Name: 아이소피크닉 밀도 구배 정제에 의한 U937 세포의 세포 분획 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: 배우세요 아이소피크닉 밀도 구배 정제를 이용한 U937 세포의 세포질, 핵, 미토콘드리아, 막 단백질 분리 방법. 이 기법은 최소한의 계면활성제 사용으로 재현성 높은 결과를 제공합니다.

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이 작업은 NIH R15-HL135675-01 및 NIH 2 R15-HL135675-02에서 TJL로 지원되었습니다.

1. 완충액 및 시약 준비
<ol><li>포스파타아제와 프로테아제 억제제의 신선한 용액을 준비하십시오.<ol><li>100% 에탄올 1mL에 페닐메탄설포닐플루오라이드(PMSF) 17.4mg을 첨가하여 100mM 스톡을 제조하였다. 알림: PMSF를 섭취하거나 흡입하거나 피부나 눈에 닿으면 위험하므로 취급할 때는 보호 장비를 착용하십시오. 눈과 피부에 부식성이 있습니다.</li>
		<li>제조업체의 지침에 따라 시판되는 프로테아제 억제제 칵테일(100x)을 준비합니다.</li>
		<li>91.9mg의 나트륨 오르토바나데이트(SOV)를 1mL의 탈이온수에 첨가하여 500mM 스톡을 제조합니다. 알림: SOV를 섭취하거나 흡입하거나 눈에 닿으면 위험하므로 취급 시 보호 장비를 착용하십시오. 심한 과다 노출은 사망을 초래할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>용해 완충액 A, 세포질 분리 (CI) 완충액, 세포 가용화 (CS) 완충액, 핵 용해 (NL) 완충액, 용해 완충액 B, 세포 균질화 (CH) 완충액, 요오드 산올 희석제 및 세제를 준비합니다.<ol><li>8.7g의 염화나트륨 (NaCl)과 50mL의 4- (2- 하이드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (hepes, 1M, pH 7.4)을 950mL의 탈 이온수에 첨가하여 용해 완충액 A (최종 농도 150mM NaCl 및 50mM hepes)를 준비합니다.</li>
		<li>다음과 같이 세제의 저장 용액을 준비하십시오 : 용해 완충액 A 10mL (최종 농도 1 % SDS)에 0.1g의 나트륨 도데 실 설페이트 (SDS)를 첨가하고, 용해 완충액 A 10mL (최종 농도 1 %)에 0.1g의 데 옥시 콜산 나트륨을 첨가하고, 용해 완충액 A 10mL (최종 농도 250μg / mL)에 2.5mg의 digitonin을 첨가하고, 1mL의 비이온성, 비변성 세제( 재료 표 참조)를 9mL의 용해 완충액 A(최종 농도 10%(v/v))에 추가합니다.</li>
		<li>10μL의 PMSF 스톡 (100 mM), 10 μL의 프로테아제 억제제 (100x), 2 μL의 SOV 스톡 (500 mM) 및 100 μL의 스톡 디토닌 (250 μg / mL)을 878 μL의 용해 완충액 A (1 mM PMSF, 1x 프로테아제 억제제, 1 mM SOV 및 25 μg / mL digitonin의 최종 농도)에 첨가하여 CI 완충액을 준비합니다. 세포 펠릿에 첨가 될 때까지 용액을 얼음 위에 보관하십시오.</li>
		<li>10μL의 PMSF 스톡(100mM), 10μL의 프로테아제 억제제(100x), 2μL의 SOV 스톡(500mM), 100μL의 비이온성, 비변성 세제 스톡( 재료 표 참조)(10%), 및 118μL의 헥실렌 글리콜 스톡(8.44M)을 760μL의 용해 완충액 A(1mM PMSF의 최종 농도, 1x 프로테아제 억제제, 1 mM SOV, 1 % 비 이온성, 비 변성 세제 및 1 M 헥 실렌 글리콜). 세포 펠릿에 첨가 될 때까지 용액을 얼음 위에 보관하십시오.</li>
		<li>10μL의 PMSF 스톡 (100 mM), 10 μL의 프로테아제 억제제 (100x), 2 μL의 SOV 스톡 (500 mM), 50 μL의 나트륨 데옥시콜레이트 스톡 (10%), 100 μL의 SDS 스톡 (1%) 및 118 μL의 헥실렌 글리콜 스톡 (8.44 M)을 710 μL의 용해 완충액 A (1 mM PMSF의 최종 농도, 1x 프로테아제 억제제, 1 mM SOV, 0.5 % 나트륨 데 옥시 콜레이트 (v / v), 0.1 % SDS (w / v) 및 1 M 헥 실렌 글리콜). 핵 펠릿에 첨가 될 때까지 용액을 얼음 위에 보관하십시오.</li>
		<li>헤페스 20mL (1M, pH 7.4), 염화칼륨 (KCl) 0.74g, 염화마그네슘 (MgCl2) 0.19g, 에틸렌 디아민테트라 아세트산 2mL (0.5M EDTA), 에틸렌 글리콜 비스 (β- 아미노 에틸 에테르) -N, N, N', N'- 테트라 아세트산 (0.5M EGTA), 만니톨 38.3g 및 자당 23.9g을 탈이온수 980mL에 첨가하여 용해 완충액 B (최종 농도 20mM HEPES, 10 mM KCl, 2 mMMgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 210 mM 만니톨, 및 70 mM 수크로스).</li>
