Name: 자가 조립 혈관 인체 피부 등가물의 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-12T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 배우세요 혈관화된 인체 피부 등가물 생성 방법을 통해 질병, 노화 및 맞춤형 의학 연구를 위한 생리학적으로 관련성 높은 피부 모델을 구축하는 기술을 익히세요.

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저자는 짐 라인발트 박사(59)와 박사 엘렌 H. 반 덴 보가르드20 N / TERT 세포주의 관대 한 선물에 감사드립니다. 이 작품은 미국 심장 협회 (19IPLOI34760636)에 의해 지원되었다.

저자는 공개 할 것이 없습니다.

이 프로토콜은 VHSEs 생성및 3차원 분석을 위한 간단하고 반복가능한 방법을 보여 주었습니다. 중요한 것은 이 방법은 몇 가지 특수 기술이나 장비 조각에 의존하여 다양한 실험실에 액세스할 수 있도록 합니다. 또한, 세포 모형은 프로토콜에 있는 제한적인 변경으로 대체될 수 있습니다, 연구원이 그들의 특정 필요에 이 프로토콜을 적응할 수 있도록.
적절한 콜라겐 겔화는 피부 문화를 확립하는 데 있어 어려운 단계입니다. 특히 정제 없이 원유 제제를 사용할 때, 미량 오염물질은 겔화 과정에 영향을 미칠 수 있습니다. 일관성을 보장하기 위해 VHSE 생성에 사용되는 동일한 콜라겐 스톡으로 실험 그룹을 수행해야 합니다. 또한, 겔화는 이상적으로 7-7.4의 pH에서 발생해야 하며, 미량 오염물질은 pH를 이동할 수 있다. 콜라겐 스톡을 사용하기 전에, 연습 세포 젤은 원하는 농도에서 만들어져야하며 pH는 겔화 전에 측정되어야한다. 진피 성분 파종을 시작하기 전에 이 콜라겐 품질 검사를 완료하면 완전한 실험을 시작하기 전에 적절한 겔화 및 콜라겐 균질성에 대한 문제를 식별합니다. 세포세포 콜라겐을 배양 삽입에 직접 파종하는 대신, 일부 콜라겐을 pH 스케일 전체를 평가하고 7-7.4의 pH를 확인하는 pH 스트립에 시드합니다. 겔화는 콜라겐 젤 용액의 액적액을 커버슬립 또는 조직 배양 플라스틱 웰 플레이트에 적용하여 평가될 수 있다(양문화 인서트가 제한된 측면을 시뮬레이션하는 것이 좋습니다). 겔화 시간 후에, 콜라겐은 단단해야 한다, 즉, 접시가 기울어질 때 흐어서서는 안 된다. 상 대비 현미경 검사에서 콜라겐은 균일하고 명확해 보일 것입니다. 콜라겐 파종에서 가끔 거품은 정상이지만 명확한 젤 내에서 불투명 콜라겐의 큰 비정질 방울은 혼합이 부족하여 문제가 발생할 수 있음을 나타냅니다, 잘못된 pH, 및 /또는 혼합 하는 동안 냉각 콜라겐을 유지 하지 못하는.
세포 시싱 양 및 매체가 조절될 수 있다. 상기 프로토콜에서 캡슐화된 세포 양은 진피 구조 위에 시드된 콜라겐의 mL당 7.5 x 104 섬유아세포 및 7.5 x 105 내피세포에서 12웰 삽입에 최적화되었다. 세포 밀도는 다양한 콜라겐 농도48 및 HSE 세대22,80,81에서3D 혈관 네트워크 생성을 조사하는 예비 연구 및 이전 연구를 기반으로 이러한 VHSE프로토콜에최적화되었습니다. 유사한 시스템에서, 발표된 내피 세포 밀도는 1.0 x 106 세포/mL 콜라겐48; 섬유아세포 농도는 콜라겐 22, 28, 82 ~ 1 x 10 5 세포/mL의 콜라겐22,22, 28,1 x 10 5 세포/mL의 0.4 x 105 세포/mL로부터 의 범위 8,58,83,84,85; 및 각질 세포 농도는 0.5 x 105 [세포/cm 2]80 ~ 1 x 105 [세포/cm2]8범위이다. 세포 밀도는 특정 세포 및 연구 질문에 최적화될 수 있습니다. 섬유아세포와 같은 수축세포를 가진 3차원 배양은 생존력 감소 및 배양손실(86,87)으로이어지는 계약을 체결할 수 있다. 예비 실험은 진피 구획의 수축을 테스트하기 위해 완료되어야합니다 (더 많은 진피 세포, 더 수축 성 진피 세포, 더 긴 침수 배양 또는 부드러운 행렬로 발생할 수 있음) 표피 표면 커버리지를 테스트합니다. 또한, 침수일 수 및 세럼 함량을 가감하는 속도또한 과도한 진피 수축이 발생하거나 각질 세포 커버리지의 다른 비율이 필요한 경우 사용자 정의 할 수 있습니다. 예를 들어, 진피 침수 기간 동안 수축이 발견되거나 각질 세포가 표면 단층을 설정하는 동안 혈청 테이퍼링 공정을 통해 더 빠르게 이동하고 VHS를 ALI로 올리는 것은 추가 수축을 방지하는 데 도움이 될 수 있다. 마찬가지로, 각질 세포 적용범위가 이상적이지 않다면, 혈청 없이 VHSE가 침수되는 일수를 변경하면 표피 단층 커버리지를 증가시키고 혈청이 제외되기 때문에 수축을 완화하는 데 도움이 될 수 있다. 위의 세포 밀도 또는 기타 제안의 변화는 특정 배양 및 연구 목표에 최적화되어야 합니다.
