Name: 뮤린 Dextran 나트륨 황산염 유도 대장염 모형에 있는 장 염증을 위한 체계적인 채점 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: 배우세요 DSS 유도 뮤린 대장염 모형에서 전체 결장의 점막 손상을 정량적으로 평가하는 체계적인 채점 분석 방법입니다. 이 프로토콜은 객관적이고 재현 가능한 조직학적 평가를 제공합니다.

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저자는 NIH 자금 DK055679, DK089763, DK079392, DK061739, DK072564 및 미시간 대학 병리학 슬라이드 스캐닝 서비스의 지원을 인정하고자합니다.

설명된 모든 동물 실험은 동물의 사용 및 배려에 미시간 대학의 위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 조직 수확
<ol><li>승인된 프로토콜에 따라 자궁 경부 탈구다음에 이소플루란 마취를 사용하여 인간적으로 마우스를 안락사시. 모든 동물 실험에 대해 동물 취급에 대한 국가 및 기관의 지침에 따라 인증 된 검토 위원회에 의해 승인을 받았습니다.</li>
	<li>마우스를 해부 패드에 양분 패드에 놓습니다. 20 G x 1/2 인치 G 바늘을 사용하여 마우스 사지를 고정합니다.</li>
	<li>집게와 가위를 사용하여 복부 피부에 작은 절개를하고 옆으로 당겨 복막을 노출시합니다.</li>
	<li>복막뼈에서 복부 의 측면에 이르기까지 복막에 중간개절로 복강을 엽니다.</li>
	<li>내장이 시각화될 때까지 조직과 장기를 신중하게 제거합니다. 결장의 양쪽에 있는 골반 뼈를 잘라 내어 항문에서 cecum쪽으로 확장된 장기를 완전히 시각화합니다.</li>
	<li>결장에 부착된 지방, 작은 정맥 및 동맥을 부드럽게 제거하고, 조심스럽게 장기를 해부하면서 항문과 근위를 자르고 cecum에 단면으로 절단하십시오. 참고: 해부된 결장은 스위스 롤 절차를 완료하는 동안 실온에 머물러야 합니다.</li>
	<li>항문을 통해 삽입된 유연한 플라스틱 개비지 바늘을 사용하여 대변 내용물을 제거하여 1배 PBS로 결장들을 조심스럽게 플러시합니다.</li>
	<li>결장은 직선으로 배치하고, 간질 동맥을 따라 세로로 엽니다. 결장과 근위쪽 끝에 경구로 결장(도1A)을양분한다. 조직의 절반은 조직 학적 분석을 위해 사용될 수 있으며 다른 하나는 서부 블롯, PCR 또는 신선한 냉동 면역 형광 현미경 검사법(12)에대한 두 번째 스위스 롤로 압연 될 수 있습니다.</li>
</ol>2. 스위스 롤 준비
<ol><li>전체 결장의 길이를 따라 거의 동일한 폭이 얻어질 때까지 면도날을 사용하여 근위 결장에서 여분의 조직을 다듬는다.</li>
	<li>결장정렬하여 루멘을 향상에 노출시키고 유연한 개비지 바늘을 사용하여 조직을 완전히 평평하게 합니다. 더 많은 PBS를 추가, 필요한 경우, 절차 전반에 걸쳐 조직을 촉촉하게 유지 하기 위해.</li>
	<li>종이 닦아 PBS의 초과를 제거합니다. 주사기 와 gavage 바늘로, 조직을 고치고 평평하게하기 위해 2-3 분 동안 조직에 10 % 중성 완충 포어틴 용액을 추가합니다.</li>
	<li>직선 집게를 사용하여 결단결의 끝을 잡고 결장결을 원심 끝에서 근위 쪽 끝에 동심원으로 비틀어넣습니다(도1B). 참고: 에이핑거를 사용하여 압연하면서 스위스 롤 내부를 밀어낼 수 있어 조직이 롤 내부에 있는지 확인할 수 있습니다.</li>
	<li>27 G 바늘을 삽입하여 중간에 결장고정하여 스위스 롤모양(그림 1C)을고정합니다.</li>
	<li>스위스 롤에 바늘을 넣은 카세트에 내장된 카세트에 넣습니다. 참고: 조직은 고정하기 전에 카세트에 대하여 병렬로 지향되어야합니다(도 1D).</li>
	<li>4°C13에서하룻밤 사이에 10% 중성 완충 포어틴 용액으로 조직을 고정한다.</li>
	<li>하룻밤 고정 후, PBS로 조직을 3 배 세척합니다.</li>
	<li>파라핀 포함 공정 전에 조직에 70% 에탄올을 추가합니다. 진행하기 전에 스위스 롤에서 바늘을 제거합니다. 조직은 파라핀임베디먼트(13)까지실온에서 에탄올에 보관할 수 있다.</li>
	<li>샘플을 티슈 프로세서에 넣고 파라핀에 내장되어 있으며, 양전하 현미경슬라이드(그림 1E)에장착된 4μm 섹션을 준비합니다. 이는 선택적 정지 지점일 수 있습니다. 참고: 적절한 조직 배향은 이미지 분석에 적합한 섹션을 달성하는 데 중요합니다. 파라핀 카세트에 평행 스위스 롤 을 포함하면 이미지 분석에 적합한 전체 섹션이 생성됩니다(그림 1F-1H). 경사 섹션은 불완전한 섹션을 방지하기 위해 피해야합니다(그림 1I-1K). 자세한 내용은 토론 섹션을 참조하십시오.</li>