		<li>988μL의 용해 완충액 B에 10μL의 PMSF 스톡 (100mM) 및 2μL의 SOV 스톡 (500mM)을 첨가함으로써 CH 완충액을 준비한다 (1mM PMSF 및 1mM SOV의 최종 농도; 용해되는 세포의 수를 수용하도록 최종 부피를 조정). 세포 펠릿에 첨가 될 때까지 용액을 얼음 위에 보관하십시오.</li>
		<li>88 mL의 탈이온수(최종 농도 120 mM HEPES, 60 mM KCl, 12 mMMgCl2, 6 mM EDTA, 6 mM EGTA, 1200 mM 만니톨, 및 420 mM 수크로오스).</li>
		<li>완충액은 4 ° C에서, 디지토닌은 -20 ° C에서 보관하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 세포질 단백질 분리
참고: 다음 단계는 U937 세포의 성장 및 확장과 세포질 단백질의 추출을 허용합니다. 사용 된 농도에서 digitonin은 원형질막을 방해하지 않고 투과시켜 세포질 단백질의 방출과 다른 세포 단백질의 보유를 허용합니다.
<ol><li>세포를 RPMI 1640에서 37°C에서 10% 소 태아 혈청 및 5%CO2로 배양한다. 세포가 최종 합계 6 x 108 세포로 성장하는지 확인합니다. 참고: 이 프로토콜에서, 세포는 표준 혈구계 및 현미경을 사용하여 계수되었다.</li>
	<li>배양된 세포를 400×g에서 10 분 동안 원 심분리합니다. 상청액을 버린 후 세포 펠릿을 실온 인산염 완충 식염수(PBS)에 4 × 106 cells/mL의 최종 농도로 재현탁하고 부드럽게 피펫하여 덩어리를 분해합니다.</li>
	<li>세포 현탁액을 400 ×g에서 10 분 동안 원 심분리하여 세포를 펠릿화한다. 상청액을 폐기하고 세포 펠릿을 2 × 107 cells/mL의 최종 농도로 빙냉 용해 완충액 A(단계 1.2.1에서 제조)에 재현탁합니다.</li>
	<li>용해 완충액 A (3 × 107 세포)에 현탁된 7.5 mL의 세포를 제거하고, 핵 단백질 추출을 위해 얼음 위에 보관한다(섹션 6). 세포 현탁액을 4°C, 400 × g 에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화한다. 알림: 4 ° C 또는 얼음에서 모든 후속 단계를 수행하고 모든 버퍼를 미리 냉각하십시오.</li>
	<li>상청액을 버리고 세포 펠릿을 CI 버퍼에 2 × 107 cells/mL의 최종 농도로 재현탁하고 부드럽게 피펫하여 덩어리를 분해합니다. 세포 현탁액을 4°C에서 20분 동안 끝에서 끝까지 회전시킵니다.</li>
	<li>세포 현탁액을 4°C, 400 × g 에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 깨끗한 원심분리 튜브로 옮긴다. 세포 펠릿을 저장하고 얼음에 보관하십시오. 수집된 상청액을 4°C, 18,000 × g 에서 20분 동안 원심분리하여 세포 파편을 펠렛화한다. 참고: 이 고속 원심분리 단계는 세포질 분획이 세포 기관 및 막 결합 단백질로 오염되는 것을 방지하는 데 중요합니다.</li>
	<li>상청액을 깨끗한 원심분리 튜브로 옮긴 후 펠릿을 폐기하십시오. 원심분리 후 펠릿이 얻어지지 않을 때까지 2.6단계의 두 원심분리 단계를 반복합니다.</li>
	<li>세포질 분획 인 상청액을 수집하십시오. 단기 보관(1개월)의 경우, 상청액이 4°C에서 저장되는지 확인한다. 장기 보관(>1개월)을 위해 상청액을 1x 환원제가 포함된 1x Laemmli 완충액과 결합하고 95°C에서 7분 동안 가열하고 -20 또는 -80°C에서 보관하십시오.</li>
	<li>용해 완충액 A에 세포 펠릿(단계 2.6에서)을 4 × 106 cells/mL의 최종 농도로 재현탁합니다. 피펫을 부드럽게 사용하여 덩어리를 부수십시오.</li>
</ol>3. 세포 균질화
참고: 다음 단계는 미토콘드리아 및 막 단백질 분획의 분리에 필요한 디지토닌 처리된 세포(2.9단계에서)의 기계적 균질화를 허용합니다.
<ol><li>용해 완충액 A (단계 2.9에서 제조)에서 세포 현탁액을 원심분리하고, 펠릿을 저장하고, 상청액을 버리고 세포 펠릿으로부터 과량의 디지토닌 및 세포질 오염 물질을 제거한다. 알림: 과도한 세포질 오염 물질을 제거하기 위해 용해 완충액 A에서 반복적인 세척을 수행할 수 있습니다.</li>
	<li>세포 펠릿을 얼음처럼 차가운 CH 완충액(단계 1.2.7에서 제조됨)에 4 × 106 cells/mL의 최종 농도로 재현탁시킵니다. 세포 현탁액을 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.</li>
	<li>기계적 용해를 위해 비드 기반 방법을 사용하는 경우 미리 세척된 스테인리스 스틸 3.2mm 비드 30g을 50mL 스커트 튜브에 넣고 15mL의 용해 완충액 B를 채우고 얼음 위에 올려 식힙니다. Dounce 균질화기(꽉 끼는 B 유봉 포함)를 사용하는 경우 적절한 양의 용해 완충액 B를 채우고 유봉을 넣고 얼음 위에 올려 식힙니다.</li>