공기 액체 인터페이스(ALI) 기간 동안 표피의 적절한 계층화를 확립하기 위해 각 우물의 유체 수준을 정기적으로 확인하고 유지하여 각 구조의 ALI 및 적절한 수분 공급이 배양 길이 전반에 걸쳐 유지되도록 하는 것이 중요합니다. 일관된 ALI 수준이 설정될 때까지 미디어 수준을 매일 확인하고 추적해야 합니다. 표피 층은 건조하지 않고 수분을 유지해야 하지만 구성에 미디어 풀이 없어야 합니다. ALI 동안, 구조는 정상 불투명 한 흰색 / 노란색 색상을 개발할 것입니다. 표피 층은 고르지 않게 개발할 것입니다. 일반적으로, VHSEs는 콜라겐 파종 또는 진피 수축으로 인해 기울어져 있습니다. 또한 12웰 크기로 VHSE의 둘레 주변의 더 작은 구문(24웰 크기)과 능선 형성으로 구문 중간에 더 높은 표피 부분을 관찰하는 것이 정상이다. 구문(13)의 수축은 이러한 지형 형성을 변화시킬 수 있으며, 전혀 관찰되지 않을 수 있다.
VHS의 염색 및 이미징은 VHS에 기계적 조작을 도입합니다. 각 문화의 조작을 계획하고 제한하는 것이 매우 중요합니다. 조작이 필요한 경우 삽입 막에서 VHS를 제거할 때, 구조 표면에 염색 또는 세척 솔루션을 추가할 때, 이미징 준비 중에 저장/이미징 우물에서 VHSEs를 제거하고 교체할 때 부드러운 움직임을 유지합니다. 구체적으로, 표피 성분의 정맥 층은 깨지기 쉬우며 기저 표피 층을 벗겨낼 위험이 있다. 표피의 표피 층은 고약하고 토착 조직4에서도담수를 거치지만 표피 구조의 정확한 분석을 위해 손상이나 손실을 최소화하는 것이 중요합니다. 표피 레이어가 구문에서 들어 올리면 별도로 이미지를 지정할 수 있습니다. 표피의 기저층은 여전히 진피에 부착되어 있으며, apical 층의 일부가 분리될 수 있습니다. 표피의 시각화를 위해, 핵 얼룩은 조밀한 핵이 표피의 하부 및 중간 층의 특성이기 때문에 이를 관찰하는 데 도움이됩니다.
VHSE 후 고착의 공초점 화상 진찰은 프로토콜에서 논의되고 있으나, 직립 기반 광학 일관성 단층 촬영(OCT)88,89,90,91,92, 93을통해 배양 전반에 걸쳐 VHSEs를 이미지화할 수도 있다. VHSE는 눈에 띄는 효과 없이 적어도 2 시간 동안 잠복또는 가습 없이 화상 진찰을 견딜 수 있을 만큼 안정적입니다. OCT는 라벨이 없고 비침습적이기 때문에 성숙 시 표피 두께를 추적할 수 있습니다. 그밖 비침범적인 화상 진찰 양식은 가능성이 또한 고용될 수 있습니다.
결합된 진피 및 표피 구조물의 체적 화상 진찰은 VHSE에서 더 깊은 레이저 감쇠 때문에 도전적일 수 있습니다. 이는 표피측(도 1)과진피 측(도2)으로부터두 방향으로 컨스트럭쳐하여 진피 혈관 구조및 표피의 좋은 해상도를 허용함으로써 완화될 수 있다. 또한 샘플을 지울 수 있으므로 전체 구조의 체적 이미지를 최소화하여 감쇠가 최소화할 수 있습니다. 여러 클리어링 방법을 시도했지만, 메탄올/메틸 살리실레이트 방법은 최상의 결과를 산출했다. 다른 클리어링 방법을 최적화하는 데 관심이 있는 연구자들은 이러한 리뷰49,61,62를대상으로 합니다. 클리어링하는 경우, 방법이 형광및/또는 구조를 손상시킬 수 있으므로, 클리어하기 전에 샘플을 완전히 이미지화하는 것이 좋습니다. 또한, 형광이 며칠 내에 퇴색할 수 있기 때문에, 이미징은 청산 후 가능한 한 빨리 완료되어야 합니다.
단순성과 접근성을 위해 이 프로토콜은 이전 문헌11,80에서가장 간단한 미디어 블렌드를 활용했다. 간단한 미디어 블렌드를 사용하는 데는 많은 장점이 있지만 이 선택의 한계도 인식됩니다. 다른 그룹은 표피와 진피 건강에 특정 미디어 구성 요소의 효과를 연구하고 다른 미디어 첨가제(94,외부 자유 지방산 / 지질 등, 표피의 층 각막을 강화하고 피부 장벽 기능을 향상 발견. 우리의 면역 형광 마커는 표피에서 적절한 분화 및 계층화를 보여주지만, 수행되는 연구에 따라 추가 적인 미디어 최적화가 필요할 수 있습니다. 또한, 여기에 제시된 VHS를 평가할 때 표피 BM에 대한 광범위한 분석은 수행되지 않았다. BM의 무결성은 피부 등가물의 중요한 표시입니다; 다양한 그룹은 BM표시(95)에 대한 배양 지속 시간 및 그 영향에 대한 연구뿐만 아니라 섬유아세포 존재의 분석및 BM발현(14)에대한 성장 인자 효과를 추가했다. 이 프로토콜을 사용할 때 BM 구성 요소의 분석을 평가하고 최적화해야 합니다.
이 프로토콜에서 VHSE 생성에 대한 절차를 설명하며, ALI에서 8주 후에 결과를 입증합니다. VHSE 배양은 눈에 띄는 변화 또는 생존력의 손실없이 ALI에서 최대 12 주 까지 배양되었으며, 더 이상 실행 가능 할 수 있습니다. 중요한 것은, 이 프로토콜은 IMR90 폐 섬유아세포로 진피 섬유아세포의 교체에 의해 입증된 바와 같이, 일반적으로 이용 가능한 세포 모형에 쉽게 적응할 수 있습니다. 연구원의 필요와 사용 가능한 자원에 따라, 더 유사한 세포 모형이 미디어 최적화를 요구할 수 있더라도, 문화에 세포 모형 및 매체 혼합을 조정할 수 있습니다. 요약하자면, 이러한 절차는 피부 생물학 과 질병의 연구를 위한 VHSEs의 문화에 대한 명확성을 제공하기 위한 것입니다. 접근성을 극대화하기 위해 이 프로토콜은 연구 연구의 특정 요구에 맞게 더욱 사용자 정의할 수 있는 최소한의 효과적인 접근 법으로 공통 장비, 세포주 및 시약을 사용하여 간단하고 견고한 개발되었습니다.