	<li>헤마톡시린과 에신(H&amp;E)13을가진 스테인 섹션 .</li>
</ol>3. 디지털 스캐닝 및 분석
참고: 점막 변경에 대한 정확한 평가를 위해 전체 결장 길이의 90% 이상을 포함하는 섹션만 선택합니다.
<ol><li>슬라이드 스캐너 또는 이미저를 사용하여 스테인드 섹션을 스캔합니다(재료 표참조). 생성된 이미지는 40배 목표와 40배 배율로 픽셀당 0.25 미크론의 해상도가 필요합니다.</li>
	<li>스캔한 슬라이드의 디지털 분석을 위한 적절한 소프트웨어를 설치하고 다운로드합니다(자료 표참조).</li>
	<li>이미지 프로세싱소프트웨어(그림 2A)에서스캔된 이미지를 엽니다. 전체 결장이 표시되고 샘플의 누락된 영역이 없는지 확인합니다.</li>
	<li>레이블 이미저를 활성화하고 막대 도구를 조정하여 레이블 이미저(그림 2A)를클릭하여 스캔된 슬라이드를 올바르게 식별합니다.</li>
	<li>주석 도구를 열고 주석 도구를열고(그림 2A)을클릭하여 3개의 상이다른 층(도 2B)을클릭하여 스위스 롤, 염증/부상 및 침식/궤양을 정량화한다. 레이어 색상(그림 2B)을클릭하여 각 레이어에 대해 다른 색상을 선택합니다.</li>
	<li>각 층/범주의 길이를 펜도구(그림 2A)를클릭하여 근막 점막을 참고로 사용하여 측정합니다.<ol>
<li>근육점막의 적절한 시각화를 용이하게 하기 위해 400 μm 줌(또는 그 이상)에서 이미지를 본다. 참고: 배율은 마우스 스크롤 휠을 사용하여 쉽게 제어되며 모든 선을 그리려면 섹션을 가로질러 이동하는 동안 필요에 따라 조정해야 합니다.</li>
		<li>펜 도구를 클릭하여 근육점막(그림2A)에따라 선을 그립니다. 필요에 따라 포인터를 이동하여 분석을 위해 인접한 영역을 시각화합니다. 참고: 펜이 중지될 때마다 작은 새 레이어 영역이 생성됩니다. 레이어 영역 탭으로 시각화하고 편집할 수 있습니다(원하는 세그먼트를 선택하고 실수 또는 수정시 레이어 삭제를 클릭합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>모든레이어(그림 2C)가정의되면, 레이어 영역 옵션(그림2B)내의 텍스트 파일 버튼으로 내보내기 그리드를 사용하여 데이터를 내보냅니다. 참고: 데이터가 제대로 저장되도록 레이어를 만드는 동안 파일을 자주 저장합니다.</li>
	<li>텍스트 파일을 열고 스프레드시트 소프트웨어로 데이터를 복사합니다. 각 지역의 모든 세그먼트를 합산하고 총 길이에 대한 부상 및 궤양의 백분율을 계산합니다.</li>
	<li>조직학 대장염 점수(HCS)를 계산하고 질병의 심각성을 평가하기 위해 아래와 같이 세 가지 주요 특성을 고려하십시오.<ol>
<li>폐구 발광축에서 조직된 상피 세포, 면역 세포가 적은 라미나 프로프리아, 점막과 아부코사(그림3A)를계면한 서브자센트 근육점막이 특징인 건강한 장점막을 확인한다.</li>
		<li>소굴로 침투하여 감쇠또는 부분적으로 누락된 상피 세포 및 점막 염증을 특징으로 하는 염증/상해를 확인하십시오(그림3B).</li>
		<li>표면 상피가 없는 영역또는 연관된 백혈구(도3C)의유무에 관계없이 상피 토굴이 완전히 결여된 영역을 특징으로 하는 침식/궤양의 존재를 확인한다.</li>
	</ol></li>
	<li>다음 수식에서 총 길이의 백분율로 표현된 부상 및 궤양 영역의 HCS 계산: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62135/62135eq01v2.jpg"> 참고: HCS는 염증/부상 및 침식/궤양의 백분율을 결합하여 상피의 완전한 손실이 장벽 무결성의 최대 손실을 초래하고 따라서 더 나쁜 질병을 초래한다는 합리적인 가정에 근거하여 후자에 2의 요인을 추가합니다. HCS는 일관되게 DSS 유도된 실험 대장염에 기인한 형태학적 변화를 나타냅니다. 흥미롭게도, 우리는 DSS 대장염에 있는 결장 림프골 집계 또는 여포 및 임상 질병 엄격의 수 사이 명확한 상관관계를 보이지 않았고, 그러므로, 우리는 이 분석에 정량화를 포함하지 않았습니다.</li>
	<li>대표 이미지의 스냅샷을 찍고(스냅샷클릭, 그림 2A)을클릭하고 저장합니다. 표시/숨기기 스케일 표시 (그림 2A)를클릭하여 필요한 경우 스케일 막대를 포함합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Kagnoff, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+epithelium+is+an+integral+component+of+a+communications+network%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The intestinal epithelium is an integral component of a communications network.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 2841-2843 (2014).</li>