	<li>인큐베이션 후(단계 3.2), 용해 완충액 B를 비드 튜브(또는 Dounce 균질화기)로부터 버리고, 15mL의 세포 현탁액을 비드 튜브(또는 균질기에 적절한 부피)로 옮깁니다.</li>
	<li>비드 기반 방법을 사용하는 경우 셀 현탁액이 포함된 스커트 비드 튜브를 블렌더 장치에 놓고 속도 8에서 5분 동안 작동하도록 구성합니다. Dounce 균질화기를 사용하는 경우 얼음 위에 보관하고 느리고 균일한 스트로크를 사용하여 유봉으로 40회 패스를 수행합니다(또는 토론 섹션에 자세히 설명된 대로 기계적 세포 용해의 대체 방법을 활용). 알림: 여기에 사용된 것과 다른 블렌더 장치를 사용하는 경우 속도와 시간을 경험적으로 결정해야 할 수 있습니다.</li>
	<li>균질액을 깨끗한 원심분리 튜브로 옮기고 400× g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다. 상청액을 깨끗한 원심분리 튜브로 옮기고 저장합니다. 펠릿을 폐기하십시오. 참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지되고 균질액은 단기간(24시간) 동안 4°C에서 저장될 수 있습니다.</li>
</ol>4. 조잡한 미토콘드리아 및 막 분획의 파편 제거 및 분리
참고: 다음 단계는 균질액을 증가하는 속도로 원심분리하여 세포 파편을 제거할 수 있습니다. 그 다음에는 미토콘드리아 및 막 분획의 분리를 위한 차등 원심분리가 이어집니다.
<ol><li>균질액(단계 3.6으로부터)을 500 × g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리한다. 상청액을 깨끗한 원심분리기 튜브로 옮기고 펠릿을 버립니다.</li>
	<li>상청액(단계 4.1로부터)을 1,000 × g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리한다. 상청액을 깨끗한 원심분리기 튜브로 옮기고 펠릿을 버립니다.</li>
	<li>상청액(단계 4.2로부터)을 2,000 × g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리한다. 상청액을 깨끗한 원심분리기 튜브로 옮기고 펠릿을 버립니다.</li>
	<li>상청액(단계 4.3에서부터)을 4,000 × g 에서 4°C에서 20분 동안 원심분리한다. 상청액을 깨끗한 원심분리 튜브로 옮기고 미토콘드리아 분획인 펠릿을 저장합니다.</li>
	<li>상청액(단계 4.4로부터)을 18,000 × g 에서 4°C에서 1시간 동안 원심분리한다. 상청액을 버리고 조막 분획인 펠릿을 저장합니다. 참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지될 수 있으며 펠렛화된 샘플은 단기간(24시간) 동안 4°C에서 보관됩니다.</li>
</ol>5. 등핵 밀도 구배 정제
참고: 다음 단계는 isopycnic 밀도 구배 원심분리를 사용하여 미토콘드리아 및 막 분획을 정제합니다.
<ol><li>1 부 희석제 (단계 1.1.3에서 준비)와 5 부 요오드 (60 % 저장 용액 (w / v))를 혼합하여 요오드 딕산올의 50 % (v / v) 작업 용액을 준비합니다. 10% 작업 용액(v/v)과 50% 작업 용액(v/v)을 적절한 양의 용해 완충액 B와 혼합하여 10%, 50%, 25%, 30% 및 35% 요오드 딕산올 용액(v/v)을 준비합니다.</li>
	<li>미토콘드리아 및 막 펠릿(4.4단계 및 4.5단계)을 각각 200μL의 용해 완충액 B에 재현탁합니다. 재현탁된 펠릿 200μL에 1800μL의 작동 요오딕산올 용액(50%(v/v))을 추가하여 45% 요오드딕사놀(v/v)로 조정합니다.</li>
	<li>다음과 같이 iodixanol 불연속 구배를 만듭니다(초원심분리 튜브의 용량에 맞게 부피 조정): 1mL의 15% 요오드옥산올(v/v)을 8mL의 개방형 벽이 얇은 초원심분리기 튜브의 바닥에 추가하고 1mL의 20% 요오드옥산올(v/v)을 첫 번째 층 아래에 놓고(밑받침 기술에 의해) 25%의 1mL를 밑에 깔고, 1mL의 30 % 및 1 mL의 35 % 요오드 딕산올 (v / v). 참고: 이 단계에서 2개의 그래디언트가 생성되어야 하며, 1개는 미토콘드리아 분획이고 1개는 막 분획입니다.</li>
	<li>1 그래디언트에서 언더레이 기술을 사용하여 2mL의 미토콘드리아 펠릿(45% 요오드 딕산올(v/v)에 현탁)을 35% 요오드 산올(v/v) 아래의 튜브 바닥에 추가합니다. 다른 그래디언트에서는 언더레이 기술을 사용하여 2mL의 조막 펠릿(45% 요오드옥산올(v/v)에 현탁)을 35% 요오드 산올(v/v) 아래의 튜브 바닥에 추가합니다.</li>
	<li>1mL의 10% 요오드옥산올(v/v)을 15% 층 위에 오버레이하여 각 그래디언트 튜브의 상단에 추가합니다. 0.1% 요오드산올(v/v)을 첨가하여 서로 10g 이내의 튜브의 균형을 맞춥니다.</li>
