Name: 호흡기 바이러스 감염 동안 선천적 면역 세포 활성화의 연구를 위한 비접촉식 공동 배양 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: 학습하세요 호흡기 바이러스 감염 시 비접촉식 공동 배양 모델을 이용한 상피세포와 선천성 면역세포 간 상호작용 분석 방법. 이 기술은 선천성 T세포 활성화 메커니즘 규명 및 항바이러스 치료제 개발에 활용됩니다.

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우리는 hNEC 문화 및 바이러스 문화 관련 작업에 도움을 주신 NUS 이비인후과 및 미생물학 및 면역학과의 연구 직원에게 감사드립니다. 우리는 또한 연구에 필요한 세포 및 혈액 샘플을 제공하는 데 도움을 주신 국립 대학 병원, 이비인후과 국립대학 병원의 외과 의사 및 외과 팀에 감사드립니다. 이 연구는 National Medical Research Council, Singapore No.의 지원을 받았습니다. NMRC / CIRG / 1458 / 2016 (De Yun Wang까지) 및 MOH-OFYIRG19may-0007 (Kai Sen Tan까지). Kai Sen Tan은 유럽 알레르기 및 임상 면역학 (EAACI) Research Fellowship 2019의 펠로우십 지원을 받았습니다.

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<li>Luukkainen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+co-culture+model+of+PBMC+and+stem+cell+derived+human+nasal+epithelium+reveals+rapid+activation+of+NK+and+innate+T+cells+upon+Influenza+A+virus+infection+of+the+nasal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">A co-culture model of PBMC and stem cell derived human nasal epithelium reveals rapid activation of NK and innate T cells upon Influenza A virus infection of the nasal epithelium.</a> Frontiers in Immunology. 9, 2514(2018).</li>
<li>Tan, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+sequencing+of+H3N2+influenza+virus-infected+human+nasal+epithelial+cells+from+multiple+subjects+reveals+molecular+pathways+associated+with+tissue+injury+and+complications%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">RNA sequencing of H3N2 influenza virus-infected human nasal epithelial cells from multiple subjects reveals molecular pathways associated with tissue injury and complications.</a> Cells. 8 (9), 986(2019).</li>
<li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+lipopolysaccharide+on+diesel+exhaust+particle-induced+junctional+dysfunction+in+primary+human+nasal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Pollution%22%5BJournal%5D)">Effect of lipopolysaccharide on diesel exhaust particle-induced junctional dysfunction in primary human nasal epithelial cells.</a> Environmental Pollution. 248, 736-742 (2019).</li>
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<li>Tan, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+transcriptomic+and+metagenomic+analyses+of+influenza+virus-infected+nasal+epithelial+cells+from+multiple+individuals+reveal+specific+nasal-initiated+signatures%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparative transcriptomic and metagenomic analyses of influenza virus-infected nasal epithelial cells from multiple individuals reveal specific nasal-initiated signatures.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2685(2018).</li>
<li>Cytokine /Chemokine Panel II 96 Well Plate Assay. Millipore Corporation. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.merckmillipore.com/SG/en/product/MILLIPLEX-MAP-Human-Cytokine-Chemokine-Magnetic-Bead-Panel-II-Premixed-23-Plex-Immunology-Multiplex-Assay,MM_NF-HCP2MAG-62K-PX23?#documentation">https://www.merckmillipore.com/SG/en/product/MILLIPLEX-MAP-Human-Cytokine-Chemokine-Magnetic-Bead-Panel-II-Premixed-23-Plex-Immunology-Multiplex-Assay,MM_NF-HCP2MAG-62K-PX23?#documentation</a> (2020).</li>
<li>Gamage, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+human+nasal+epithelial+cells+with+SARS-CoV-2+and+a+382-nt+deletion+isolate+lacking+ORF8+reveals+similar+viral+kinetics+and+host+transcriptional+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Infection of human nasal epithelial cells with SARS-CoV-2 and a 382-nt deletion isolate lacking ORF8 reveals similar viral kinetics and host transcriptional profiles.</a> PLoS Pathogens. 16 (12), 1009130(2020).</li>
<li>Zhao, X. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+nasal+epithelial+stem%2Fprogenitor+cells+to+produce+functioning+ciliated+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Rhinology+%26+Allergy%22%5BJournal%5D)">The use of nasal epithelial stem/progenitor cells to produce functioning ciliated cells in vitro.</a> American Journal of Rhinology & Allergy. 26 (5), 345-350 (2012).</li>
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모든 저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