<li>Laukoetter, M. G., Nava, P., Nusrat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+intestinal+barrier+in+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Role of the intestinal barrier in inflammatory bowel disease.</a> World Journal of Gastroenterology. 14 (3), 401-407 (2008).</li>
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<li>Ordas, I., Eckmann, L., Talamini, M., Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ulcerative+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Ulcerative colitis.</a> Lancet. 380 (9853), 1606-1619 (2012).</li>
<li>Vowinkel, T., Kalogeris, T. J., Mori, M., Krieglstein, C. F., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+dextran+sulfate+sodium+load+on+the+severity+of+inflammation+in+experimental+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+Diseases+and+Sciences%22%5BJournal%5D)">Impact of dextran sulfate sodium load on the severity of inflammation in experimental colitis.</a> Digestive Diseases and Sciences. 49 (4), 556-564 (2004).</li>
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<li>Kozlowski, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+entirely+automated+method+to+score+DSS-induced+colitis+in+mice+by+digital+image+analysis+of+pathology+slides%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">An entirely automated method to score DSS-induced colitis in mice by digital image analysis of pathology slides.</a> Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 855-865 (2013).</li>
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<li>Mizoguchi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Molecular+Biology+and+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">Animal models of inflammatory bowel disease.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 105, 263-320 (2012).</li>
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<li>Khounlotham, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compromised+intestinal+epithelial+barrier+induces+adaptive+immune+compensation+that+protects+from+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Compromised intestinal epithelial barrier induces adaptive immune compensation that protects from colitis.</a> Immunity. 37 (3), 563-573 (2012).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