인간의 피부는 면역/기계적 장벽으로 작용하고, 체온을 조절하며, 물 보존 및 감각 역할에 참여하는 등 많은 필수 생물학적 기능을 수행한다1,2,3,4. 해부학적으로, 피부는 인체에서 가장 큰 기관이며 3 개의 주요 층 (표피, 진피 및 피하)으로 구성되어 있으며 표피 세포 외에도 기질, 혈관, 선 및 면역 / 신경계 구성 요소의 복잡한 시스템을 가지고 있습니다. 표피 자체는 기본 피부의 장벽 기능 및 기타 구조(즉, 땀과 피지선,손톱)를유지하기 위해 지속적으로 갱신되는 4층의 세포로 구성된다. 피부 생리학은 면역 기능, 상처 치유, 암 생물학 및 기타 분야에서 중요하며, 연구자는 체외 단문화에서 생체 내 동물 모델에 이르기까지 광범위한 모델을 사용하는 데 중요합니다. 동물 모델은 피부 생리학의 전체 복잡성을 연구하는 기능을 제공하지만, 마우스와 같은 일반적으로 사용되는 동물 모델은 인간에 비해 상당한 생리적 차이가5. 이러한 제한, 그리고 동물 모델의 증가 비용, 더 밀접 하 게 인간의 피부의 생리를 반영 하는 체 외 모델 개발에 초점을 많은 연구원을 주도했다1,6. 이들 중, 간단한 모델 유형 중 하나는 세포형 진피 매트릭스에 표피 각질 세포만으로 구성된 인간 표피 등가(HEE; 반두께 피부 모델라고도 함)이지만 생체내에서 볼 수 있는 표피 분화 및 계층화를 포착한다. 이를 바탕으로 진피 및 표피 성분(각질 세포 및 섬유아세포)을 포함하는 모델은 종종 인간 피부 등가물(HSE), 전체 두께 피부 모델 또는 조직형 피부 구조(OSC)라고 합니다. 간략하게, 이 모형은 겔 행렬 내의 진피 세포를 캡슐화하고 위에 표피 세포를 파종하여 생성됩니다. 표피 분화 및 계층화는 전문 매체 및 공기 노출7을통해 달성될 수 있다. 피부 등가물은 콜라겐 타입 I(쥐 꼬리 또는 소 피부 원점 중하나)로만든 진피 젤을 사용하여 자체 조립 기술을 통해 가장 자주 발생하였지만, 유사한 모델은피브린9,10과같은 다른 매트릭스 성분을 통합했다. 섬유아세포 유래11,12,cadaveric 탈표형 멤브레인13,14,15,16,시판 가능한 젤 및 기타1,12,13,17,18,19. 현재, 시판되는 피부 등가물(이전에 검토된1,2)이있다. 그러나, 이들은 주로 치료 목적을 위해 개발 하 고 특정 연구 질문에 쉽게 사용자 지정 할 수 없습니다.
HsEs는 상처 치유, 접목, 독성학 및 피부질환/발달11,12,13,16,8,20,21,22,23등의연구에 적용되었다. 3D 배양은 2D배양(24)에비해 인간 조직의 기능을 보다 포괄적으로 모델로 하지만, 생체 내 인구를 보다 정확하게 반영하는 다양한 세포 유형을 포함하면 복잡한조직(24,25,26)에서세포-세포 조정에 대한 연구가 가능하게 됩니다. 대부분의 HSEs는 생체 내 피부 환경이 다른 많은 세포 유형을 포함하지만, 대부분의 HSEs는 진피 섬유아세포와 표피 각질 세포27을포함한다. 최근 연구는 더 많은 세포 인구를 포함 하 여 시작 했습니다.; 이들 로는 혈관 내분비세포(10,28,29,30,31,32,33,34, 34)및 하복부 구형 조직에서의 분피세포(35,36,신경성분19)를 포함한다.,21,줄기세포27,37,38,면역세포10,39,40,41, 42,기타 질병/암특이모델(16,40,43,44,45,46, 46,47)및 기타 질환/암 특이적 모델. 이들 중 특히 중요 한 혈관; 일부 HsEs는 혈관 세포를 포함하지만, 전반적으로 그들은 여전히 전체 진피 에 걸쳐 연결포괄적 인 모세관 요소가 부족10,29, 시험관 내 안정성(28)및 적절한 혈관 밀도 확장. 또한, HSE 모델은 일반적으로 HSE의 3차원 구조의 분석을 제한하는 배양 후 조직학적 단면을 통해 평가된다. 3차원 분석을 통해 혈관밀도(48,49)의 체적 평가뿐만 아니라 표피 두께 및 분화의 지역적 변화를 가능하게 한다.
HsE는 가장 일반적인 organotypic 모델 중 하나이지만 적절한 세포 외 매트릭스 및 세포 밀도, 미디어 레시피, 적절한 공기 액체 인터페이스 절차 및 배양 후 분석을 포함하여 이러한 구조를 생성하는 데 많은 기술적 인 문제가 있습니다. 또한 HEE 및 HSE 모델은 프로토콜을 발표했지만, 조직학적 분석보다는 진피 혈관 및 체적 이미징을 통합한 상세한 프로토콜은 존재하지 않는다. 이 작품은 주로 상업적세포주로부터 혈관화된 인간 피부 등가물(VHSE)의 배양에 접근할 수 있는 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 쉽게 사용자 정의 할 수 있도록 작성, 다른 세포 유형과 연구 요구에 직선 적응을 허용. 접근성, 가용성 및 비용을 위해 간단한 제품 및 생성 기술의 사용은 시판되는 제품을 사용하는 데 우선순위를 두였습니다. 또한, VHSE의 3차원 구조의 평가를 허용하는 간단한 체적 이미징 및 정량화 방법이 설명된다. 이 절차를 강력하고 접근 가능한 프로토콜로 변환하면 비 전문 연구자들은 개인화 된 의학, 혈관 조직 공학, 이식 개발 및 약물 평가에 이러한 중요한 모델을 적용 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>1 N NaOH</td><td>Fisher Chemical</td><td>S318-100</td><td>(실험실 재고에서 희석)</td></tr><tr><td>4% 파라포름알데히드</td><td>ACROS Organics</td><td>#41678-5000, Lot # B0143461</td><td>PBS에서 고체 파라포름알데히드를 사용하여 구성, pH 6.9로 조정</td></tr><tr><td>오토클레이브 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>#11295-00</td><td>Dumont #5 집게</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher 생물 시약</td><td>Cat # BP510-250, Lot # 190231</td><td>Rnase, Dnase, Protease-Free</td></tr><tr><td>세포주, 내피: 미세혈관 내피 세포(HMEC1)</td><td>ATCC</td><td>CRL-3243</td><td>SV40 불멸화된 미세혈관 내피 세포. 750,000 cells/mL의 콜라겐이 사용되었습니다.</td></tr><tr><td>세포주, 섬유아세포: 피부 인간 섬유아세포, 성인</td><td>ATCC</td><td>PCS-201-012</td><td>1차 진피 세포. 75,000 cells/mL의 콜라겐이 사용되었습니다.</td></tr><tr><td>세포주, 섬유아세포: 인간 폐 섬유아세포(IMR90)</td><td>ATCC</td><td>CCL-186</td><td>일차 배아 세포. 75,000 cells/mL의 콜라겐이 사용되었습니다.</td></tr><tr><td>세포주, 각질세포: N/TERT-1</td><td></td><td></td><td>hTERT 발현을 통해 불멸화됨. N/TERT-1은 하이그로마이신 내성을 부여하는 레트로바이러스 벡터를 사용하여 만들어졌습니다. Dickson et al.