바이러스에 대한 선천적 면역 반응은 항 바이러스 관리에 대한 조사가 부족한 연구 분야입니다. 기도 상피 세포와 선천적 면역 세포는 바이러스 부하가 유지되지 않을 경우 과민성 적응 반응의 결정 요인으로 작용하는 것 외에도 감염 중에 바이러스 복제를 억제하기 위해 함께 작용합니다12,13,17. 그러나, 적절한 항바이러스 반응을 부여하기 위해 선천적 면역 세포의 활성화를 조사하기 위한 상피-선천적 면역 누화의 연구를 위한 관련 인간 모델의 개발은 여전히 과제로 남아 있다. 따라서, 이러한 ALI 공동-배양 모델은 비강 상피층과 면역 세포 사이의 상호작용의 전체 숙주를 평가하는데 사용될 수 있는 다목적 기술을 나타낸다. 이 모델은 시험관 내 분화된 hNECs, 유세포 분석기를 통한 PBMC 활성화 분석 및 바이러스 감염을 결합함에 따라, 이 프로토콜의 성공을 보장하기 ...

호흡기 바이러스는 아마도 심각한 건강 관리 및 경제적 부담을 초래하는 가장 널리 퍼진 병원체 중 하나 일 것입니다. 신흥 유행성 균주 (예 : H1N1, H5N1, H3N2, MERS, COVID-19)의 정기적 인 세계적 발병에서부터 매년 인플루엔자의 계절적 변종에 이르기까지 바이러스는 공중 보건에 지속적인 위협이됩니다. 백신이 이러한 세계 공중 보건 문제에 대한 대응의 주요 대부분을 형성하지만, 이러한 대응 조치는 단지 1,2에 불과하다는 점에 유의하는 것은 냉정합니다. 또한, 새로운 감염성 균주의 출현과 백신의 성공적인 개발 사이의 지연은 불가피하며3, 바이러스의 확산을 억제하기 위한 가능한 조치가 매우 제한적인 시기로 이어진다.
이러한 지연은 경제적, 사회적으로 사회에 가해지는 비용에 의해 더욱 강조됩니다. 계절성 독감 만 간접 비용으로 약 80 억 달러, 의료 비용 3.2 억 달러, 미국에서 매년 36.3 천 명의 사망자를 초래합니다4. 이것은 백신 개발 자금을 조달하는 데 필요한 연구 비용을 고려하기 전입니다. 전염병 발생은 심각한 급성 호흡기 증후군 코로 노 바이러스 2 (SARS-CoV-2)5,6,7의 출현과 급속한 확산으로 인한 세계적인 혼란으로 입증 된 바와 같이 매년 세계화의 증가율에 의해 복합적으로 사회에 더욱 심각한 영향을 미칩니다.
최근 연구에 따르면 활성화 된 선천적 T 세포 집단이 더 많은 감염된 환자는 더 나은 질병 결과 8,9,10을 갖는 경향이 있습니다. 더욱이, 선천적 T 세포 집단은 다수의 하위군으로 분류된다: 점막-관련 불변 T (MAIT) 세포, Vδ1 γδ T 세포, Vδ2 γδ T 세포, 및 자연 살해 T (NKT) 세포. 선천적 T 세포의 이들 하위군은 또한 그들의 집단 내에서 이질성을 나타내어, 선천적 면역 반응에 관여하는 세포 집단 사이의 상호작용의 복잡성을 증가시킨다(11). 따라서, 이러한 선천적 T 세포를 활성화시키는 메카니즘 및 선천적 T 세포의 특정 하위군에 대한 지식은 특히 백신 개발 기간 동안 인간 숙주에 대한 이들 바이러스의 감염성 효과를 감소시키기 위한 연구의 다른 길을 제공할 수 있다.
인플루엔자에 의해 감염된 상피 세포는 선천적 T 세포를 빠르게 활성화시키는 인자를 생산한다12,13,14. 이러한 발견을 바탕으로 이 비접촉식 공기-액체 인터페이스(ALI) 공동 배양 모델은 초기 감염 동안 감염된 비강 상피층과 PBMC 사이의 초기 화학적 상호작용(감염된 상피층에 의해 방출되는 가용성 인자에 의해 매개됨)을 모방하는 것을 목표로 합니다. 비강 상피층(막 삽입물에서 배양됨)과 PBMCs(아래 챔버 내) 사이의 물리적 분리와 상피 완전성은 바이러스에 의한 PBMC의 직접적인 감염을 방지하여, 상피 유래 가용성 인자가 PBMC에 미치는 영향에 대한 상세한 연구를 가능하게 한다. 따라서 확인된 인자는 인플루엔자 감염으로부터 보호할 수 있는 적절한 선천적 T 세포 집단을 유도하는데 있어서 그들의 치료 잠재력에 대해 추가로 조사될 수 있다. 따라서이 논문은 상피 유래 가용성 인자로부터의 선천적 T 세포 활성화의 연구를 위한 공동 배양을 확립하는 방법을 상세히 기술하였다.