우리의 조직학 대장염 점수 시스템은 내장의 조직 염증과 손상을 정량화하는 신뢰할 수있는 도구를 구성합니다. 이 접근법은 작은 지역 또는 불완전한 단면도의 선택의 편견 없이 전체 기관의 조직 병리학 상태의 향상된 이해를 제공합니다. 이 프로토콜을 성공적으로 실행하는 중요한 단계 중에는 결장 길이의 90% 이상을 분석할 수 있는 스위스 롤을 적절히 준비하는 단계입니다. 파라핀 포함 및 단면 동안 병렬 방향은 상피 지하실의 세로 보기를 가진 직선적이고 균일 한 조직 섹션을 보장하기 위해; 숙련 된 병리학자의 감독과 연습 및 훈련 연수생 급성 염증 사이의 차이를 식별 확인, 상피 손상, 침식 / 궤양; 고해상도 디지털 스캐너에 액세스할 수 있습니다.
작은 조정 및 문제 해결은 파라핀 포함 시 스위스 롤을 적절히 방향을 지정해야 하며 단면화 중에 는 파라핀 카세트 및 블레이드(도1E-F)에비해 조직이 병렬 지향되도록 해야 합니다.<strong class="x...

위장관 상피 장벽은 기본 조직 구획1에서발광 항원 및 병원균을 분리하는 데 중추적 인 역할을한다. 염증성 장 질환 (IBD), 허혈 또는 외과 적 부상과 같은 병리학 적 조건에서 볼 수있는 상피 손상 및 점막 상처는 설사, 체중 감소, 대변의 혈액 및 복통을 포함하는 임상 증상과 관련이 있습니다. 상해에 응하여, 상피 세포는 점막 결점을 다시 상형화하고 복구하기 위하여 이주하고 증식합니다. 점막 무결성의 염증 및 배상금의 해결은 장 점막 항상성 및 기능2,3,4를재확립하는 데 매우 중요합니다.
다양한 동물 모델은 장 상피 장벽의 손상과 관련된 기본 분자 메커니즘을 연구하기 위해 사용되었습니다. 화학적으로 유도된 대장염의 잘 확립되고 쉽게 적용 가능한 모델은 특히 IBD와 같은 염증성 손상과 관련된 연구에서 널리 사용됩니다. 일반적인 재현 가능하고 신뢰할 수 있는 뮤린 대장염 모델은 요염 나트륨(DSS)을 매개한 대장 상해와 염증을 사용합니다. 질병의 중증도는 마우스 변형, DSS 투여 량, DSS 투여 길이 및 DSS5,6,7의분자량에 따라 다릅니다.
DSS 대장염 중 장 점막 손상은 일반적으로 체중 감소, 대변 혈중 및 대변 일관성에 의해 결정되는 복합 점수인 질병 활동 지수(DAI)를 사용하여 평가됩니다. 대변 혈액 함량은 현미경 (대변 과이악 산 검사를 사용하여 검출) 또는 거시화 될 수 있습니다; 대변 일관성은 하드, 소프트 또는 액체 (즉, 설사) 5,8로분류된다. 이러한 임상 매개 변수의 점수는 주관적이고 사용자의 경험과 편견에 따라 달라질 수 있지만 전반적으로 데이터는 신뢰할 수있는 정보를 제공하고 IBD 연구원이 널리 사용됩니다. 대조적으로, 점막 손상의 조직학적 평가를 위한 일반적으로 허용되는 방법은 없습니다. 가장 일반적으로, 결장의 선택된 지역은 훈련된 병리학자에 의해 검사되고 일반적으로 토굴 손상 및 백혈구 침투9,10,11을포함하는 몇몇 매개변수를 기준으로 득점됩니다. 그러나, 조사된 파라미터의 수와 분석된 조직의 양은 개별 보고 사이에서 상당히 다르기 때문에, 많은 간행된 연구 결과의 비교는 제한됩니다. 관찰자 편향을 줄이고 연구 간 일치를 향상시키기 위해 이상적인 조직적 채점 프로토콜은 1) 대장의 전체 길이를 포함해야 한다: 장 점막 염증이 가장 자주 가변적이고 병변이 일반적이기 때문에, 2) 특정 키에 대한 분석을 제한하고 쉽게 해석 할 수있는 매개 변수로 주관성을 감소시키고, 3) 많은 수의 샘플 및 4) 널리 사용할 수있는 데이터 및 4) 사용 가능한 데이터 제공에 사용할 수 있습니다.
여기서우리는 DSS 유도 대장염으로 인해 장 점막 염증및 손상을 분석하기 위해 무료 컴퓨터 보조 점수 시스템의 사용과 함께 "스위스 롤"구성으로 소장의 전체 결장 또는 긴 세그먼트를 처리하는 기술을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>아페리오 AT2 &ndash; 고용량, 디지털 전체 슬라이드 스캐닝</td><td>Leica Biosystems</td><td>Aperio AT2</td><td></td></tr><tr><td>방수 수분 장벽이 있는 흡수성 언더패드</td><td>VWR International</td><td>56616-032</td><td></td></tr><tr><td>American Line 66-0089 싱글 엣지 블레이드, 패키지당 100</td>개 <td>GT Midwest</td><td>TL5837</td><td></td></tr><tr><td>BD Luer-Lok 일회용 주사기(바늘 없음</td>) <td>Fisher scientific</td><td>14-823-2A</td><td></td></tr><tr><td>Bonn Strabismus 가위 - ToughCut</td><td>Fine Science 도구</td><td>11103-09</td><td></td></tr><tr><td>Bonn Strabismus 가위 - ToughCut</td><td>Fine Science 도구</td><td>14084-09</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science 도구</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>포르말린 용액, 중성 완충, 10%</td><td>Sigma</td><td>HT501640-19L</td><td></td></tr><tr><td>HistoPrep 70%</td><td>Fisherbran</td><td>70% 변성 에틸 알코올</td><td></td></tr><tr><td>ImageScope</td><td>Aperio</td><td>버전 12.3.3.5039</td><td>http://www.leicabiosystems.com/pathology-imaging/aperio-epathology/integrate/imagescope/</td></tr> <tr><td>LeakBuster 검체 용기: 칼슘</td> 및 마그네슘 없는 멸균 <td>Starplex Scientific</td><td>B120210</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 공급 튜브, 20 GA x 30 mm</td><td>Instech</td><td>FTP2030</td><td></td></tr><tr><td>PrecisionGlide 바늘, 크기: 20 g x 1 1/2 in</td><td>BD (Becton, Dickinson and Company)</td><td>305176</td><td></td></tr><tr><td>PrecisionGlide Needle, 크기: 27 g x 1/2 in</td><td>BD (Becton, Dickinson and Company)</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>주사기, 10 ml</td><td>BD (Becton, Dickinson and Company)</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>Unisette 조직 카세트</td><td>Simport</td><td>M505-2</td><td></td></tr></tbody></table>