에 의해 확립된 세포주 2000. ATCC PCS-200-010 또는 PCS-200-011로 교체할 수 있습니다. 구성물당 170,000개의 세포가 사용되었습니다. N/TERT1 세포는 30% confluent 90 mm 조직 배양 접시 2개로 충분한 세포를 제공하는 plate에서 사용해야 합니다. 저자들은 N/TERT 세포주를 아낌없이 선물해 준 Jim Rheinwald 박사와 Ellen H. van den Bogaard 박사에게 감사를 표합니다.</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Thermo Scientific; Sorvall Legend X1R</td><td></td><td>(표준 실험실 장비)</td></tr><tr><td>계산 소프트웨어</td><td>MATLAB</td><td>MATLAB 2020a</td><td>MathWorks, Natick, MA.</td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Leica TCS SPEII 컨포칼</td><td></td><td>레이저 스캐닝 컨포칼. 다른 컨포칼 또는 디콘볼루션 현미경으로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>커버 유리 (22 x 22)</td> <td>피셔 사이언티픽</td><td>12-545F</td><td>0.13-0.17 mm No.1 두께</td></tr><tr><td>시아 노 아크릴 레이트 슈퍼 접착제 또는 실리콘 그리스</td><td>접착제 마스터</td><td>#THI0102</td><td>접착제 마스터, 두꺼운, 인스턴트 접착제, 시아 노 아크릴 레이트; 슈퍼 접착제는 선호되는</td></tr><tr><td>DMEM 미디어 베이스</td><td>코닝입니다. Mediatech, Inc</td><td>참조 # 10-013-CM; Lot # 26119007</td><td>DMEM, 4.5 g/L 포도당, L-글루타민 및 피루브산 나트륨 DMEM/F-12 50/50 Corning을 함유한 1X(Dulbecco의 독수리 매체 변형</td></tr><tr><td></td><td>); Mediatech, Inc</td><td>참조 # 10-090-CV; Lot # 21119006</td><td>DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco의 Mod. L-글루타민 에탄올을 사용한 Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix</td></tr><tr><td></td><td></td><td>#V1101</td><td>(표준 실험실 시약)</td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat # FB12999102, Lot # AE29451050</td><td>연구 등급 태아 소 혈청, 트리플 0.1 um 멸균 여과</td></tr><tr><td>미세 팁 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>#11295-00</td><td>Dumont #5 집게</td></tr><tr><td>인간 표피 성장 인자 (EGF)</td><td>Peprotech</td><td>Cat # AF-100-15-1MG, Lot # 0318AFC05 D0218</td> PBS Hydrocortisone Alpha Easar Lot # 5002F2A에서 <td>0.1% BSA로</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>구성 DMSO</td></tr><tr><td>인슐린(인간)</td><td>Peprotech</td><td>Lot # 9352621</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Light/Phase Contrast Microscope</td><td>VWR</td><td>76317-470</td><td>(표준 실험실 장비)</td></tr><tr><td>Isoproterenol</td><td>Alfa Aesar</td><td>#AAJ6178806</td><td>DL-Isoproterenol 염산염, 98%</td></tr> <tr><td>Keratinocyte-SFM (1x) 매체 염기</td><td>Gibco; Life Technologies Corporation</td><td>참조 #: 10724-011; Lot # 2085518</td><td>Keratinocyte-SFM (1X); 혈청 무료 매체</td></tr><tr><td>L-Ascorbic Acid</td><td>Fisher Chemical</td><td>Cat # A61-100, Lot # 181977, CAS # 50-81-7</td><td>결정질. L-아스코르브산은 염</td></tr><tr><td>L-글루타민(고체)</td>으로도 구입할 수 있습니다.<td>Fisher Bioreagents</td><td>CAT # BP379-100, LOT # 172183, CAS # 56-85-9</td><td>L-글루타민, 백색 결정 또는 결정성 분말</td></tr><tr><td>MCDB 131 미디어 베이스</td><td>Gen Depot</td><td>CM034-050, Lot # 03062021</td><td>MCDB 131 중간 염기, L-글루타민 없음, 멸균 여과</td></tr><tr><td>메탈 펀치</td><td>Sona Enterprises (SE)</td><td>791LP, 12PC</td><td>중공 가죽 펀치 세트, 고 탄소강, 경도 : 48HRC; (다양한 크기를 포함하여) : 1/8 ", 5/32 ", 3/16 ", 7/32 ", 1/4 ", 9/32 ", 5/16 ", 3/4 ", 7/16 ", 1/2 ", 5/8 :, 3/4". 이 펀치 세트도 도움이 되지만 x-acto 나이프도 사용할 수 있습니다. 12웰 트랜스웰 VHSE에 잘 작동하는 금속 펀치의 크기는 3/8" 또는 1/2"입니다.</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>피셔 화학 CAS</td><td># 67-56-1</td> <td>(선택 사항). 탈수 단계를 청소하기 위해.</td></tr><tr><td>메틸 살리실레이트</td><td>피셔 케미컬</td><td>O3695-500; 로트 # 164535; CAS # 119-36-8</td> <td>(선택 사항). 지우기를 위해.