<table><tbody><tr><td>0.5% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), pH 8.0, RNase-free</td><td>Thermofisher</td><td>AM9260G</td><td>0.5M EDTA</td></tr><tr><td>1.5 mL SafeLock 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>0030120086</td><td>1.5mL 원심분리기 튜브</td></tr><tr><td>10 mL K3EDTA 진공 튜브</td><td>BD</td><td>366643</td><td>10mL 채혈 튜브</td></tr><tr><td>10x dPBS</td><td>Gibco</td><td>14200-075</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Vivantis</td><td>PC0711</td><td></td></tr><tr><td>12-웰 플레이트</td><td>코닝&nbsp;</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>12-웰 트랜스웰 인서트</td><td>코닝&nbsp;</td><td>3460</td><td>멤브레인 인서트</td></tr><tr><td>1x FACS 용해 용액</td><td>BD</td><td>349202</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL SafeLock 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td>2 mL 원심분리기 튜브</td></tr><tr><td>24-웰 플레이트</td><td>Corning&nbsp;</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>24-웰 트랜스웰 인서트</td><td>코닝&nbsp;</td><td>3470</td><td></td></tr><tr><td>3% 아세트산, 메틸렌 블루</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07060</td><td></td></tr><tr><td>3,3',5-트리요오도-l-티로닌</td><td>Sigma</td><td>T-074</td><td></td></tr><tr><td>37% 포름알데히드 용액, H2O</td><td>Sigma</td><td>533998</td><td></td></tr><tr><td>5810R 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5811000320</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 폴리프로필렌 튜브 (플로우 튜브)</td><td>BD</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m 셀 스트레이너</td><td>코닝&nbsp;</td><td></td><td></td>431751</tr><tr><td>A-4-62 로터</td><td>Eppendorf</td><td>5810709008</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Gibco</td><td>A1110501</td>세포 <td>해리 시약</td></tr><tr><td>항생제-항진균제</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Avicel CL-611</td><td>FMC 바이오폴리머</td><td>NA</td><td>액체 오버레이</td></tr><tr><td>Bio-Plex Manager 6.2 표준 소프트웨어</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc</td><td>171STND01</td><td>멀티플렉스 매니저 소프트웨어</td></tr><tr><td>버터플라이 바늘 21 G</td><td>BD</td><td>367287</td><td></td></tr><tr><td>콜레라 독소</td><td>시그마</td><td>C8052</td><td></td></tr><tr><td>크리스탈 바이올렛&nbsp;</td><td>Merck</td><td>C6158</td><td></td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm 솔루션</td><td>BD</td><td>554722</td><td>고정 및 투과화 솔루션</td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma</td><td>D4693</td><td>중성 프로테아제</td></tr><tr><td>DMEM/고포도</td>당 <td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/영양 혼합물 F-12</td><td>Gibco-Invitrogen</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>dNTP 믹스</td><td>Promega</td><td>U1515</td><td>dNTP Mix</td></tr><tr><td>EMEM (w L-Glutamine)</td><td>ATCC</td><td>30-2003</td><td></td></tr><tr><td>EVOM 전압저항계 장치</td><td>WPI, Sarasota, FL, USA</td><td>300523</td><td></td></tr><tr><td>FACS 용해 용액</td><td>BD</td><td>349202</td><td>1x 용해 용액</td></tr><tr><td>팔콘 튜브 15 mL</td><td>CellStar</td><td>188271</td><td>15 mL 튜브</td></tr><tr><td>팔콘 튜브 50 mL</td><td>CellStar</td><td>227261</td><td>50 mL 튜브</td></tr><tr><td>빠른 시작 필수 DNA 프로브 Master</td><td>Roche</td><td>6402682001</td><td>qPCR 마스터 믹스</td></tr><tr><td>Ficoll