 신호및 ROS 와 Ca2+46,47의전파와 같은 요인에 따라 기관 안팎에서 신속한 통신을 사용합니다. 위에서 설명한 프로토콜은 상처에 대한 응답으로 Ca2+ 및 아포가소성 글루타민의 역학을 모니터링하여 이 신호 시스템의 활성을 식물 전체에 실시간으로 이미징할 수 있습니다. 이 방법은 높은 현공간 적 해상도와 사용 편의성을 결합한 식물의 신속하고 장거리 신호를 이해하는 강력한 도구를 제공합니다. 이 프로토콜은 또한 Ca2+ 채널 차단제(예를 들어, LaCl 3) 또는 기타 잠재적 키 신호활동의억제제(예를 들어, LaCl 3) 또는 다른 잠재적 키 신호 활동의...

식물은 생물학적 스트레스, 예를 들어 곤충이 먹이를 주는 것에서 벗어날 수 없으므로 정교한 응력 감지 및 신호 변환 시스템을 진화하여 허브 리보리1과같은 문제로부터 자신을 감지하고 보호합니다. 상처 나 초식 포동 공격에 따라 식물은 부상당한 부위뿐만 아니라 손상되지 않은 탈설 기관2에서식물 호르몬 자스모산 (JA)의 축적을 포함한 신속한 방어 반응을 시작합니다. 이 JA는 둘 다 직접 손상된 조직에서 방어 반응을 유발하고 공장의 손상되지 않은 부분에서 방어를 선제적으로 유도합니다. 애기독증에서,상처에 의해 유도된 JA의 축적은 식물내 다른 곳에서 손상된 단 몇 분 이내에 손상된 단 몇 분 이내에 손상된 잎에서 검출되었다3. Ca2+,반응성 산소 종(ROS) 및 전기 신호와 같은 여러 후보는 식물4,5에서이러한 장거리 상처 신호로 작용하도록 제안되었습니다.
Ca2+는 진핵 생물에서 가장 다재다능하고 유비쿼터스 두 번째 메신저 요소 중 하나입니다. 식물에서, 애벌레 츄잉 및 기계적 상처는 분광성 Ca2+ 농도 ([Ca2+]cyt)의급격한 증가를 일으키는 원인이 되며, 모두 상처 입은 잎과 상처가 없는 먼 잎6,7. 이러한 전신 Ca2+ 신호는 세포내 Ca2+-센싱 단백질에 의해 수신되며, 이는 JA 생합성8,9를포함한 다운스트림 방어 신호 경로의 활성화로 이어진다. 식물 상처 반응에서 Ca2+ 신호의 중요성을 뒷받침하는 수많은 보고서에도 불구하고 상처로 유도된 Ca2+ 신호의 공간 및 측두적인 특성에 대한 정보는 제한적입니다.
유전자 인코딩 된 Ca2+ 지표를 사용하여 실시간 이미징은 Ca2+ 신호의 공간 및 시간 역학을 모니터링하고 정량화하는 강력한 도구입니다. 현재까지 단일 셀 수준에서 조직, 장기 및 전체식물(10)까지Ca2+ 신호를 시각화할 수 있도록 이러한 센서의 버전이 개발되었습니다. 식물에 사용되는 Ca2+를 위한 최초의 유전자 인코딩 된 바이오 센서는 해파리 Aequorea 빅토리아11에서파생 된 생물 발광 단백질 aequorin이었다. 이러한 화학발광 단백질은 식물12,13,14, 15,16,17,18의다양한 응력에 대한 반응으로 Ca2+ 변화를 검출하는 데 사용되었지만, 발광 신호가 매우 낮기 때문에 실시간 이미징에 적합하지 않다. Förster 공명 에너지 전송 (FRET)기반 Ca2+ 지표, 황 낙타와 같은, 또한 성공적으로 식물19, 20,21,22,23,24에서Ca 2 + 신호 이벤트의 범위의 역학을 조사하는 데 사용되었습니다. 이러한 센서는 이미징 접근법과 호환되며 가장 일반적으로 근산광사슬 키나아제에서 Ca2+ 결합 단백질 칼모둘린(CaM)과 CaM 결합 펩타이드(M13)로 구성되며, 모두 두 개의 형광단백질, 일반적으로 시안 형광단백질(CFP) 및 황형광 단백질(YFP)으로 구성된다. Ca2+ CaM에 바인딩하는 CaM과 M13 간의 상호 작용을 촉진하여 센서의 변형 변화를 촉진합니다. 이러한 변화는 CFP와 YFP 간의 에너지 전달을 촉진하여 YFP의 형광 강도를 증가시키면서 CFP에서 형광 방출을 감소시킵니다. CFP에서 YFP 형광으로의 이러한 변화를 모니터링하면 Ca2+ 수준의 증가를 측정합니다. 이러한 FRET 센서 외에도, 단일 형광 단백질(FP)기반 Ca2+ 바이오 센서(GCaMP 및 R-GECO와 같은)도 식물 이미징 접근법과 호환되며, 높은 감도 및 사용 편의성25,26,27,28,29,30을연구하는 데 널리 사용된다. GCaMpPs는 단일 원형 변록(cp) GFP를 함유하고 있으며, 다시 CaM 및 M13 펩타이드에 융합된다. Ca2+-C13 간의 의존적 상호 작용은 cpGFP의 프로토네이션 상태의 변화를 촉진하는 센서의 변형 변화를 일으켜 형광 신호를 강화합니다. 따라서 Ca2+ 레벨이 상승함에 따라 cpGFP 신호가 증가합니다.
기계적 상처 또는 초식동물 공급에 대응하여 생성된 Ca2+ 신호의 역학을 조사하기 위해, 우리는 GCaMP 변종, GCaMP3 및 광야 형광 현미경 6을 표현하는 형질 아기장 염 탈리아나 식물을사용했습니다. 이 방법은 잎에 상처 부위에서 전체 식물에 장거리 Ca2 + 신호의 신속한 전송을 시각화하는 데 성공했습니다. 따라서 상처 부위에서 [Ca2+]cyt의 증가가 즉시 감지되었지만 이 Ca2+ 신호는 상처후 몇 분 이내에 혈관을 통해 이웃 잎에 전파되었다. 더욱이, 우리는 이 급속한 전신 상처 신호의 전송이 2개의 글루타민산 수용체 같이 유전자, 글루타민산 수용체 같이(GLR), GLR3.3 및 GLR3.6에서돌연변이를 가진 아라비도시스 식물에서 폐지된다는 것을 것을을 발견했습니다. GlR은 상처 반응3,꽃가루 튜브 성장31,근간 작용32,감기 반응33,선천성 면역34를포함한 다양한 생리적 과정에 관여하는 아미노산 게이트 Ca2+ 채널로 기능하는 것으로 보인다. 