</td></tr><tr><td>마이크로튜브, 1.7mL</td><td>Genesee Scientific Corporation; 올림푸스 플라스틱</td><td>고양이 # 24-282; 로트 # 19467</td><td>1.7 ml 마이크로튜브, 투명; Boilproof, Polypropulene, Certified Rnase, Dnase, DNA, PCR 억제제 및 endotoxin-Free</td></tr><tr><td>PBS, 10x 배양 등급 또는 오토클레이브</td><td>APEX Bioresearch 제품</td><td>Cat # 20-134, Lot # 202237</td><td>PBS Buffer, 10x Dry Pack; 팩의 내용물을 용기에 넣고 1 리터에 물을 추가하여 10x 농축을 생성하십시오.</td></tr><tr><td>PBS, 1x 배양 등급, (-) 칼슘, (-) 마그네슘</td><td>Genesee Scientific Corporation</td><td>Ref # 25-508; Lot # 07171015</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1x 비배양 등급</td><td>APEX Bioresearch 제품</td><td>Cat # 20-134, Lot # 202237</td><td>PBS 버퍼, 10x 건조 팩; 용기에 팩 내용물을 추가하고 1리터에 물을 추가하여 10배 농축물을 생산합니다. 물로 1배로 희석합니다.</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Gibco; Life Technologies Corporation</td><td>Ref # 15140-122, Lot # 2199839</td><td>Pen Strep (10,000 Units/mL Penicillin; 10,000 ug/mL Streptomycin)</td></tr><tr><td>페트리 접시, 유리, 소형</td><td>Corning</td><td>PYREX 316060</td><td>(선택 사항). 세척 용기</td></tr><tr><td>페트리 접시로 사용, 100mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>PDMS 구성에 사용합니다.</td></tr><tr><td>폴리디메틸실록산(PDMS)</td><td>다우코닝</td><td>GMID 02065622, 배치 # H04719H035</td><td>Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 베이스, 다우코닝, 미시간주 미들랜드)</td></tr><tr><td></td><td>Dow Corning</td><td>GMID 02065622, 배치 # H047JC4003</td><td>DOWSIL 184, 실리콘 엘라스토머 경화제</td></tr><tr><td colspan="4">참고: PDMS는 일반적으로 기본 및 경화제 구성 요소를 모두 포함하는 키트로 판매됩니다.</td></tr><tr><td>용적식 피펫 (1000 & 250 uL)</td><td>Gilson</td><td>1000 uL: HM05136, M1000. 250 uL: T12269L</td><td>M1000 피펫 용량 (100-1000 uL); M250 피펫 용량 최대 250 uL</td></tr><tr><td>용적 변위 팁/피스톤(1000 & 250 uL)</td><td>Gilson</td><td>1000 uL: CAT # F148180, BATCH # B01292902S; 250 uL: CAT # F148114, BATCH # B05549718S</td><td>멸균된 모세관 및 피스톤</td></tr><tr><td>Round tipped scoopula</td><td></td><td></td><td>(옵션, 표준 실험실 장비) 이미징 전 VHSE 조작용</td></tr><tr><td>각질세포-SFM 배지</td><td>용 보충제기코; Life Technologies Corporation</td><td>Ref # 37000-015, Lot # 2154180</td><td>EGF 인간 재조합 (Cat # 10450-013), 소 뇌하수체 추출물 (Cat # 13028-014)</td></tr> <tr><td>조직 배양 플레이트 인서트, 12 웰 크기, 3 &마이크로; m 기공 크기</td><td>코닝; Costar</td><td>REF # 3462 - 지우기; 로트 # 14919057</td><td>Transwell; 12 mm 직경 인서트, 3.0 um 포어 크기, 조직 배양 처리, 폴리에스터 막, 폴리스티렌 플레이트,&nbsp;</td></tr><tr><td>조직 배양 플레이트, 12 웰 크기</td><td>Greiner Bio-one; CellStar</td><td>고양이 # 665 180; Lot # E18103QT</td><td>12웰 세포 배양 플레이트; 멸균, 뚜껑 포함, 제품은 멸균 상태이며 검출 가능한 Dnase, Rnase, 인간 DNA 및 발열원이 없습니다. 내용물 : 비 세포 독성</td></tr><tr><td>조직 배양 플레이트, 60.8cm ^ 2 성장 면적</td><td>Genesee Scientific Corporation</td><td>Cat # 25-202; 로트 번호: 191218-177B</td><td>조직 배양 접시; 처리, 성장 면적 60.8 cm^2; 멸균, Dnase, Rnase, Pyrogen Free; 버진 폴리스티렌</td></tr><tr><td>Triton x 100</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>Cat # 8698.5-16, Lot # 4708R34</td><td>습윤제</td></tr><tr><td>Trypsin 0.25%</td><td>Corning; Mediatech, Inc</td><td>Ref # 25-053-CI</td><td>0.25% 트립신, 2.21 mM EDTA, 쥐 꼬리에서 분리된 1x [-] 중탄산나트륨</td></tr><tr><td>유형 1 콜라겐</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>56054-1</td><td>Sprauge-Dawley 쥐 꼬리는 Pel-Freez 또는 기타 공급업체에서 냉동 상태로 구입할 수 있습니다. 콜라겐은 꼬리 힘줄에서 분리할 수 있습니다. 격리 프로토콜 참조[Cross et al., 2010; Rajan et al., 2007; Bornstein, 1958] . 또는 고농도 쥐꼬리 콜라겐은 Corning (카탈로그 번호 : 354249)</td></tr> <tr><td>진공 챔버, 벤치 탑</td><td>Bel-Art</td><td>F42010-0000</td> <td>(표준 실험실 장비)</td></tr> <tr><td>핸드 헬드 정밀 나이프</td><td>X-Acto</td><td>X3311</td> <td>(스틸 펀치를 구입 한 경우 X-Acto 나이프 옵션)을</td></tr> 포함한 공급 업체에서 구입할 수 있습니다</tbody></table>.