Paque 프리미엄</td><td>연구 기기</td><td>17544203</td><td>밀도 그라디언트 미디어</td></tr><tr><td>H3N2 (A/Aichi/2/1968)&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>VR547</td><td></td></tr><tr><td>H3N2 M1 순방향 프라이머 시퀀스</td><td>시그마</td><td>5'- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3'H3N2</td><td></td></tr> <tr><td>M1 리버스 프라이머 시퀀스</td><td>시그마</td><td>5'- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3'H3N2</td><td></td></tr> <tr><td>NS1 순방향 프라이머 시퀀스</td><td>시그마</td><td>5'- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3'H3N2</td><td></td></tr> <tr><td>NS1 리버스 프라이머 시퀀스</td><td>시그마</td><td>5'- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3'Heat</td><td></td></tr> <tr><td>Inactivated Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>hNESPCs</td><td>Human Donors</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Human Epithelial Growth Factor</td><td>Gibco-Invitrogen</td><td>PHG0314</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>STEMCELL Techonologies</td><td>7925</td><td>중격 절곡 수술</td></tr> <tr><td>중 코 생검에서 수집인슐린</td><td>시그마</td><td>I3536</td><td></td></tr><tr><td>Lightcycler 96</td><td>Roche</td><td>5815916001</td><td>qPCR 기기</td></tr><tr><td>라이브/데드 블루 셀 염색 키트 *UV 여기용</td><td>Thermofisher</td><td>L23105</td><td>생존력 염색</td></tr><tr><td>MILLIPLEX MAP 인간 사이토카인/케모카인 마그네틱 비드 패널 II - 사전 혼합 23 Plex</td><td>Merck Pte Ltd</td><td>HCP2MAG-62K-PX23</td><td>면역학 다중 분석</td></tr><tr><td>미토마이신 C</td><td>Sigma</td><td>M4287</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV 5x Buffer</td><td>Promega</td><td>M1705</td><td>RT-PCR 5x Buffer</td></tr><tr><td>M-MLV Reverse Transcriptase</td><td>Promega</td><td>M1706</td><td>Reverse Transcriptase</td></tr><tr><td>N-2 supplement</td><td>Gibco-Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>NIH/3T3</td><td>ATCC</td><td>CRL1658</td><td></td></tr><tr><td>Perm/Wash Buffer</td><td>BD</td><td>554723</td><td>Permeabilization 세척 버퍼</td></tr><tr><td>PneumaCult-ALI 10x 보충제</td><td>STEMCELL Techonologies</td><td>5001</td><td></td></tr><tr><td>PneumaCult-ALI 기초 매체</td><td>STEMCELL Techonologies</td><td>5001</td><td></td></tr><tr><td>PneumaCult-ALI 유지 보수 보충제 (100x)</td><td>STEMCELL Techonologies</td><td>5001</td><td></td></tr><tr><td>랜덤 프라이머</td><td>Promega</td><td>C1181</td><td>랜덤 프라이머</td></tr><tr><td>재조합 Rnasin Rnase 억제제</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td>RNase 억제제</td></tr><tr><td>RNA 용해 완충액</td><td>Qiagen</td><td>부품 52904</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 (w L-글루타민)</td><td>ATCC</td><td>30-2001</td><td></td></tr><tr><td>STX2 전극</td><td>WPI, Sarasota, FL, USA</td><td>STX2</td><td>전극</td></tr><tr><td>T25 플라스크</td><td>코닝</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>T75 플라스크</td><td>코닝</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>TPCK Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Hyclone</td><td>SV30084.01</td><td></td></tr><tr><td>바이러스 RNA 추출 키트</td><td>Qiagen</td><td>52904</td><td>바이러스 RNA 추출 키트</td></tr><tr><td>V자형 96웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>3894</td><td></td></tr></tbody></table>