	<li>밀도 구배 튜브를 4°C에서 100,000×g에서 18시간 동안 돌 립니다. 가속 및 감속을 사용 중인 초원심분리기의 최소값으로 설정해야 합니다. 참고: 미토콘드리아 구배에서 25%와 30% 요오드산올(v/v) 사이의 계면에 가시적인 밴드가 있습니다. 이것은 순수한 미토콘드리아 분획입니다. 막 구배에서 15% 요오드 딕산올(v/v) 분획에 가시적인 밴드가 있습니다. 이것은 순수한 막 분획입니다. 막 구배에서 25% 및 30% 요오드옥산올(v/v) 분획에 추가 밴드가 있을 수 있습니다. 이것은 미토콘드리아 오염입니다.</li>
	<li>1mL 분취량으로 튜브 상단에서 분획을 수집하되, 눈에 보이는 띠가 포함된 분획의 부피를 최소화하고 각 층이 수집된 후 피펫 팁을 교체하도록 주의하십시오. 또는 얇은 벽 튜브의 측면을 바늘로 뚫고 보이는 밴드를 수집하십시오.</li>
	<li>단백질 분석 및 웨스턴 블롯에 의한 검증이 있을 때까지 단계 2.8에 기재된 바와 같이 샘플을 저장한다.</li>
</ol>6. 핵 단백질 분리
알림: 이온 및 비이 온성 세제뿐만 아니라 초음파 처리 및 원심 분리와 같은 기술을 사용하여 다음 단계는 모든 세포막을 용해시키고 핵 단백질의 분리를 허용합니다.
<ol><li>용해 완충액 A에 현탁된 세포의 7.5 mL 분취량을 원심분리하고(단계 2.4에서), 상청액을 버린다. 800μL의 얼음처럼 차가운 CS 완충액(1.2.4단계에서 준비)을 추가하고 피펫팅 및 볼텍싱을 통해 펠릿을 재현탁합니다. 샘플을 얼음 (또는 4 ° C)에서 30 분 동안 배양하여 핵 단백질을 보호하면서 혈장과 세포 기관 막을 파괴합니다.</li>
	<li>세포 현탁액을 7,000 × g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 버린다. 1U/μL 벤조나아제를 함유한 후 800μL의 빙냉 NL 완충액(단계 1.2.5에서 제조됨)을 핵 펠릿에 추가합니다. 부드럽게 피펫팅하여 펠릿을 다시 부유시킵니다. 4 ° C에서 30 분 동안 엔드 오버 엔드 회전 장치에서 배양하여 핵막을 파괴합니다.</li>
	<li>벤조나제(6.2단계에서 추가됨)와 함께 핵산을 전단하는 얼음 욕조(3x, 펄스 사이에 5초 일시 중지)에서 냉각된 샘플 튜브를 사용하여 20% 전력으로 5초 동안 초음파 처리합니다.</li>
	<li>4°C에서 10 분 동안 7,800×g에서 초음파 분리합니다. 핵 분획 인 상청액을 수집하고 저장하십시오. 상청액을 수집하는 동안 불용성 펠릿을 방해하지 않도록하십시오. 저장을 위해, 샘플은 단계 2.8에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.</li>
</ol>7. 단백질 정량화 및 웨스턴 블롯 분석
참고: 다음 단계는 각 분획의 총 단백질을 정량화하고 세포하 분획의 순도를 확인합니다.
<ol><li>표준 Bradford 분석을 수행하여 각 분획의 총 단백질을 정량화합니다. 예상 단백질 수율은 표 1 을 참조하십시오. 참고: 비신코닌산(BCA) 분석 또는 280nm에서의 흡광도와 같은 기타 단백질 분석을 사용하여 Bradford 분석 대신 총 단백질을 측정할 수 있습니다.</li>
	<li>분획을 1x 환원제를 함유한 1x Laemmli 완충액과 결합하고 95°C에서 7분 동안 가열합니다. 각 분획 10μg을 표준 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 겔에 넣고 20mA에서 1시간 동안 겔을 실행합니다.</li>
	<li>100V에서 30분 동안 표준 면역블롯 전달을 수행하여 분해된 단백질을 폴리비닐디플루오라이드(PVDF) 막으로 옮깁니다. PVDF 멤브레인을 실온에서 30분 동안 0.1%의 비이온성 세제(v/v)를 함유한 1x 트리스 완충 식염수(TBS)에 5% 우유로 차단합니다.</li>
	<li>적절한 1차 항체를 추가하여 각 세포하 분획에 특이적인 하우스키핑 단백질을 검출하고 4°C에서 밤새 배양합니다. 실온에서 10분 동안 비이온성 세제(v/v) 0.1%가 포함된 1x TBS에 5% 우유로 멤브레인을 세척합니다. 참고: 이 프로토콜의 경우 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH, 1:10000), 히스톤 H3(1:2000), 전압 의존성 음이온 채널(VDAC, 1:1000) 및 Na,K+-ATPase에 대한 항체를 각각 세포질, 핵, 미토콘드리아 및 막 분획에 사용했습니다.</li>
	<li>적절한 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP) 접합 2 차 항체를 멤브레인에 첨가하고 (제조업체의 지침에 따라 희석) 실온에서 1 시간 동안 배양합니다. 실온에서 10분 동안 비이온성 세제(v/v) 0.1%가 포함된 1x TBS에 5% 우유로 멤브레인을 세척합니다. 표준 화학 발광을 사용하여 블롯을 개발하십시오.</li>
</ol>