뮤린 dextran 나트륨 황산염 유도 대장염 모형에 있는 장 염증을 위한 체계적인 채점 분석

Systematic Scoring Analysis for Intestinal Inflammation in a Murine Dextran Sodium Sulfate-Induced Colitis Model

뮤린 대장염 모델은 염증성 장 질환의 병리학을 이해하는 데 초점을 맞춘 연구에서 광범위하게 사용되는 도구입니다. 그러나 질병 심각도의 객관적이고 재현 가능한 정량화를 위한 강력한 표준은 정의되어야 합니다. 대부분의 대장염 분석 방법은 소장의 작은 세그먼트의 제한된 조직학 점수에 의존하여 부분적 또는 편향된 분석으로 이어집니다. 여기서, 우리는 전체 결장의 고해상도 영상 수집 및 세로 분석을 결합하여 뮤린 대장염의 유도된 탈파나트륨(DSS)에서 장 내 부상 및 궤양을 정량화한다. 이 프로토콜은 광범위한 사용자 교육 없이 객관적이고 재현 가능한 결과를 생성할 수 있도록 합니다. 여기서는 DSS 유도 대장염의 데이터 예를 사용하여 샘플 준비 및 이미지 분석에 대한 포괄적인 세부 정보를 제공합니다. 이 방법은 점막 손상과 관련된 중요한 염증이있는 뮤린 대장염의 다른 모델에 쉽게 적응 할 수 있습니다. 우리는 결장의 전체 길이에 비해 염증 / 부상 및 침식 / 궤양 점막의 분획이 DSS 유발 질병 진행 중 체중 감소와 같은 임상 연구 결과를 유사하게 한다는 것을 보여줍니다. 이 조직학적 프로토콜은 DSS 대장염 실험에서 편견없는 방식으로 질병 활동의 분석을 표준화하는 신뢰할 수있는 시간과 비용 효율적인 원조를 제공합니다.

DSS 도전 후 점막 손상의 맥락에서 이러한 조직학 대장염 점수 분석의 신뢰성을 설명하기 위해, 우리는 5 일 동안 일반 물로 회복 기간을 5 일 동안 8 10 주 된 남성 C57BL6 야생 형 마우스의 식수에 2.5 % DSS를 투여했습니다. DSS의 급성 투여 시 체중에 변화가 없었으며, 0일부터5일째(도 4A)까지. 쥐가 일반 수돗물을 마시기 시작했을 때 체중이 5일째 에 크게 감소했습니다. 혈액 및 연약한 발판은 DSS 투여 3일 후에 나타났고, 실험8일째까지 물에서 3일 동안 계속하였다(도4B). 이러한 관측은 DSS에 노출의 가장 해로운 효력이 일 5와 8 사이 복구 기간 도중 관찰되었다는 것을 건의했습니다. 10일째에 결장 길이를 측정하여 실험이 끝날 때 상당한 단축을 확인하였다(도4C). 콜론은 파...

무료 컴퓨터 보조 시스템을 사용하여 장 염증의 체계적인 점수는 궤양과 염증 변화의 존재를 특징으로 하는 대장염 모델의 조직 병리학적 변화를 정량적으로 비교할 수 있는 강력한 도구입니다. 조직학 대장염 점수 평가는 임상 관찰을 강화하고 데이터 해석을 용이하게합니다.

뮤린 Dextran 나트륨 황산염 유도 대장염 모형에 있는 장 염증을 위한 체계적인 채점 분석

Murine colitis models are tools that are extensively employed in studies focused on understanding the pathobiology of inflammatory intestinal disorders. ...