호흡기 바이러스 감염 동안 선천적 면역 세포 활성화의 연구를 위한 비접촉식 공동 배양 모델

Contact-Free Co-Culture Model for the Study of Innate Immune Cell Activation During Respiratory Virus Infection

바이러스 감염 중 비강 상피층과 선천적 면역 세포 사이의 초기 상호 작용은 아직 탐구되지 않은 영역으로 남아 있습니다. 바이러스 감염에서 선천적 면역 신호전달의 중요성은 높은 선천적 T 세포 활성화를 나타내는 호흡기 감염 환자가 더 나은 질병 결과를 보임에 따라 실질적으로 증가하였다. 따라서, 이러한 초기 선천적 면역 상호작용을 해부하는 것은 이들을 지배하는 과정의 해명을 허용하고, 바이러스 감염의 초기 진행을 감쇠시키거나 심지어 예방하기 위한 잠재적인 치료 표적 및 전략의 개발을 촉진할 수 있다. 이 프로토콜은 바이러스적으로 감염된 기도 상피 세포에 의해 분비되는 인자로부터 초기 누화, 상호작용 및 선천적 면역 세포의 활성화를 연구하는데 사용될 수 있는 다목적 모델을 상세히 기술한다. 대표적인 바이러스 모델로 H3N2 인플루엔자 바이러스(A/Aichi/2/1968)를 사용하여 공동 배양된 말초혈액 단핵구(PBMCs)의 선천적 세포 활성화를 유세포 분석기를 사용하여 바이러스 감염에 반응하여 상피에서 방출되는 가용성 인자에 의해 활성화되는 세포의 하위 집합을 조사하기 위해 분석되었습니다. 이 결과는 세포의 서브셋을 분화시키기 위한 게이팅 전략을 입증하고, PBMCs의 활성화된 집단과 대조군 및 감염된 상피와의 그들의 누화 사이의 명확한 차이를 드러낸다. 그 다음, 활성화된 서브세트는 그들의 기능뿐만 아니라 세포에 특이적인 분자 변화를 결정하기 위해 추가로 분석될 수 있다. 이러한 누화 조사의 결과는 바이러스 감염의 진행을 통제하고 억제하는 데 도움이되는 중요한 선천적 세포 집단의 활성화에 중요한 요인을 발견 할 수 있습니다. 또한, 이러한 요인은 다른 바이러스 질환, 특히 새로 출현하는 바이러스에 보편적으로 적용되어 순진한 인간 집단에서 처음 순환 할 때 그러한 바이러스의 영향을 약화시킬 수 있습니다.

기존의 T 세포가 바이러스 제거를 촉진하기 위해 바이러스 감염에 대한 적응 면역 반응의 주요 레퍼토리를 형성하지만, 선천적 인 T 세포 집단은 나중 단계에서 효과적인 클리어런스를 위해 바이러스 부하를 억제하기 위해 더 넓은 스펙트럼에 걸쳐 작동합니다. 따라서, 이 프로토콜은 특히 동일한 기증자로부터의 상피 및 면역 세포 샘플을 필요로 하지 않고 인플루엔자 감염 후 선천적 T 세포, 그들의 활성화 및 그들의 기능적 집단을 연구할 수 있는 강력한 조건을 생성한다. 이 프로토콜은 다른 바이러스에도 적용될 수 있지만, 정점 방출을 갖는 바이러스로 제한될 수 있지만, 즉, 어떠한 바이러스도 PBMC 구획과 접촉하기 위해 기저층으로 진입해서는 안 된다.
도 1의 대표적인 결과에 기초하여, 이 프로토콜은 3T3 피더 층에서...

이 프로토콜은 바이러스적으로 감염된 비강 상피 세포와 선천적 세포 활성화 사이의 초기 상호 작용에 대한 조사를 자세히 설명합니다. 면역 세포의 개별 서브세트는 바이러스 감염에 대한 반응에서의 그들의 활성화에 기초하여 구별될 수 있다. 그런 다음 초기 항 바이러스 반응에 미치는 영향을 결정하기 위해 더 조사 할 수 있습니다.