이러한 잘 이해되고 광범위한 GlR의 광범위한 생리적 기능에도 불구하고, 리간 특이성, 이온 선택성 및 세포외 국소화와 같은 기능적 특성에 대한 정보는35에한정된다. 그러나, 최근 연구는 GLR3.3 및 GLR3.6 phloem와 자일렘에 국한되는 것을 각각 보고했습니다. 식물 GLR은 포유류에서 요노소글루타민체 수용체(iGluRs)36과 유사하며, 포유동물 신경계에서 글루타민트, 글리신 및 D-세린과 같은 아미노산에 의해활성화된다37. 실제로, 우리는 상처 부위에서 100 mM 글루타민산의 적용이 아라비도프시스에서신속하고 장거리 Ca2+ 신호를 유도한다는 것을 보여주었으며, 이는 세포외 글루타민산염이 식물6에서상처 신호로 작용할 가능성이 있음을 나타낸다. 이러한 반응은 글루타민이 이러한 수용체와 같은 채널 중 하나 또는 둘 다를 통해 작용할 수 있음을 시사하는glr3.3/glr3.6 돌연변이체에서 폐지되며, AtGLR3.6은 최근 이러한 글루타메이트(38)의 수준에 의해 문이 있는 것으로 나타났다. 
식물에서는, 구조 아미노산으로서의 역할 외에도 글루타민산은 또한 주요 발달레귤레이터(39)로제안되었다. 그러나, 그것의 공간 및 시간 역학 제대로 이해. Ca2+마찬가지로, 글루타민에 대한 여러 유전자 인코딩 된 지표는 살아있는세포40,41에서이아미노산의 역학을 모니터링하기 위해 개발되었습니다. iGluSnFR은 에슈리치아 대장균42,43로부터cpGFP 및 글루타메이트 결합 단백질(GltI)으로 구성된 GFP 기반 단일 FP 글루타민산 바이오센서이다. GltI에 결합하는 글루타메이트에 의해 유도되는 iGluSnFR의 변형 변화는 향상된 GFP 형광 방출을 초래합니다. 세포외 글루타민이 식물 상처 반응에서 신호 분자역할을 하는지 여부를 조사하기 위해 iGluSnFR 서열을 기본 치티나아제 신호 펩타이드 분비 서열(CHIB-iGluSnFR)과 연결하여 이 바이오센서를 아포가성공간에서국소화하였다 6. 이 접근법은 이 센서를 표현하는 형질전환 아라비도시스 식물을 사용하여 종말성 글루타민염 농도([Glu]apo)의변화에 대한 이미징을 가능하게 했습니다. 우리는 상처 부위에서 iGluSnFR 신호의 급속한 증가를 감지했습니다. 이 데이터는 글루타민트가 손상된 세포/조직에서 상처시 아포라스트로 누출되고 GlR을 활성화하고 식물6에서장거리 Ca2+ 신호로 이어지는 손상 신호역할을 한다는 생각을 뒷받침한다.
여기서, 우리는 유전자 로코딩된 바이오 센서를 사용하여 식물 전체의 실시간 이미징 방법을 설명하여 상처6에대한 응답으로 장거리 Ca2+ 및 세포외 글루타민트 신호의 역학을 모니터링하고 분석한다. 유전자 인코딩 된 바이오 센서를 표현하는 광장 형광 현미경 및 형질 형질 검사기및 형질 검사기의 가용성은 Ca2+ 파도와 같이 빠르게 전송되는 장거리 신호를 감지하는 강력하고 쉽게 구현 된 접근 방식을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>Arabidopsis expressing GCaMP3</td><td>Saitama University</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arabidopsis expressing CHIB-iGluSnFR</td><td>사이타마 대학</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 7</td><td>GraphPad 소프트웨어</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-글루타메이트</td><td>후지필름 Wako</td><td>072-00501</td><td>액체 성장 매체[1/2x MS 염, 1%(w/v) 수크로스 및 0.05%(w/v) MES, 1N KOH로 pH 5.1 조정]에 용해됨.</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige and Skoog (MS) 매체</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>392-00591</td><td>조성 : 1x MS 염, 1 % (w / v) 자당, 0.01 % (w / v) myoinositol, 0.05 % (w / v) MES 및 0.5 % (w / v) gellan gum; pH 5.7은 1N KOH로 조정되었습니다.</td></tr><tr><td>니콘 SMZ25 실체 현미경</td><td>니콘</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements AR 분석</td><td>니콘</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x 대물 렌즈 (P2-SHR PLAN APO)</td><td>니콘</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sCMOS 카메라 (ORCA-Flash4.0 V2)</td><td>하마 마츠 포토닉스</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>스퀘어 플라스틱 페트리 접시</td><td>Simport</td><td>D210-16</td><td></td></tr></tbody></table>