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<li>Bradbury, E. M., Cary, P. D., Crane-Robinson, C., Rattle, H. W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformations+and+interactions+of+histones+and+their+role+in+chromosome+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Conformations and interactions of histones and their role in chromosome structure.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 222, 266-289 (1973).</li>
<li>McCaig, W. D., Deragon, M. A., Haluska, R. J., Hodges, A. L., Patel, P. S., LaRocca, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fractionation+of+U937+cells+in+the+absence+of+high-speed+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Cell fractionation of U937 cells in the absence of high-speed centrifugation.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e59022(2019).</li>
<li>McCaig, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycemia+potentiates+a+shift+from+apoptosis+to+RIP1-dependent+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Discovery%22%5BJournal%5D)">Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis.</a> Cell Death Discovery. 4, 55(2018).</li>
</ol>

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

이 방법은 고속 원심분리(11)를 사용하지 않고 세포내 분획화에 대한 이전에 공개된 접근법의 수정된 버전이다. 이 수정된 방법은 최상의 결과를 얻기 위해 보다 전문화된 장비가 필요하지만 더 포괄적이고 일관되게 재현할 수 있습니다.
초기 프로토콜의 개발은 괴사12 동안 단백질 국소화 분석을 위해 미토콘드리아 및 막 샘플을 분리 할 수 없기 때문에 필요했습니다. 대부분의 시판되는 키트에서 발견되는 독점적인 세제 기반 방법을 사용하려는 시도는 세포 내의 원형질막과 모든 막으로 둘러싸인 소기관을 포함하는 균질한 혼합물을 초래했습니다. 이러한 키트의 다른 제한 사항으로는 절차를 변경할 수 없음, 샘플당 비용, 부피 제한 및 처리할 수 있는 샘플 수가 있습니다. 여기에 제시된 절차는 모든 규모로 변경 될 수 있고, 더 적은 수의 분획을 분리하도록 변경 될 수 있으며, 값 비싼 시약을 사용하지 않고 수행 할...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62119">Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification</a>. The Authors section was&#160;updated.
The Authors section was updated from:
William McCaig1 
Timothy LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences
to:
William D. McCaig1 
Matthew A. Deragon1 
Phillip V. Truong1 
Angeleigh R. Knapp1 
Keven J. Hughes1 
Timothy J. LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

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Erratum: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

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Matthew A. Deragon1 
Phillip V. Truong1 
Angeleigh R. Knapp1 
Keven J. Hughes1 
Timothy J. LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences
to:
William D. McCaig1 
Matthew A. Deragon1 
Phillip V. Truong1 
Angeleigh R. Knapp1 
Timothy J. LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

세포 내 분획은 세포를 용해시키고 여러 가지 방법을 통해 구성 성분으로 분리하는 절차입니다. 이 기술은 연구원들이 포유류 세포에서 단백질 국소화를 결정하거나 다른 방법으로는 검출할 수 없는 저농도 단백질의 농축에 사용할 수 있습니다. 세포 내 분획 방법이 현재 존재하지만 구입할 수있는 상업용 키트와 마찬가지로이 절차가 극복하려고 시도하는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 대부분의 세포 분획 방법은 독점적으로 세제 기반1,2이며, 다양한 세포 구성 요소를 가용화하기 위해 증가하는 양의 세제를 포함하는 완충액을 사용합니다. 이 방법은 빠르고 편리하지만 불순한 분획을 초래합니다. 이들은 연구자들이 세포의 하나 또는 두 개의 구성 요소를 쉽게 분리 할 수 있도록 설계되었지만 동시에 샘플에서 여러 세포 내 분획을 분리 할만큼 복잡하지는 않습니다. 세제에만 의존하면 일반적으로 막으로 둘러싸인 세포 기관과 원형질막이 무차별적으로 가용화되어 이러한 구성 요소의 분리가 어려워집니다. 이러한 키트의 사용으로 인한 추가적인 복잡성은 대부분의 구성 요소가 독점 제형이기 때문에 연구자가 특정 응용 분야에 맞게 키트를 변경/최적화할 수 없다는 것입니다. 마지막으로, 이러한 키트는 엄청나게 비쌀 수 있으며 사용 횟수에 제한이 있어 더 큰 샘플에 적합하지 않습니다.
세제에 의존하지 않는 미토콘드리아 분리용 키트를 사용할 수 있음에도 불구하고 원형질막을 분리하고 표준 분리 프로토콜 3,4보다 훨씬 적은 양의 샘플을 생성하도록 설계되지 않았습니다. 차등 원심분리 방법은 시간이 더 많이 걸리지만 세제 기반 키트1만으로는 얻을 수 없는 뚜렷한 분획을 생성하는 경우가 많습니다. 가용화 세제만 사용하지 않고 분리하면 초원심분리 및 등압 밀도 구배를 사용하여 추가 정제가 가능하여 교차 오염이 줄어듭니다. 이 분획 프로토콜은 세제 및 고속 원심분리 기반 접근법의 조합을 사용하여 U937 단핵구에서 세포 내 분획을 분리하는 것을 보여줍니다. 이 방법은 포유류 세포의 핵, 세포질, 미토콘드리아 및 원형질막 성분의 분리를 용이하게 할 것이며 분획들 사이의 오염을 최소화 할 것이다.