The early interactions between the nasal epithelial layer and the innate immune cells during viral infections remains an under-explored area. The ...

이 프로토콜은 상피 세포와 첫 번째 라인 선천적 면역 세포, 특히 우리의 관심사 인 선천적 인 T 세포의 누화를 조사하기 위해 고안되었습니다. 인간 근원의 일차 세포는이 기술에 사용되어 인간에서 일어나는 일과 관련된 생리 학적 누화에 대한 개별적인 조사를 가능하게합니다. 선천적 T 세포는 인플루엔자 감염 환자의 생존을 개선하는 데 연루되어 있다.그들이 어떻게 활성화되는지 알면 항 인플루엔자 및 항 바이러스 요법을 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 선천적 인 T 세포를 활성화시킬 수있는 요인을 식별하도록 설계되었으며, 이는 호흡기 바이러스 감염에 대한 예방 조치를 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다. 제로 데이에 인간 비강 상피 세포 또는 HNEC를 감염시킵니다.먼저, 150 마이크로리터의 1x 트립신 EDTA를 멤브레인 인서트의 정점 챔버에 첨가하고 350 마이크로리터의 1x 트립신 EDTA를 대표 웰의 기저 챔버에 첨가하여 세포를 계수한다. 세포를 섭씨 37도에서 10분 동안 또는 세포가 막으로부터 분리될 때까지 배양한다. 세포를 위아래로 피펫팅하여 멤브레인 상에 플러시하고 현탁액을 1.5 밀리리터 원심분리 튜브에 수집한다.트립신 활성을 급냉시키기 위해 200 마이크로리터의 DMEM을 첨가한다. 그런 다음, 트리판 블루 염색을 통해 세포를 계수한다. 웰당 세포 수를 기준으로 바이러스의 필요한 감염 다중도 또는 MOI를 계산합니다.얼음 위에 완전한 RPMI로 그에 따라 바이러스 스톡을 희석하십시오. 감염 실험을 위한 나머지 웰의 경우, 멤브레인 인서트의 정점 챔버에 1x DPBS 1개를 첨가한다. 섭씨 37도에서 10분 동안 배양하고 1x DPBS를 제거하였다.멤브레인 인서트의 기본 배지를 완전한 RPMI 배지로 변경하여 인서트를 웰에 완전한 RPMI가 추가된 새로운 플레이트로 옮기면 완전한 RPMI 배지가 된다. 준비된 바이러스 접종물을 막 삽입물의 정점 챔버에 첨가하십시오. 섭씨 35도에서 5% 이산화탄소 분위기에서 한 시간 동안 배양하고 정점 챔버에서 바이러스 접종물을 제거한다.멤브레인 인서트의 기본 배지를 신선한 RPMI 배지로 변경하고 5% 이산화탄소 분위기에서 섭씨 35도에서 24 내지 72시간 동안 배양한다. 필요한 수의 말초 혈액 단핵 세포 또는 PBMCs를 완전한 RPMI 배지에 시드하고, PBMC 현탁액을 감염된 HNECs의 각 웰의 기저 챔버 내로 직접 첨가함으로써 제로로부터 시드한다. 섭씨 37도에서 24 ~ 48 시간 동안 배양하십시오.정점 상청액을 수집하려면 각 정점 챔버에 1x DBPS를 추가하고 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 DPBS를 1.5 밀리리터 튜브에 수집하십시오. 플라크 분석을 위해 상청액을 새로운 1.5 밀리리터 튜브에 분취시키고 영하 80도에서 주식과 분취량을 즉시 동결시킵니다.RNA 형태의 HNEC를 수집하려면 멤브레인 삽입물을 깨끗한 웰로 옮깁니다. RNA 용해 완충액을 정점 챔버에 첨가하고 실온에서 다섯 분 동안 인큐베이션한다. 상층액을 1.5밀리리터 원심분리 튜브에 모아 분자 분석을 위해 RNA가 추출될 때까지 섭씨 영하 80도에 보관합니다.마지막으로, 멸균 피펫 팁의 넓은 베이스로 웰의 표면을 부드럽게 긁어내어 웰 표면에 부착될 수 있는 활성화된 PBMCs를 제거함으로써 PBMCs를 수확한다. PBMCs를 함유하는 기초 배지를 두 밀리리터 원심분리 튜브에 수집한다. 300 마이크로리터의 1x DPBS로 웰을 두 번 플러시하고 동일한 2 밀리리터 튜브에서 세척을 수집하십시오.두 밀리리터 튜브를 원심분리하고, 세포 펠릿을 방해하지 않고 신선한 두 밀리리터 튜브에서 상청액을 수집한다. 흡기 된 상청액을 사이토 카인 및 케모카인 분석을 위해 영하 80도에 보관하십시오. 나머지 세포 펠릿을 200 마이크로리터의 1x DPBS에 재현탁시킨다.이 프로토콜은 동일한 기증자로부터의 상피 및 면역 세포를 필요로 하지 않고 인플루엔자 감염 후 선천적 T 세포를 연구하는데 사용될 수 있다. HNESPCs가 3T3 피더 층 상에서 성장할 때 예상되는 진행의 샘플이 여기에 도시되어 있다. 이들은 기능성, 섬모 및 잔 세포를 가진 다층 HNEC를 얻기 위해 공기 / 액체 계면 배양에서 분화에 사용되었습니다.HNECs를 사용하여, 선천적 T 세포 활성화는 유세포 분석기를 사용하여 조사될 수 있다. 이들 결과는 점막-관련 불변 T, 또는 MAIT 세포, V 델타원, 감마 델타 T 세포, 및 자연 살해 T, 또는 NKT 세포의 검출을 보여준다. 이들 세포는 인플루엔자 바이러스에 감염된 HNECs를 수반하는 공동 배양에서 유의하게 증가하였다.이 설정은 이어서 다른 인플루엔자 바이러스 균주 또는 선천적 면역 세포 집단에 적용되어 감염된 상피 세포와의 공동 배양 조건 하에서 이들의 각각의 활성화를 관찰할 수 있다. 감염의 올바른 다중성이 사용되도록 하기 위해 인간 비강 상피 세포의 수를 정확하게 계산하는 것은 최적의 수준과 활성화 타이밍에 중요하다. 상피 세포와 선천적 면역 세포 사이의 누화는 점점 더 주목을 받고 있으며, 이는 급성 또는 만성 호흡기 면역학을 포함하는 다른 방법에 추가로 적용될 수 있습니다.