체계적인 채점 분석은 점막 상해를 평가하기 위한 기술입니다, 훈련된 연구원에 의해 수행될 수 있는 조직학 해석을 촉진합니다. 이 방법의 주요 장점은 자유롭고 사용하기 쉽다는 것입니다. 대장염을 가진 마우스의 장으로부터 얻은 조직학적 데이터의 정량적 분석을 허용한다.이 프로토콜은 다른 유전 배경의 동물에서 질병을 비교하는 데 필요한 전체 결장의 질병 심각도를 해석하는 신속하고 재현 가능한 방법을 제공합니다. 조직 준비를 위해 모든 시약과 재료를 구성하는 것이 중요합니다. 먼저 잔핀 위치에 해부 패드에 안락사 마우스를 배치하고 20 게이지 1.5 인치 바늘을 사용하여 마우스 사지를 고정합니다.집게와 가위를 사용하여 복부 피부에 작은 절개를하고 복막을 노출시키기 위해 옆으로 당긴 다음 복막뼈에서 복막의 중간 절개를 하는 복강을 복부의 측면으로 엽니다. 내장이 시각화될 때까지 조직과 장기를 신중하게 제거합니다. 결장의 양쪽에 있는 골반 뼈를 잘라 내어 항문에서 cecum쪽으로 확장된 장기를 완전히 시각화합니다.조심스럽게 장기를 해부하면서, 조심스럽게 기관을 해부하면서 결장에 부착 된 지방, 작은 정맥, 동맥을 부드럽게 제거하고, 항문과 실산에 단지 근위를 절단. 항문을 통해 삽입된 유연한 플라스틱 게이지 바늘을 사용하여 대변 내용물을 제거하기 위해 PBS로 결장들을 조심스럽게 플러시한다. 결장은 직선으로 배치하고 간질 동맥을 따라 세로로 엽니다.결장과 근위 결단까지 세로로 결장한다. 조직의 절반을 조직 학적 분석을 위해 사용하고 나머지 절반은 서양 얼룩, PCR, 또는 신선한 냉동 면역 형광 현미경 검사용 두 번째 스위스 롤로 압연하십시오. 전체 결장의 길이를 따라 거의 동일한 폭이 얻어질 때까지 면도날로 근위 결장에서 여분의 조직을 다듬습니다.결장정렬하여 루멘을 노출시키고 유연한 개비지 바늘을 사용하여 조직을 완전히 평평하게 합니다. 절차 전반에 걸쳐 조직을 촉촉하게 유지하기 위해 필요한 경우 더 많은 PBS를 추가합니다. 종이 닦아 초과 PBS를 제거합니다.주사기 와 gavage 바늘로, 조직을 고치고 평평하게하기 위해 2 ~ 3 분 동안 10 % 중성 버퍼링 포르말린 용액을 추가 한 다음 직선 집게를 사용하여 탈결결의 끝을 잡고 결장결을 원심 원에서 근위 끝까지 비틀어 냅니다. 27 게이지 바늘을 삽입하여 중간에 결장과 스위스 롤 모양을 고정한 다음 스위스 롤을 카세트와 평행하게 조직을 방향을 그리는 조직학적 표본 용기 안에 포함 된 카세트에 넣습니다. 10% 중성 완충 포어틴 용액을 섭씨 4도에서 하룻밤 사이에 수정합니다.하룻밤 고정 후, PBS로 조직을 세 번 씻으라. 파라핀 포함 공정 전에 70%에탄올을 추가하고 진행하기 전에 스위스 롤에서 바늘을 제거합니다. 조직은 파라핀 임베디드까지 실온에서 에탄올에 보관할 수 있다.이미지 처리 소프트웨어에서 스캔된 이미지를 연 후 전체 결장이 표시되고 샘플의 누락된 영역이 없는지 확인합니다. 레이블 이미저를 활성화하고 막대 도구를 조정하여 레이블 이미저를 클릭하여 스캔된 슬라이드를 올바르게 식별합니다. 주석을 클릭하여 주석 도구를 열고 새로운 레이어를 클릭하여 스위스 롤, 염증 또는 부상, 침식 또는 궤양의 총 길이를 정량화하여 세 가지 레이어를 만듭니다.