<table><tbody><tr><td>벤조나아제 뉴클레아제</td><td>시그마-알드리치</td><td>E1014</td><td></td></tr><tr><td>총알 블렌더 조직 균질화기</td><td>다음 어드밴스</td><td>61-BB50-DX</td><td></td></tr><tr><td>디지토닌</td><td>시그마</td><td>D141</td><td></td></tr><tr><td>엔드 오버 엔드 로테이터</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)</td><td>시그마</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌 글리콜 -비스 (&beta; - 아미노 에틸 에테르) -N, N, N', N'- 테트라 아세트산 (EGTA)</td> <td>시그마</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH (14C10) &nbsp;</td><td>Cell Signalling Technologies</td><td>2118</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>VWR</td><td>97064-360</td><td></td></tr><tr><td>헥실렌 글리콜</td><td>Sigma</td><td>68340</td><td></td></tr><tr><td>Igepal</td><td>Sigma</td><td>I7771</td><td>비이온성, 비변성 세제</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma</td><td>M9647</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)</td><td>Cell Signalling Technologies</td><td>23565</td><td></td></tr><tr><td>오픈탑 폴리클리어 튜브, 16 x 52 mm</td><td>Seton Scientific</td><td>7048</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep (요오딕사올)&nbsp; 밀도 구배 매체</td><td>Sigma</td><td>D1556-250ML</td><td></td></tr><tr><td>phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail, General Use</td><td>VWR</td><td>M221-1ML</td><td></td></tr><tr><td>냉장 원심분리기</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>S50-ST Swinging Bucket Rotor</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td><td>Sigma</td><td>436143</td><td></td></tr><tr><td>소듐 데옥시콜레이트</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>소듐 오르토바나데이트(SOV)</td><td>Sigma</td><td>567540</td><td></td></tr><tr><td>초음파 처리기</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall MX120 Plus 마이크로 초원심분리기</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>스테인리스 스틸 비드 3.2mm</td><td>Next Advance</td><td>SSB32</td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>시그마</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>트리스 완충 식염수(TBS)</td><td>VWR</td><td>97062-370</td><td></td></tr><tr><td>웨스턴 블로팅 버퍼의</td><td>트윈 20</td><td></td><td></td> 비이온 세제</tr><tr><td>VDAC(D73D12)</td><td>Cell Signalling Technologies</td><td>4661</td><td></td></tr></tbody></table>

아이소피크닉 밀도 구배 정제에 의한 u937 세포의 세포 분획

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

이 프로토콜은 세제, 기계적 용해 및 등핵 밀도 구배 원심분리의 조합을 사용하여 포유동물 세포로부터 세포내 단백질 분획을 얻는 방법을 설명합니다. 이 절차의 가장 큰 장점은 세포 내 분획을 얻기 위해 가용화 세제의 단독 사용에 의존하지 않는다는 것입니다. 이것은 원형질막을 세포의 다른 막 결합 세포 기관으로부터 분리하는 것을 가능하게한다. 이 절차는 재현 가능하고 확장 가능하며 선택적인 방법으로 세포에서 단백질 국소화의 결정을 용이하게 할 것입니다. 이 방법은 인간 단핵구 세포주 U937에서 세포질, 핵, 미토콘드리아 및 원형질막 단백질을 분리하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 이 세포주에 최적화되어 있지만, 이 절차는 다른 세포주의 세포하 분획을 위한 적합한 시작점으로서 작용할 수 있다. 절차의 잠재적 함정과 이를 피하는 방법은 다른 세포주에 대해 고려해야 할 수 있는 변경 사항과 마찬가지로 논의됩니다.