contact-free-co-culture-model-for-study-innate-immune-cell-activation

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Source: Montefusco-Pereira, C. V. et al. P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives. J. Vis. Exp.(2020)This video demonstrates a co-culture model of bronchial epithelial cells and macrophage-like cells at the air-liquid interface to study host-pathogen interactions. Pathogenic bacterial infection compromises epithelial membrane integrity, triggering macrophage-like cell activation and...

Establishing a Co-Culture Model to Study Host-Pathogen Interactions at the Air-Liquid Interface

이 비디오는 쥐의 폐에 서식하는 면역 세포를 식별하는 체외 기술을 보여줍니다. 쥐의 폐 조직에서 표적 면역 세포를 분리한 후, 선천성 및 적응 면역 세포의 특정 마커에 대해 형광단 표지 항체 칵테일을 사용하여 표면 표지됩니다. 또한 단핵구, 대식세포 및 수지상 세포는 세포 내 마커를 사용하여 표지됩니다. 그런 다음 유세포 분석을 사용하여 다양한 면역 세포 유형을 식별합니다.

쥐의 폐에 서식하는 선천적 및 적응적 면역 세포를 식별하는 In vitro 방법

이 보고서의 연구 결과와 결론은 저자의 이러한하며 반드시 질병 통제 예방 센터 (CDC)의 의견을 대표하지 않습니다.

양극화 인간기도 액체 덮인 문화를 구축 호흡기 병원균에 대한 숙주 세포 응답을 공부하는 상피 Calu-3 전지<em&gt; 체외에서</em

인간 자원 봉사자의 표면 부스러기 생검을 통해 얻은 비강 상피 세포, 조직 배양 인서트로 확장 및 전송됩니다. 포화 상태에 도달하면, 세포는 섬모와 비 섬모 세포의 문화를 산출, 공기 액체 계면에서 재배되고 있습니다. 차별화 된 비강 상피 세포 배양은 호흡기 점막을 공부 가능한 실험 모델을 제공합니다.