아라비도시스에서 지역 및 전신 상처 신호의 넓은 필드, 실시간 이미징

Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis

식물은 손상된 부품과 손상되지 않은 부품 모두에서 방어 반응을 유도하여 상처및 허브아이보리와 같은 기계적 응력에 반응합니다. 잎이 감기 시, 세포색 칼슘 이온 농도의 증가 (Ca2+ 신호) 상처 부위에서 발생. 이 신호는 방어 응답이 활성화되는 손상되지 않은 나뭇잎으로 빠르게 전송됩니다. 우리의 최근 연구는 그(것)들의 주위에 apoplast로 잎의 부상당한 세포에서 누설하는 글루타민이 상처 신호 역할을 한다는 것을 밝혔습니다. 이 글루타민은 글루타민산 수용체와 같은 Ca2+ 투과성 채널을 활성화하여 공장 전체에서 장거리 Ca2+ 신호 전파로 이어집니다. 이러한 이벤트의 공간적 및 현세적 특성은 유전적으로 인코딩된 형광 바이오 센서를 표현하는 살아있는 식물의 실시간 이미징으로 캡처할 수 있습니다. 여기서 우리는 상처에 대응하여 발생하는 아포가소성 글루타민의 Ca2+ 신호 및 변경의 역학을 모니터링하는 식물 전체의 실시간 이미징 방법을 소개합니다. 이 접근법은 광야 형광 현미경 및 녹색 형광 단백질 (GFP)기반Ca2+ 및 글루타민산 바이오 센서를 표현하는 형질 전환 성 애기장 식물을 사용합니다. 또한, 우리는 쉽게 상처 유도, 글루타민시 트리거 빠른 장거리 Ca2 + 신호 전파를 유도하는 방법론을 제시한다. 이 프로토콜은 또한 공장 시스템 신호가 신호 및 응답 네트워크에 어떻게 관여할 수 있는지 조사하는 데 도움이 되는 다른 플랜트 스트레스에 대한 연구에 적용할 수 있습니다.