이 절차의 개략적인 순서도(그림 1)는 현탁액에서 성장한 U9375 세포를 성공적으로 분획하기 위해 취한 단계를 시각적으로 요약합니다. 동일한 부피(1mL)의 등핵 밀도 구배의 상단에서 수집된 분획은 미토콘드리아 및 막 분획의 정제를 보여줍니다(그림 2). 외부 미토콘드리아 막6에 국한된 단백질인 VDAC에 대한 항체를 활용하면 미토콘드리아 분획이 25% 및 30% 요오드딕산올(v/v) 분획으로 이동했음을 보여줍니다(그림 2A). 원형질막7에서 주로 발견되는 통합 막 이종이량체의 일부인 Na,K+-ATPase α1 서브유닛에 대한 항체를 사용하여 순수한 미토콘드리아 분획으로부터 막 오염의 분리를 보여줍니다(<strong cl...

이 분획 프로토콜을 통해 연구자들은 포유류 세포에서 세포질, 핵, 미토콘드리아 및 막 단백질을 분리 할 수 있습니다. 후자의 2 개의 세포 내 분획은 isopycnic 밀도 구배를 통해 추가로 정제됩니다.

아이소피크닉 밀도 구배 정제에 의한 U937 세포의 세포 분획

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...

이 프로토콜은 4개의 세포 구획, 즉 세포질, 핵, 미토콘드리아 및 막을 서로 분리하는 방법을 제공하기 때문에 중요합니다. 뿐만 아니라 신뢰할 수 있는 결과를 제공하는 확장 가능하고 재현 가능한 절차입니다. 이 기술의 주요 장점은 세제를 최소한으로 사용하여 4개의 세포 구획을 분리하여 훨씬 더 재현 가능하고 신뢰할 수 있는 분별 절차를 가능하게 한다는 것입니다.세포질 단백질 분리를 위해 RPMI 1640에서 U937 세포를 섭씨 37도에서 10% 태아 소 혈청 및 5% 이산화탄소로 성장시켜 최종 총 6x10에서 8번째 세포까지 성장시킵니다. 배양물을 원심분리하고, 세포 펠렛을 실온 PBS에 재현탁시켜 최종 농도인 4 밀리리터당 10 내지 6번째 세포로, 피펫팅하여 덩어리를 분해한다. 2차 원심분리 후, 펠렛을 얼음 냉기 용해 완충액 A에 밀리리터당 2 x 10 내지 7번째 세포 농도로 재현탁시킨다.다운스트림 핵 단백질 추출을 위해 얼음 위의 원뿔형 튜브에 7.5ml의 세포를 추가하고 원심분리로 나머지 세포를 펠릿화합니다. 펠릿을 밀리리터당 7번째 세포에 2x10의 최종 농도로 세포질 분리 완충액에 재현탁하고, 덩어리를 분해하기 위해 부드럽게 피펫팅한 다음, 종단 간 회전과 함께 섭씨 4도에서 20분 동안 세포를 배양합니다. 배양이 끝나면 세포 현탁액을 원심분리하고 상청액을 깨끗한 원심분리 튜브로 옮깁니다.상청액을 원심분리하여 세포 파편을 침전시킵니다. 원심분리 후, 상청액을 새로운 원심분리 튜브로 옮기고, 펠릿이 관찰되지 않을 때까지 원심분리 순서를 반복한다. 샘플에 파편이 없으면 세포질 분획 함유 상청액을 섭씨 4도에서 최대 1개월 동안 보관하십시오.이어서 용해 완충액 A에 저장된 세포 펠렛을 밀리리터당 4 x 10 내지 6 세포의 최종 농도가 되도록 재현탁시킨다. 세포 균질화를 위해 세포 현탁액을 원심분리하고 상청액을 폐기하여 과도한 digitonin 및 수축기 오염 물질을 제거합니다. 펠렛을 얼음 위에서 30분 동안 6번째 세포 밀리리터당 10 내지 4의 최종 농도로 빙냉 세포 균질화 완충액에 재현탁시킨다.한편, 비드 기반 기계적 용해의 경우 얼음 위의 50밀리리터 스커트 튜브에 15밀리리터의 용해 완충액 B에 미리 세척된 스테인리스 스틸 3.2mm 비드 30g을 추가하여 냉각합니다. 배양이 끝나면 스커트 튜브의 완충액을 세포 현탁액으로 교체하고 세포를 속도 8로 5 분 동안 혼합합니다. 용해 후, 균질 액을 깨끗한 튜브로 옮긴다.균질 액을 원심 분리한 다음 상청액을 새 튜브로 옮깁니다. 샘플에서 남아 있는 파편을 제거하려면 지시된 대로 균질액을 3회 원심분리하고 각 원심분리 후 상청액을 새 튜브로 옮깁니다. 마지막 원심분리 후, 미토콘드리아 분획을 분리하기 위해, 원심분리를 위해 상청액을 새로운 튜브로 옮긴다.원심분리 후, 상청액을 새로운 튜브로 옮기고 미토콘드리아 분획 함유 펠렛을 얼음 위에 놓습니다. 막 분획을 분리하기 위해, 수집된 상등액을 원심분리하고, 상층액을 버린 후 막 분획 함유 조질 펠렛을 얼음 위에 놓았다. 등핵 밀도 구배 정제의 경우, 미토콘드리아 및 막 분획 펠릿을 200 마이크로리터의 용해 완충액 B 및 1.8 밀리리터의 요오드산올에 재현탁시킨다.각 샘플에 대해 불연속 요오드 요오드 구배를 생성하려면 먼저 샘플 당 1 개의 8 밀리리터 개방형 얇은 벽의 초 원심 분리 튜브의 바닥에 15 % 요오드 산올 1 밀리리터를 추가합니다. 