에어 리퀴드 인터페이스에서 인간의 비강 상피 세포의 배양

인간 호흡기 세포융합 바이러스(HRSV)는 어린 유아에게 심각한 세기관지염을 유발할 수 있습니다. 중증 HRSV 질환의 발병 기전 중 일부는 숙주 면역 반응에 의해 발생합니다. HRSV를 이용한 일차 인간 면역 세포의 자극은 염증 경로 및 감염의 활성화를 연구하기 위한 빠르고 재현 가능한 모델 시스템을 제공합니다.

인간 호흡기 세포융합 바이러스 감염에 대한 인간 말초 혈액 단핵 세포의 면역 반응을 연구하기 위한 체외 모델

이 연구에서는 선물이 인플루엔자 바이러스 감염 후 murine tracheal 점 막에서 2 광자 intravital 이미징 및 세포 상호 작용 분석을 수행 하는 프로토콜. 이 프로토콜은 호흡기 감염 시 면역 세포 역학을 공부 하는 연구자와 관련이 있을 것입니다.

영상 셀 상호 작용 Tracheal 점 막에서 2 광자 Intravital 현미경 검사 법을 사용 하 여 인플루엔자 바이러스 감염 중

당사는 CFBE41o-세포, THP-1 대식세포 및 슈도모나스 아에루기노사(공기-액체인터페이스)에 설립된 감염된 기도의 3차원 공동 배양 모델에 대한 프로토콜을 설명합니다.- 이 모델은 항생제 효능, 상피 장벽 기능 및 염증 성 마커를 동시에 테스트하는 새로운 플랫폼을 제공합니다.

P. 아루기노사 감염된 3D 기관상피세포 및 대식세포의 공동 배양

헤모필루스 인플루엔자는 호흡기에서 염증을 유발합니다. 이 기사에서는 이 박테리아에 대한 반응으로 식세포와 림프구에 의한 면역 반응을 정의하기 위해 유세포분석 및 컨포칼 현미경을 사용하는 방법에 중점을 둘 것입니다.

헤모필루스 인플루엔자에 대한 호흡기 면역 반응 평가

비강 상피는 모든 호흡기 병원체가 만나는 주요 장벽 부위입니다. 여기에서는 생리학적으로 관련된 시스템에서 인간 코로나바이러스-숙주 상호 작용을 특성화하기 위해 공기-액체 인터페이스(ALI) 배양으로 성장한 일차 비강 상피 세포를 사용하는 방법을 간략하게 설명합니다.

인간 코로나바이러스-숙주 상호작용을 특성화하기 위해 공기-액체 계면에서 성장한 일차 비강 상피 세포의 감염

여기에 제시된 것은 장기 바이오뱅킹을 위한 원발성 기관지 상피 세포의 분리 및 확장과 공기-액체 계면에서 배양에 의한 분화된 상피 세포의 생성을 위한 재현 가능하고 저렴하며 강력한 방법입니다.

바이오뱅킹을 위해 절제된 폐 조직에서 기관지 상피 세포를 분리하고 잘 분화된 공기-액체 계면 배양을 확립합니다.

이 논문에서는 공기-액체 계면 배양에서 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 유래 폐 상피, 중간엽, 내피 세포 및 대식세포로 구성된 복잡한 다세포 기도 장벽 모델의 생성에 대해 설명합니다.

폐 건강 및 질환에서 기도 장벽 무결성을 모델링하기 위한 iPSC 유래 상피, 중간엽, 내피 및 면역 세포 공동 배양

학습하세요 호흡기 바이러스 감염 시 비접촉식 공동 배양 모델을 이용한 상피세포와 선천성 면역세포 간 상호작용 분석 방법. 이 기술은 선천성 T세포 활성화 메커니즘 규명 및 항바이러스 치료제 개발에 활용됩니다.

호흡기 바이러스 감염 동안 선천적 면역 세포 활성화의 연구를 위한 비접촉식 공동 배양 모델

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