[Ca2+]시동및 【글루】아포의 신호 전파는 도 3, 도 4, 무비 S1및 영화 S2에제시된다. GCaMP3(0s)를 발현하는 식물에서 잎 1의 잎 1을 절단하면 혈관 (40 s)을 통해 로컬로 빠르게 유도된 [Ca2+]시트의 상당한 증가를 주도하였다(도3 및 무비 S1). 이어서, 신호는 몇 분 이내에 이웃 잎(잎 3 및 6)(그림3 및 무비 S1)으로급속히 전파되었다.
<p class="jove_content" fo:keep-toge...

세포외 글루타메이트 트리거 전신 칼슘 신호는 식물의 기계적 상처 및 초식 공격에 대한 식물 방어 대응의 유도에 매우 중요합니다. 이 문서에서는 칼슘과 글루타민염에 민감한 형광 바이오 센서를 표현하는 아라비도시스 탈리아나 식물을 사용하여 이러한 두 요인의 공간 적 및 측두동을 시각화하는 방법을 설명합니다.

Plants respond to mechanical stresses such as wounding and herbivory by inducing defense responses both in the damaged and in the distal undamaged parts. ...

이 프로토콜은 상처에 대한 응답으로 칼슘과 아포가소성 글루타민의 역학을 모니터링하여 식물 조직 신호 시스템의 활성을 식물 전체에 실시간으로 이미징 할 수 있습니다. 이 식물 전체 실시간 이미징 방법은 높은 공간 적시적 해상도와 사용 편의성을 결합하여 식물의 신속하고 장거리 신호의 역학을 이해하는 견고한 도구를 제공합니다. 이 프로토콜은 다른 식물 종의 생물학적 스트레스 반응과 생물학적 스트레스 반응 모두에서 칼슘 신호 시스템의 공간 및 측두적인 특성에 대한 새로운 통찰력을 제공할 수 있는 잠재력을 제공합니다.절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 박사 후 동료 인 우에무라 타쿠야 (Takuya Uemura)가 될 것입니다. 1X 객관적렌즈와 sCMOS 카메라가 장착된 전동 형광 스테레오 현미경을 켜는 것으로 시작합니다. 470 나노미터를 중심으로 한 발광을 중심으로 장치 설정을 구성하고, 450~490나노미터 사이의 빛을 전송하는 필터를 사용하여 선택한다.510~560나노미터 사이를 전송하는 필터를 사용하여 방출 광을 획득한다. 식물이 들어 있는 접시에서 뚜껑을 분리하여 객관적인 렌즈 아래에 놓습니다. 식물의 형광 신호를 확인합니다.그런 다음 식물이 새로운 환경 조건에 적응 할 때까지 어둠 속에서 약 30 분 동안 기다립니다. 초점과 배율을 조정하여 시야에서 전체 식물을 볼 수 있습니다. 그런 다음 현미경 이미징 소프트웨어를 사용하여 형광 신호를 감지하기 위해 획득 매개 변수를 설정합니다.녹화 시간을 11분으로 설정합니다. 현미경으로부터 청색광 조사에 식물을 적응시키기 위해 실험을 시작하기 전에 5 분 동안 의 이미지는 녹음을 시작합니다. 평균 기준선 형광 기록을 결정하려면 상처 또는 글루타민트 적용 전에 적어도 10 프레임.상처 유도 된 세포칼슘 이온과 아포가소성 글루타민제 농도 의 실시간 이미징을 위해, 가위로 잎 L1의 쁘띠올 또는 중간 영역을 잘라. 글루타민산염의 실시간 이미징을 위해 세포성 칼슘 변화를 유발하여, 가위로 주요 정맥을 가로질러 잎 L1 끝에서 약 1mm를 자른다. 적어도 20 분 후 잎의 절단 표면에 100 밀리머 글루타민트의 10 마이크로 리터를 적용합니다.시간이 지남에 따라 형광 강도 분석을 위해 형광 강도를 분석해야 하는 장소에서 관심 영역을 정의합니다. 칼슘 파의 속도 계산을 위해 두 개의 ROI를 정의합니다. 이미징 소프트웨어에서 시간 측정을 클릭하고 정의하고 동그라미를 친다.주석과 측정, 길이 및 간단한 선을 클릭하여 두 영역 사이의 거리를 측정합니다. 측정값을 클릭하여 시간이 지남에 따라 각 ROI의 원시 플로레스크 값을 측정한 다음 원시 데이터를 스프레드시트 소프트웨어로 내보내 각 시점에서 형광 신호를 숫자로 변환합니다. 기록된 데이터의 처음 10프레임에 걸쳐 평균 F를 계산한 다음 텍스트 원고에 설명된 대로 F 데이터를 정규화하여 F 제로로 신성한 기준형 형광 값을 결정합니다.칼슘 속도 파 해석의 경우, 각 ROI의 칼슘 증가를 나타내는 것으로 사전 자극된 값 보다 중요한 신호 상승 점을 정의합니다. 칼슘 의 속도 는 두 ROI와 그 사이의 거리 사이의 칼슘 증가의 시차를 계산합니다. 세포칼슘 이온과 아포가소성 글루타민산염의 농도에 상처 유발 변화의 전파가 여기에 나타난다.GCaMP-3을 표현하는 식물에서 잎의 잎을 절단하는 것은 칼슘의 상당한 증가로 이어졌다. 그것은 로컬로 유도된 다음 혈관 전체에 퍼졌다. 신호는 몇 분 안에 이웃 잎에 빠르게 전파되었습니다.나뭇잎과 식물을 자르면서 기본 치티나아제 나는 접착제 스니퍼를 붙이고, 절단 부위 주변에서 급속한 아포가소성 글루타민트 증가가 관찰되었다. 몇 분 안에, 신호는 또한 혈관을 통해 전파. 글루타민트 의 적용에 의해 유발된 칼슘 신호 전파의 실시간 이미징을 위해 CCaMP-3을 표현하는 식물의 잎 가장자리가 절단되었습니다.이로 인해 국소 세포종 칼슘 이온 농도가 증가했지만 신호는 몇 분 안에 사라졌습니다. 약 10분 후, 글루타민을 절단 표면에 적용하여 세포칼슘농도가 급격히 증가하고 이 신호가 탈엽잎으로 전파되었다. 전신 잎에 상처를 입음하여 유도된 고체 칼슘 농도 내부의 변화를 측정하기 위해 GCaMP-3 신호 강도의 시간 과정 변화를 관심 의 두 영역에서 측정했다.기계적 손상에 대한 반응으로 아포가소성 글루타민트 농도 변화도 측정되었다. 글루타민트 시그니처는 상처 후 약 100초 만에 한 번의 피크를 보였습니다. 이 실험은 이 환경 조건의 변화에 의해 상승되기 때문에 온도 및 습도 통제 조건하에서 수행되어야 합니다.이 프로토콜은 실험실 신호 시스템의 결함이 있고 putative 요소가 돌연변이를 사용하여 장거리 신호의 기본 분자 메커니즘에 대한 통찰력을 제공 할 수있는 잠재력을 제공합니다.