다음으로, 각 튜브의 15 % 요오드 산올 층 아래에 20 % 요오드 산올 1 밀리리터, 25 % 요오드 산올 1 밀리리터, 30 % 요오드 산올 1 밀리리터 및 35 % 요오드 잔올 1 밀리리터를 순차적으로 밑받침합니다. 한 그래디언트의 바닥층 아래에 2밀리리터의 미토콘드리아 펠릿 현탁액을 추가하고 두 번째 그래디언트의 바닥층 아래에 2밀리리터의 조막 펠릿 현탁액을 추가합니다.밀도 구배 원심 분리로 미토콘드리아 및 막 분획을 정제하기 전에 각 그래디언트의 상단에 10 % 요오드 산올 1 밀리리터를 조심스럽게 층화하고 필요에 따라 10 % 요오드 사놀을 첨가하여 서로 10 마이크로 그램 내에서 튜브의 균형을 맞 춥니 다. 분리가 끝나면 바늘을 사용하여 얇은 벽 튜브의 측면을 뚫어 각 샘플에서 보이는 밴드를 수집합니다. 핵 단백질 분리를 위해, 용해 완충액 A에 현탁된 세포의 7.5 밀리리터 분취량을 원심분리하고, 피펫팅 및 와동을 사용하여 800 마이크로리터의 얼음처럼 차가운 세포 가용화 완충액에 펠릿을 재현탁시킨다.현탁액을 얼음 위에서 30분 동안 배양하여 혈장과 세포 기관 막을 파괴하고 핵 단백질을 보호합니다. 배양이 끝나면 세포 현탁액을 원심분리하고 벤조나제 마이크로리터당 1단위가 보충된 800마이크로리터의 얼음처럼 차가운 핵용해 완충액에 부드럽게 피펫팅하여 펠릿을 재현탁합니다. 혼합물을 섭씨 4도의 끝 대 끝 회전기에서 배양하여 핵막을 파괴합니다.30 분 후, 핵산을 전단하기 위해 펄스 사이에 5 초 동안 일시 중지하면서 20 % 전력에서 5 초 동안 혼합물을 3 번 초음파 처리하십시오. 마지막 초음파 처리 후, 균질 액을 원심 분리하고 펠릿을 방해하지 않고 핵 분획으로 상청액을 수집합니다. 밀도 구배 정제 후 각각의 분획의 웨스턴 블롯은 25 및 30% 요오드산올 층에 대한 미토콘드리아 분획의 국재화, 및 막 분획의 10 및 15% 요오드산올 층에 대한 국재화를 보여줍니다.서양 혈액 분석은 또한 분리 된 각 샘플이 순수하고 세포의 다른 부분의 단백질에 의한 오염이 없음을 확인합니다. 또한, 각 시료의 밴드 강도에 대한 농도계 분석은 데이터의 재현성 및 통계적 유의성을 확인한다. 분획을 부적절하게 실행하면 세포 구성 요소가 교차 오염될 수 있습니다.예를 들어, 세포질 분획에서 히스톤 H3의 농도가 높으면 세포질 분획의 부적절한 정화로 인한 것일 수 있습니다. 등핵 밀도 정제 동안 실패는 막 분획의 오염을 초래할 수 있다. 서양 혈액 분석 전에 단백질 정량 분석을 수행하여 분획에 실제로 단백질이 포함되어 있는지 확인하여 단백질 양을 기반으로 겔 로딩을 허용하고 절차가 적절하게 실행되었는지 확인하는 것이 유용할 수 있습니다.세포질 분획에 펠릿이 포함되어 있지 않은 것이 중요합니다. 웨스턴 블롯 또는 ELISA는 특정 조건에서 다른 단백질의 세포 내 위치를 분석 할 수 있도록이 절차에 따라 수행 될 수 있습니다. 이 기술을 통해 우리는 고혈당 상태에서 다양한 세포 사멸 요인의 인신 매매를 분석 할 수있었습니다.그래서 우리에게 이것은 세포 사멸에서 괴사로의 고혈당 전환 메커니즘을 밝히는 데 도움이되었습니다.

cell-fractionation-u937-cells-isopycnic-density-gradient

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

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밀도 구배 원심분리법: 말초 혈액에서 CLL 세포를 분리하는 방법

이 비디오에서는 그래디언트 원심분리를 사용하여 단일 핵을 분리하는 간단하고 효율적인 프로토콜에 대해 설명합니다. 일단 분리되면 이러한 핵은 염기서열분석 및 게놈 분석에 사용할 수 있습니다.

Gradient Centrifugation Based Purification of Nuclei: A technique to obtain extrapure fraction of intact nuclei using Density gradient centriugation(구배 원심분리 기반 핵 정제: 밀도 구배 원심분리를 사용하여 온전한 핵의 초순수 분획을 얻는 기술)

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아이소피크닉 밀도 구배 정제에 의한 U937 세포의 세포 분획

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