자가 조립 혈관 인체 피부 등가물의 생성

Generation of Self-assembled Vascularized Human Skin Equivalents

인간 피부 등가물(HSEs)은 인간의 피부의 표피 및 진피 성분을 모델링하는 조직 설계 구조입니다. 이 모형은 피부 발달, 상처 치유 및 접목 기술을 연구하기 위하여 이용되었습니다. 많은 HsEs는 혈관이 계속 부족하고 구조의 체적 평가를 제한하는 포스트 배양 조직학적 단면을 통해 추가로 분석됩니다. 여기에 제출 혈관 인체 피부 등가물을 생성하기 위해 접근 가능한 재료를 활용하는 간단한 프로토콜 (VHSE); 또한 설명된 것은 이러한 구조의 체적 이미징 및 정량화 기술이다. 간단히, VHSEs는 진피 및 표피 세포가 쥐 꼬리 콜라겐 타입 I 젤로 종향되는 12개의 잘 배양 인서트에서 생성됩니다. 진피 구획은 콜라겐 젤 전체에 분산된 섬유아세포 및 내피 세포로 구성됩니다. 표피 구획은 공기 액체 인터페이스에서 분화하는 각질 세포 (피부 상피 세포)로 구성됩니다. 중요 한 것은, 이러한 방법은 연구원의 요구에 따라 사용자 정의, 두 개의 다른 섬유 아 세포 유형VHSE 세대를 보여주는 결과: 인간 진 피 섬유 아 세포 (hDF) 그리고 인간의 폐 섬유 아 세포 (IMR90s). VHS는 공초점 현미경 검사를 통해 개발되었으며, 4주 및 8주 시점에서 계산 소프트웨어를 사용하여 볼륨으로 분석되었습니다. 볼륨 검사를 위한 수정, 얼룩, 이미지 및 명확한 VHS를 위한 최적화된 프로세스가 설명되어 있습니다. 이 포괄적인 모델, 이미징 및 분석 기술은 이전 HSE 경험이 있거나 없는 개별 실험실의 특정 연구 요구에 쉽게 사용자 정의할 수 있습니다.

이 프로토콜의 목표는 장기 문화를 위한 접근가능하고 간단한 기술을 사용하여 혈관화된 인간 피부 등가물의 생성 및 체적 분석을 설명하는 것입니다. 가능한 한, 단계에 대한 근거는 연구원이 연구 요구에 따라 사용자 정의 할 수있는 능력을 허용하기 위해 설명된다.

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to ...

