곰팡이, 둘레 및 미각 미각의 전체 마운트 염색, 시각화 및 분석

이 전산 해부 및 분석 워크플로우는 개별 미각 신경 식목, 세포 유형 번호 및 세포 간의 물리적 관계의 완전한 형태를 분석하는 새로운 접근 방식을 제공합니다. 전체 언어 상피를 수집하면 전체 미각 내에서 세포의 절대 수와 내면의 양을 측정 할 수 있습니다. 이 방법은 단면도에서 샘플링을 기반으로 셀 구조의 추정치보다 더 정확하여 기술적 가변성을 감소시킵니다.

이것은 또한 그들의 내부 밴션과 관련하여 미각 세포의 상세한 분석을 제공하는 첫번째 방법입니다. 이 방법은 미각 내의 잠재적인 회로뿐만 아니라 정상적인 맛 기능을 방해하는 질병 과정 및 화학 요법에 대한 조사를 향상시킬 수 있습니다. 이러한 경우 대부분의 경우 어떤 구조 또는 관계가 중단되는지는 불분명하므로 이러한 모든 요소를 그대로 유지하면 단일 준비 내에서 모든 분석을 수행할 수 있습니다.

가장 흔한 실수는 상피의 밑면에 충분히 가깝게 해부하지 않음으로써 상피를 손상시키지 않도록 노력하는 것입니다. 조직 금형의 조직을 동결하기 전에 가능한 한 많은 기본 조직을 제거하는 것이 필수적입니다. 상피가 조직 금형의 바닥에 평평하게 누워 있는지 확인하는 것도 중요합니다.

먼저 혀를 0.1 개의 어금니 인산완충제로 해동하고 헹구는 것으로 시작합니다. 그런 다음 해부 현미경 아래 유리 슬라이드에 곰팡이 유두를 함유 한 전방 혀의 1/2를 놓습니다. 무딘 말단 집게와 해부 가위를 사용하여 근육을 제거하고 언어 상피가 곡선으로 조직을 열어 놓고 거친 해부 가위의 블레이드를 상피와 평행하게 유지하여 조직의 평평한 방향을 보장합니다.

입맛이 들어 있지 않은 혀의 복부 비각질화 상피를 버리십시오. 그런 다음 각질화된 상피의 밑면에 더 가깝게 해부하기 위해 미세 해부 가위를 사용합니다. 무딘 끝의 집게를 사용하여 상피 조각을 조직 금형에 넣고 평평하게 놓이도록하십시오.

그런 다음 조직에 최적의 절삭 온도 화합물 또는 OCT의 한 방울을 추가합니다. 이전에 냉각된 금속 베이스에 티슈 몰드를 해부 범위 아래에 놓고, OCT가 동결될 때까지 집게로 조직을 가볍게 두드려 조직이 가능한 한 평평하게 얼어 붙는다. OCT가 동결되면 신속하게 OCT를 추가하고 얼릴 때까지 냉각 된 2 메틸 부탄의 비커에 금형을 놓습니다.

냉동에 OCT 금형을 마운트하고 20 미크론 섹션으로 잘라. 각 섹션을 수집하고 상피의 기지에 근접을 평가하기 위해 빛 현미경으로 볼 수 있습니다. 조직이 상피의 밑면에서 면도 한 후, 상피를 해동하고 셰이커에 0.1 어금니 PB에서 두 번 헹구.

단단한 입맛 앞쪽을 부드럽고 단단한 입맛의 접합에 잘라낸 다음, 부드러운 입맛을 기본 조직으로부터 분리하여 남은 뼈 조각이 잘라내고 추가 근육 및 결합 조직을 제거합니다. 무딘 끝의 집게로 미각을 잡고 나머지 땀샘을 제거하고 면도날로 부드럽게 긁어 내어 결합 조직을 잃게됩니다. 전체 미각과 Phox2b-Cre TdTomato 마우스의 모든 미각 은 DsRed 및 각질 8에 대한 항체로 언어 상피를 염색하여 라벨을 부착했습니다.

미각 부피를 측정하고 곰팡이 또는 둘레 측정 영역에서 미각 볼륨과 내측 부피 사이의 상관 관계가 없음을 밝혔다. TrkB CreER TdTomato 마우스에 있는 타목시펜의 낮은 복용량의 행정은 유전자 재조합 및 소수의 뉴런의 라벨을 일으키는 원인이 됩니다. 전산 미각은 세포 마커를 변형시키는 미각으로 염색된 탄산 안수드라제 4와 인지질AE C 베타 2가 여기에 나와 있다.

이 미각은 섬유를 재구성 한 후 제거 된 미각과 함께 표시되는 두 개의 레이블 터미널 아버가 있습니다. 세포 픽셀 기반 이미징 소프트웨어를 사용하여 신경 섬유와 미각 변환 세포 간의 가장 근접성을 확인함으로써 19가지 맛 중 19가지 맛 중 블루 단말 아버가 연한 청색 탄산 수화물 4개 이상의 세포의 200나노미터 이내의 것으로 나타났다. 녹색 추적과 관련된 말단 식소는 마젠타에 표시되며 빛과 진한 청색 탄화 수화물 4개 이상의 세포 모두에서 200 나노미터 내에 있다.

전체 마운트 케라틴 8 및 5-에티닐-2'데옥시리딘 또는 곰팡이 형성 미각의 EdU 염색은 EdU 라벨 세포가 미각 안팎에서 모두 존재한다는 것을 밝혔다. 마젠타와 보라색 핵은 미각의 각질 8 플러스 테두리 외부에서 관찰된다. 노란색, 청록색 및 청색 세포는 미각 안에 있었습니다.

이 프로토콜을 시도할 때 조직 해부 및 동결 단계는 중추적인 역할을 합니다. 이러한 조직 해부 방법은 입맛 내와 미각 외의 관계를 분석하기 위해 다양한 세포 및 구조에 대한 염색에 의해 뒤따를 수 있지만 유두 내에서. 이것은 미각 내의 전체 맛 아버의 첫 번째 분석뿐만 아니라 맛을 유발하는 세포와의 관계입니다.

이러한 요소 중 몇 가지를 단일 준비로 보존하고 염색하면 분석 가능성이 확장되고 가능한 측정을 구체화합니다.