레이어 색상을 클릭하여 각 레이어에 대해 다른 색상을 선택합니다. 각 층 또는 범주의 길이를 측정하여 펜 도구를 클릭하여 근육점막 다음선을 그리고, 분석을 위해 인접한 영역을 시각화하는 데 필요한 대로 포인터를 이동한다. 400 마이크로미터 줌에서 이미지를 확인하여 근육점막의 적절한 시각화를 용이하게 합니다.펜이 중지될 때마다 작은 새 레이어 영역이 생성됩니다. 레이어 영역 탭으로 시각화하고 편집할 수 있습니다. 총 길이를 검토, 염증 또는 부상, 침식 또는 궤 양을 참조로 근육 점막을 사용하여 측정.모든 레이어가 정의되면 내보내기 그리드를 사용하여 데이터를 레이어 영역 옵션 내텍스트 파일 단추로 내보냅니다. 텍스트 파일을 열고 데이터를 스프레드시트 소프트웨어에 복사합니다. 각 지역의 모든 세그먼트를 합산하고 총 길이에 대한 부상 및 궤양의 비율을 계산합니다.조직학 대장염 점수를 계산하고 질병의 중증도를 평가하기 위해 세 가지 주요 특성을 고려하십시오. 토굴 발광 축에서 조직된 상피 세포, 면역 세포가 거의 없는 라미나 프로프리아, 면역 세포및 서브자센트 근육점막이 특징인 건강한 장 점막을 확인하십시오. 다음으로, 염증 또는 상해를 확인, 이는 감쇠 또는 부분적으로 누락 된 상피 세포와 토굴로 호중구 침투점 염증을 특징으로한다.마지막으로, 침식 또는 궤양의 존재를 확인, 표면 상피가없는 영역 또는 완전히 관련 백혈구의 유무에 관계없이 상피 지하실이 부족한 영역을 특징으로한다. 점막 손상의 맥락에서 이러한 조직학 대장염 점수 분석의 신뢰성을 설명하기 위해, 2.5%DSS는 5일 동안 8개의 C57BL6 야생형 마우스의 식수에서 투여되었고, 이어서 5일간 일반물로 회복기간을 거쳤다. 체중은 DSS의 급성 투여 기간 동안 일정하게 유지되었지만 쥐가 일반 수돗물을 마시기 시작했을 때 극적으로 감소했습니다.혈액과 연약한 발판은 DSS 행정의 3 일 후에 나타나고 실험의 8 일까지 계속되었습니다. 이러한 관측에 따르면 DSS에 노출되는 가장 해로운 효과는 5일과 8일 사이의 회복 기간 동안 관찰되었다. 10일째에 결장 길이를 측정하여 실험이 끝날 때 상당한 단축을 확인하였다.콜론은 파라핀 스위스 롤을 만들기 위해 0일, 2, 5, 7, 8, 10일에 수확되었습니다. 조직은 H&E와 고화질 검사로 염색되어 조직학 대장염 점수와 부상 및 궤양의 비율을 계산하기 위해 분석되었다. 일반 토굴 아키텍처는 처리되지 않은 마우스에서 관찰되었다.DSS 투여 이틀 후 면역 세포 모집이 관찰되었습니다. 5일째에 상피 세포가 손상된 것처럼 보이며 상피 손상과 관련된 상피를 통해 호중구가 침투했습니다. 5일째부터 8일까지 염증과 궤양을 가진 상피 손실 부위가 관찰되었다.10일째에 상피 세포는 궤양 부위를 재생하고 재채우기 시작하여 대장 점막을 천천히 복원하기 시작했습니다. 이 프로토콜을 시도할 때, 제대로 지향적이고 잘 보존된 스위스 롤을 만들고 점막 염증이나 부상, 궤양 또는 침식을 올바르게 식별하는 것이 중요합니다. 이 방법은 TMS 또는 T 세포 전달 모델과 같은 대장염의 다른 모델에서 대장 점막의 전체 길이를 따라 상해를 정량적으로 평가하는 데 사용할 수 있다.