이 프로토콜에 제공된 세부 사항은 종종 기술적으로 어려운 인간의 피부 동등한 생성을 다룹니다. 새로운 인간 피부 동등한 프로토콜 요소, 예컨대 혈관 및 체적 이미징이 포함됩니다. 이 기술은 질병, 노화 및 개인화 된 의학 연구를위한 생체 내 조직과 보다 밀접하게 일치하는 피부 모델의 간단한 구성을 가능하게합니다.이 프로토콜의 가장 어려운 부분은 침수와 공기 액체 인터페이스 사이의 전환입니다. 일관된 결과를 위해 타이밍과 미디어 수준을 최적화하는 데는 몇 가지 시험이 필요할 것입니다. 시작하려면, 차가운 덮인 튜브에 516 마이크로 리터의 마이크로 리터를 추가하고 즉시 1000 마이크로 리터 양성 변위 파이펫을 사용하여 차가운 콜라겐의 375 마이크로 리터를 추가합니다.빈 파이펫 팁을 제거하고 준비된 250 마이크로리터 양성 변위 파이펫으로 전환하여 혼합합니다. 빠르게 혼합하지만, 부드럽게 과도한 거품 형성을 방지합니다. 용액에 팁을 유지, 용액이 동질 색상의 때까지 튜브의 다른 위치에서 균일하게 혼합, 이는 일반적으로 약 5 파이펫 주기 또는 10 초 소요.즉시 12웰 배양 삽입물의 막에 세포 콜라겐 125 마이크로리터를 분산시킵니다. 균일한 커버리지를 보장하기 위해 플레이트를 기울이고 파이펫 팁을 사용하여 콜라겐을 부드럽게 퍼뜨리면 멤브레인을 페인트합니다. 즉시 12웰 플레이트를 섭씨 37도 세포 배양 인큐베이터로 이동하여 적어도 20 분 동안 젤을 할 수 있게합니다.겔화 기간 후, 인큐베이터에서 세포 콜라겐의 12웰 플레이트를 가져 가라. 젖은 얼음에서 1.7 밀리리터 캡튜브를 제거한 다음, 냉장에서 스톡 콜라겐을 제거하고 뚜껑을 열고 젖은 얼음 위에 놓습니다. 냉각된 셀 서스펜션 516마이크로리터를 차가운 덮인 튜브에 추가합니다.1000 마이크로리터 파이펫을 사용하여 차가운 콜라겐 용액 375 마이크로리터를 캡튜브 내부의 용액에 직접 피펫합니다. 파이펫에서 모든 콜라겐을 튜브로 추방하고 양수 변위 파이펫 팁을 폐기하십시오. 즉시 250 마이크로리터 파이펫으로 전환하고 콜라겐 용액을 혼합한 후 세포 콜라겐 용액 250마이크로리터를 세포콜라겐 지지체에 12웰 배양 인서트의 세포 콜라겐 지지체로 옮은 다음 12웰 플레이트를 섭씨 37도의 세포 배양 배양 배양으로 옮기다.젤 타임 30분 후, 접시를 부드럽게 기울여 겔화를 평가하고 콜라겐이 고화되었는지 확인합니다. 각각 500 마이크로리터와 1000 마이크로리터의 블렌드 미디어를 인서드의 상부 챔버 및 하부 챔버에 추가합니다. 콜라겐 젤이 침수되어 필요한 경우 더 많은 미디어를 추가하십시오.하룻밤 배양에 대 한 세포 배양 인큐베이터에 웰 플레이트를 배치 합니다. 7일째에 수동 파이펫을 사용하여 각 구조의 하단 및 상단 챔버에서 미디어를 수집하고 폐기합니다. 투과성 멤브레인 바로 아래에 붙어 있는 미디어를 수집하려면 파이펫 팁을 멤브레인 아래에 놓고 삽입물을 일시적으로 제자리에 두드립니다.각 웰의 하부 챔버에 5%FPS로 보충된 인간 피부 등가 또는 HSE 매체의 1밀리리터를 각 우물의 상부 챔버에 200 마이크로리터를 첨가한다. 각질 을 진피 구조 표면에 직접 시드하고 인큐베이터에서 2 시간 동안 정착 할 수 있습니다. 각질 세포를 파종한 지 2시간 후, HSE 매체의 마이크로리터 300개를 조심스럽게 추가하여 각 구조의 상단 챔버에 5%FPS를 잘 보충합니다.미디어를 로드한 후 컨스트럭처를 인큐베이터에 다시 배치합니다. 수동 파이펫을 사용하여 상부 챔버에서만 미디어 낭비를 제거하여 각 구조를 공기 액체 인터페이스 또는 ALI로 들어올립니다. 표피 층을 만지거나 손상시키지 않고 가능한 한 피피 레이어에 가깝게 지내려고 합니다.접시를 다른 각도로 약간 기울여 미디어를 수집한 다음, 일관된 습도를 유지하기 위해 접시의 주변 우물에 약 2밀리리터의 멸균물을 넣습니다. 몇 시간 후에 각질 세포가 ALI에 남아 있는지 확인하십시오. 상부 챔버의 미디어를 제거하여 각 우물에서 제거되는 미디어의 양을 추적합니다.표피 층은 건조하지 않고 수분을 공급받아야 하지만 구성 위에 미디어가 풀려져서는 안 됩니다. 면역형염색물 염색을 위한 구조물을 준비하려면 인서트를 거꾸로 뒤집어 웰 플레이트 위에 놓습니다. 미세 팁 집게 또는 정밀 나이프를 사용하여 멤브레인 의 둘레의 약 절반을 자르는 동안 한 손으로 인서트를 안정화하십시오.가능한 한 플라스틱 하우징에 가깝게 잘라. 미세 팁 집게를 사용하여 절단 멤브레인 플랩의 가장자리를 잡고 VHSE 구조뿐만 아니라 인서트에서 다공성 멤브레인을 부드럽게 벗깁니다. 구성이 챔버의 측면에 붙어있는 경우, 우물로 이동 미세 팁 집게 또는 작은 스쿠쿨을 사용합니다.VHSE가 잘 되면, 삽입 막의 남은 조각을 버리고 배양 삽입 하우징을 각 우물에 보관하여 염색 중에 잠수된 위치에 VHSEs를 고정하십시오. 이미징 하기 이틀 전에 폴리디메틸실록산 또는 PDMS를 준비하십시오. 깨끗한 믹싱 용기는 계량 저울에 놓고 스케일을 세레합니다.베이스를 추가한 다음 크로스링커를 추가합니다. 용액을 4분 이상 격렬하게 저어작은 거품을 만듭니다. 충분한 혼합 후, 90 또는 100밀리미터 페트리 접시에 PDMS를 붓습니다.모든 기포가 사라지고 PDMS가 명확해질 때까지 진공 챔버에서 PDMS를 제거합니다. 진공을 천천히 풀어 PDMS를 제거합니다. 오븐에 접시를 넣고 하룻밤 동안 50~60°C까지 치료하여 PDMS가 균등하게 치료할 수 있도록 평평하게 앉아 있습니다.이미징 을 하루 전에 강철 펀치 또는 핸드헬드 정밀 나이프를 사용하여 VHSE 구조와 동일한 크기로 PDMS 시트에서 원형을 잘 펀치하거나 잘라냅니다. 원형 주위에 사각형 패치를 잘 잘라 하나의 PDMS를 잘 만듭니다. PDMS와 유사한 크기의 유리 커버 슬립을 사용하면 PDMS의 하단 표면에 시아노아크라이레이트 접착제를 추가하고 일회용 파이펫 팁으로 고르게 얼룩을 추가합니다.유리를 중앙에 대고 펀치 원 안에 투명한 유리 창을 남기면서 PDMS에 잘 누릅니다. 사용하기 전에 접착제가 밤새 건조하게하십시오. 표피와 진피의 특성화는 VHSE 구조에서 인간의 피부에 적합한 면역 형광 마커를 보여줍니다.사이토케라틴(10)은 피부 등가물에서 모든 초라바살 층을 일반적으로 표시하는 초기 분화 각질 세포 마커이다. Involucrin및 filaggrin은 각질 세포에 있는 늦은 분화 마커이고 피부 등가물에서 상부 최상층 표시합니다. VHSE를 지우면 한 설정에서 간단한 이미징을 허용하고 진피와 표피를 별도로 이미지화하기 위해 구조방향을 조정할 필요성을 제거했습니다.볼륨 이미지를 통해 각 구문 전체에 걸쳐 혈관을 매핑하는 3D 렌더링을 생성할 수 있습니다. 이미지 스택은 계산 소프트웨어에 로드되었고 사용자 지정 알고리즘은 3D 렌더링 및 정량화에 사용되었습니다. 골격화는 각 콜라겐 IV 표시 용기의 최종 중심을 결정하고 결과 데이터는 혈관 분획뿐만 아니라 혈관 직경을 계산하는 데 사용되었다.이 절차에 따라, 장벽 분석, 주사 전자 현미경 검사, 지질 프로파일 및 기타와 같은 특성화 방법은 혈관이 표피 성숙과 안정성에 특히 미치는 영향을 이해하기 위해 수행 될 수있다. 이 프로토콜은 혈관 피부 모델에서 조직 관련 및 세포 유형 별 연구를 가능하게 합니다. 그것은 노화와 개인화 된 의학에 있는 연구에 특히 적합합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 비디오는 흑색종 진행을 연구하기 위해 체외 3D 유기형 피부 재건을 생성하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 이 피부 모델은 생체 내 장기의 구조와 다세포 복잡성을 모두 모방합니다.

