급성 뇌 슬라이스에서 내인성 모아민 방출 측정을 위한 판 기반 분석

이 방법은 급성 뇌 슬라이스를 사용하여 내인성 모아민 방출의 검출을위한 간단한 기술을 소개합니다. 설정은 모노아민 방출을 위한 조직 홀더를 포함하는 48웰 플레이트를 사용합니다. 방출된 모노아민은 HPLC에 의해 전기화학적 검출과 결합하여 분석된다. 또한,이 기술은 약물 발견을위한 스크리닝 방법을 제공합니다.

이 기술은 모노아민 방출을 검사하기 위한 일반적으로 사용되는 방법의 적응으로, 한 번에 여러 약리학 조건 하에서 방사성 표지모노아민을 미리 로드하지 않고 내인성 방출의 측정을 허용한다. 이 기술의 주요 장점은 상당히 비용 효율적이며 다중 약리학 조건이 한 번에 검사 될 수 있으며, 우리는 내인성 모노아민 방출을 연구 할 수 있으며, 우리는 성체 및 수송 매개 방출을 구별 할 수있는 능력으로 내인성 모노아민 방출을 연구 할 수 있습니다. 수확 후 성인 250~350그램의 수컷 쥐의 뇌 슬라이스를 준비하기 위해 즉시 뇌와 얼음을 차갑게 산소로 공급한 해부 버퍼를 배치하고 각 관심 영역에서 300개의 미크론 관상 동맥 뇌 섹션을 획득합니다.

뇌 슬라이스의 추가 해부를 위해, 조심스럽게 유리 슬라이드에 조직을 이동하고 어두운 줄무늬 구조에 따라 등색 striatum을 식별하기 위해 쥐 뇌 아틀라스를 사용하여, 피질과 독특한 나선형 구조에 근접에 따라 해마를 식별합니다. 제어 및 실험 슬라이스로 사용하기 위해 오른쪽 과 왼쪽 반구를 분리합니다. 등지 점막은 2밀리미터 펀치로 더 해부될 수 있습니다.

그런 다음 수정된 팁이 있는 플라스틱 이송 파이펫을 사용하여 산소 버블링이 있는 산소 얼음 냉부 버퍼에 침지된 작은 용기로 샘플을 옮춥춥게 만듭니다. 모노아민 방출을 유도하기 위해, 일정한 부드러운 버블링과 잘 당 efflux 버퍼의 0.5 ~ 1 밀리리터를 포함하는 사용자 정의 만든 48 잘 efflux 챔버의 각 우물에 조직 샘플을 전송하고 샘플이 섭씨 37도에서 30 ~ 50 분 동안 복구 할 수 있도록. 평형 기간이 끝나면 약리학제의 유무에 관계없이 500 마이크로리터의 산소 가루 버퍼를 포함하는 우물로 뇌 조직을 가진 조직 홀더를 이동하여 우물 가장자리에 홀더를 두드려 섭씨 37도에서 20 분 동안 우물 사이의 완충체의 최소 전달을 방지하십시오.

인큐베이션이 끝나면, 관심 있는 약물의 유무에 관계없이 500마이크로리터의 약류 완충제가 포함된 새로운 우물 세트로 홀더를 이동하고 추가 20분 동안 세포 배양 인큐베이터로 플레이트를 반환한다. 두 번째 인큐베이션 동안, 첫 번째 배양에서 얼음에 하나의 정상 과염소산 또는 인산산의 50 마이크로 리터를 포함하는 미세 센심 분리튜브로 우물에서 용액을 전송, 튜브 번호 1"두 번째 인큐베이션의 끝에서, 얼음에 접시와 함께 우물을 비우고 하나의 정상 과염소 또는 인의 50 마이크로 리터를 포함하는 새로운 미세 원심 분리튜브에 두 번째 인큐베이션에서 슈퍼 네이티퍼를 전송하는 조직 홀더를 이동 얼음 위에 산. 이 튜브 번호 2"모든 초월제가 옮겨졌을 때, 각 조직에 얼음 차가운 해부 버퍼 1 밀리리터를 추가하고 작은 핀셋을 사용하여 각 조직 샘플을 새로운 미세 원심 분리기 튜브로 옮춥니까.

샘플 튜브에서 버퍼를 제거하고 조직을 영하 80도의 섭씨영80도에 저장한 다음 수집된 인큐베이션 솔루션을 미세원심분리기 필터 튜브로 옮겨 원심분리를 위해 얼음 위에 여과물을 놓습니다. 단일 광산 검출을 위한 제조업체의 권장 사항으로 ECD 및 유량의 잠재력을 설정합니다. 자동 주입 및 검출을 위해 HPLC에 신경 송신기 표준을 포함하여 각 샘플의 부하 및 적절한 알리쿼트 및 적절한 알리쿼트 및 계측기가 분석을 완료할 수 있도록 합니다.

그런 다음 HPLC 분석 소프트웨어를 사용하여 각 모노아민으로 구성된 표준 곡선을 사용하여 크로마토그래프 데이터를 획득하고 분석하여 제조업체의 지침에 따라 곡선 아래 영역을 얻습니다. 기능 분석 6시간 후에, 조직 견본은 실행 가능한 남아 있습니다, 1%Triton X-100로 배양한 견본은 MTT 변환에 있는 중요한 감소를 보여줍니다 동안. 암페타민을 가진 해마와 전두엽 피질 두뇌 단면의 급성 20 분 처리는 각 monoamine의 세포외 수준에 있는 중요한 증가를 유도합니다.

시료가 플루옥세틴으로 전처리될 때, 선택적 세로토닌 재업 억제제, 해마 내의 세포외 세로토닌의 암페타민 유도 증가가 발생하지 않으며, 세포외 도파민및 노르에피네프린 생산의 증가는 영향을 받지 않는다. 또한, 암페타민을 가진 등쪽 striatum 펀치의 급성 20 분 치료는 세포 외 도파민 수준 발현의 35 배 증가를 유도하고, 코카인을 가진 등쪽 striatum 펀치 처리, 모노아민 수송기 차단제, 암페타민 유도 외세포 도파민의 현저한 억제귀착됩니다. 염화칼륨의 농도를 증가시켜 막 탈극화를 유발하는 것은 처리되지 않은 대조조건에 비해 모노아민의 외세포 방출을 유도하기에 충분하며, 플루옥세틴이나 코카인 치료블록도 이 깊은 편광 유도증가를 유도한다.

깨끗한 절단 섹션, 펀치의 정확한 국소화를 가지고, 실험 전반에 걸쳐 일관된 산소를 유지하는 것이 필수적이다. 뇌 단면은 서양 얼룩 및 히스토로지와 같은 추가 생화학 적 처리 및 분석을 위한 사후 실험을 사용할 수 있습니다.