wide-field-real-time-imaging-local-systemic-wound-signals

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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의 장기, 고해상도 공 촛점 시간 경과 영상<em&gt; Arabidopsis 떡잎</em발아시&gt; 표피

아주 늦은 단계 Drosophila의 배아의 배아 표피 빠른 찔린 상처의 응답 분석을위한 생체 시스템을 제공하고, 포유 동물 모델로 번역 상처 치료에 대한 연구를 진행하기 위하여 유전자 조작 물질 또는 화학 물질 미세 주입 치료와 결합 될 수있다.

미세 주입 상처 분석 및<em&gt; 생체 내</em&gt; 표피의 현지화는 응답 기자의 상처<em&gt; 초파리</em&gt; 태아.

이 프로토콜은 시중에서 구입할 수있는 평판 스캐너를 사용하여 중력 자극에 응답 애기 모종의 이미지를 신속하게 수집을위한 프로세스를 설명합니다. 방법은 다운 스트림 분석 알고리즘에 대한 의무 고해상도 이미지의 저렴한 대용량 포착을 허용한다.

애기 장대 루트 Gravitropic 응답의 고해상도 시간 경과 이미지를 수집하는 평판 스캐너를 사용하여

칼슘 신호는 식물에서 다양한 생물학적 과정을 조절한다. 여기에 우리가 공간과 시간 칼슘에 의한 비 생물 적 스트레스를 모니터링하기위한 방법을 제시 애기 세포와 유전자 인코딩 칼슘 지표 애큐 오린 또는 Case12를 사용하여 조직에 2 + 신호.

측정 공간적 칼슘 2 + 신호

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실시간 Vivo에서 녹음 애기 칼슘 신호의 곤충 먹이 형광 바이오 센서를 사용 하 여 중

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