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혈관은 성공적인 조직 공학의 접근 방법의 핵심입니다. 따라서, 신뢰성있는 기술은 조직 구조에서의 혈관 망의 발달을 평가하기 위해 필요하다. 여기서 우리는 시각화 및 생체 내에서 혈관 생성을 정량화하기 위해 간단하고 비용 효율적인 방법을 제시한다.

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우리는 이러한 keratinocytes 및 섬유 아 세포를 사용 하 여 유도 만능 줄기 세포 유래 keratinocytes 및 섬유 아 세포 분화 및 3D 피부 organoid, 생성 하는 방법을 보여 주는 프로토콜을 제안 합니다. 이 프로토콜 humanized 마우스 모델을 생성 하는 추가 단계를 포함 합니다. 여기에 제시 된 기술 피부과 연구를 향상 됩니다.

코드 혈액 파생에서 3D 피부 Organoid의 생성 유도 만능 줄기 세포

이 프로토콜은 재현 가능하고 견고한 방식으로 3차원 재구성된 인간 표피를 육성하는 간단한 방법을 설명합니다. 또한 표피 장벽 모델의 구조 기능 관계를 특성화합니다. 선동적인 자극에 재구성된 인간 표피의 생물학 반응은 또한 제시됩니다.

대규모로 3차원 재건 된 인간 표피 를 육성

여기서는 마이크로머신 마이크로유체 플랫폼을 사용하여 3차원 단순화 및 미분화 피부 모델을 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 병렬 흐름 접근법은 주사기 펌프에 의해 제어되는 상피 세포의 파종을 위해 진피 구획의 시상 증착을 허용합니다.

마이크로머신 마이크로유체 플랫폼의 간소화된 3차원 스킨 온-어칩 모델 생성

이 프로토콜은 인간 만능 및 유도 만능 줄기 세포로부터 자가 조직화 혈관의 생성을 설명합니다. 이러한 혈관 네트워크는 혈관주위세포, 평활근 액틴 및 연속적인 기저막으로 둘러싸인 광범위하고 연결된 내피 네트워크를 나타냅니다.

만능줄기세포(Pluripotent Stem Cells)에서 인간 혈관 오가노이드(Human Blood Vessel Organoids)의 생성

여기에서는 세포 배양 실험실에서 일상적인 연구를 위해 다양한 3D 피부 모델을 소개하는 저렴하고 간단한 절차를 제시합니다. 연구원은 상업적으로 이용 가능한 모델에 의존하지 않고 필요에 맞는 모델을 만들 수 있습니다.

2차원(2D) 단일 배양에서 3차원(3D) 다중 배양에 이르기까지 다양한 응용 분야를 위한 피부 모델 구축

이 프로토콜은 피부 구조 및 기능을 복제하기 위해 평면, 생리학적으로 관련된 공기-액체 계면 배양 시스템을 사용하여 인간 유도 만능 줄기 세포로부터 모낭을 포함하는 피부 오가노이드를 생산하는 방법을 간략하게 설명합니다.

공기-액체 계면 배양 시스템을 이용한 인간 유도 만능 줄기세포 유래 평면 모발 피부 오가노이드의 생성

배우세요 혈관화된 인체 피부 등가물 생성 방법을 통해 질병, 노화 및 맞춤형 의학 연구를 위한 생리학적으로 관련성 높은 피부 모델을 구축하는 기술을 익히세요.

자가 조립 혈관 인체 피부 등가물의 생성

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