systematic-scoring-analysis-for-intestinal-inflammation-murine

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

식수에서 실시 Dextran 황산 나트륨 (DSS)은 급성 대장염의 설립 murine 염증성 손상 모델입니다. 이 프로토콜은 DSS 치료와 조직의 준비를 위해 방법을 설명합니다.

Dextran의 황산 나트륨 (DSS)를 사용 Murine 대장염 모델링

염증성 장 질환의 실험적 모델은 우리가 pathogenesis와 관련된 복잡한 본래과 적응 면역 반응을 조사 수 있습니다. histological 채점, 프로 - 염증 크린 시토킨 및 myeloperoxidase 활동 부량 사용하여, 하나는 염증성 장 질환에서 볼 이러한 반응을 평가하기 시작할 수 있습니다.

IBD의 DSS 유발 모델에서 창자 염증을 조사

이 비디오는 염증성 장 질환인 대장염의 화학적 유도 쥐 모델을 생성하는 기술을 보여줍니다. 마우스는 적절한 기간 동안 덱스트란 황산나트륨(DSS) 용액을 섭취할 수 있습니다. DSS를 섭취하면 결장의 점액과 상피층 장벽이 손상되어 장내 미생물이 기저 조직으로 들어가 상주 면역 세포가 이를 감지하여 과장된 면역 반응을 매개하여 염증을 유발합니다.

덱스트란 황산염 나트륨 유발 대장염의 쥐 모델을 생성하는 기술

이 비디오는 염증성 장 질환인 DSS 유발 대장염의 쥐 모델에서 결장 손상을 평가하기 위한 헤마톡실린 및 에오신(H&amp;E) 염색 방법을 보여줍니다. DSS를 투여한 쥐에서 결장을 분리하고 조직 절편을 채취한 후, 해당 절편의 H&amp;E 염색은 염증에 의한 조직 손상을 확인하는 데 도움이 됩니다.

DSS 유발 대장염에서 결장 손상을 평가하기 위한 Hematoxylin 및 Eosin 염색

이 비디오는 마우스 결장 조직의 면역조직화학적 염색을 통한 화학적 유발 대장염의 평가를 보여줍니다. 염색된 조직 절편에서 손상된 조직에 많은 수의 면역 반응 세포가 존재한다는 것은 대장염 중 면역 세포의 침투를 나타냅니다.

결장 조직 절편의 면역조직화학적 분석을 통한 화학적 유발 대장염 평가

지난 몇 년 동안, 새로운 세대의 내시경은 쥐 대장염과 대장 종양을 평가하기위한 중요한 진단 연구 보조로 등장했습니다. 우리는 생쥐의 염증과 대장 종양의 내시경 적 평가뿐만 아니라 대장염과 대장 종양의 내시경 심각도를 문서화하는 진수 식별자를 사용하는 새로운 채점 시스템에 여기에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다.

검증 된 내시경 채점 시스템을 사용하여 대장염과 대장 종양의 위험을 평가하기 위해 마우스의 유연한 대장 내시경 검사

염증성 장 질환 (IBD)의 현재 치료는 질병의 증상을 완화 목표로하지만 심각한 부작용을 일으킬 수 있습니다. 따라서, 대안 전략은 동물 대장염 모델에서 연구되고있다. 여기서 우리는 임상 IBD 표지판에 다이어트 보조제의 유익한 효과는 이러한 대장염 모델에서 분석 방법에 대해 설명합니다.

실험 성 대장염 동안 장내 상피 장벽 기능에 영양 보조 식품의 유익한 효과 분석

특정 대상 프로브 질병 (예를 들어, 염증, 감염, 및 tumorigenesis)의 다양 한 종류의 단백질 표정 등의 분자 메커니즘을 분석 하기 위한 혁신적인 도구를 나타냅니다. 이 연구에서 우리는 murine 모델 f 4/80 전용 형광 중재 단층 촬영을 사용 하 여 대 장 염의 장 대 식 세포 침투의 양적 차원 단층 평가 설명 합니다.

검색 및 대 식 세포 관련 Murine 창 자 염증의 정량화에 대 한 단층 형광 중재

Murine 조직 처리에 대 한 표준화의 부족 인간의 표본에 비해 murine histopathological 분석의 품질을 줄일 수 있습니다. 여기, 선물이 murine 염증 및 uninflamed 저 승 조직 처리 및 인간의 샘플을 포함에 대 한 정기적으로 사용 하는 로봇 시스템의 타당성을 보여의 histopathological 검사를 수행 하는 프로토콜.

로봇 시스템을 사용 하 여 처리 하 고 저 승 Murine 샘플 조직학 분석 포함

본 논문은 aortas의 면역 성분을 조사하기 위해 흐름 cytometry 기반 방법을 제공합니다. 신문은 또한 별도로 주변 adventitia 및 혈관 벽을 검사 수 있습니다 추​​가 기법을 보여줍니다. 이 방법은 대동맥 leukocytes의 phenotypical 분석을 수행하고 죽상 경화증 연구에 대한 몇 가지 면역 assays을 적용하는 가능성을 엽니다.

Murine Aortas 이내에 면역 세포의 흐름 Cytometry 분석

배우세요 DSS 유도 뮤린 대장염 모형에서 전체 결장의 점막 손상을 정량적으로 평가하는 체계적인 채점 분석 방법입니다. 이 프로토콜은 객관적이고 재현 가능한 조직학적 평가를 제공합니다.

뮤린 Dextran 나트륨 황산염 유도 대장염 모형에 있는 장 염증을 위한 체계적인 채점 분석

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