Name: 뮤린 상처에서 생물막 분산 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: 학습하세요 뮤린 상처 모델에서 생물막 분산 효율을 평가하는 방법을. 효소 처리와 생체 내외 분석을 통해 항생제 효능 향상 및 면역 청소 개선을 위한 새로운 치료법 개발에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 국립 보건원 (R21 AI137462-01A1), 테드 내쉬 롱 라이프 재단, 재스퍼 L. 및 잭 덴튼 윌슨 재단및 국방부 (DoD MIDRP W0318_19_NM_PP)의 보조금에 의해 지원되었다.

이 동물 프로토콜은 텍사스 공과대학 건강 과학 센터의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(프로토콜 번호 07044)에 의해 검토되고 승인되었습니다. 이 연구는 건강의 국가 학회의 실험실 동물의 배려 그리고 사용을 위한 지침에 있는 권고에 따라 엄격하게 수행되었습니다.
1. 마우스 감염에 대한 박테리아 준비
참고 : 여기에서 우리는 슈도모나스 아에루기노사로만마우스를 감염시키는 것을 설명합니다. 그러나, 그밖 세균성 종은 감염을 일으키는 원인이 되기 위하여 이용될 수 있습니다. 세균균균및재료는 재료표에 상세하다.
<ol><li>이전에설명된바와 같이 이러한 실험에 대해 발광 플라스미드 pQF50-lux23을 운반하는 슈도모나스 아에루기노사 야생형 균주 PAO1을 사용한다.</li>
	<li>당황 한 에를렌 마이어 플라스크에서 P. aeruginosa 균주를 성장, 루리아 - 베르타니 (LB) 국물에 200 rpm에서 흔들어 와 함께 16 받는 시간 20 시간. 플라스미드의 유지보수를 위해 PAO1(pQF50-lux)의 야간 문화에 100 μg/mL의 최종 농도를 추가합니다.</li>
	<li>100 μg/mL 암피실린의 최종 농도를 가진 10mL의 LB 국물을 함유한 Erlenmeyer 플라스크에 하룻밤 문화의 100 μL을 첨가하여 서브컬쳐 P. aeruginosa. 그런 다음 37°C에서 2-2.5h를 흔들어 서 서, 0.4의 OD600 nm로 성장한 다음, 약 104세포의 감염 용량에 대해 3회 연속적으로 희석(1:10)한다.</li>
</ol>2. 바이오필름 분산 효소 제제
참고: 이 연구를 위해 우리는 분산 처리를 위해 "GH"로 지칭될 동등한 부분 아밀라제및 셀룰라아제(각 의 5%)의 10% 용액을 사용합니다.
<ol><li>아밀라제(바실러스 서브틸리스로부터)및 곰팡이 셀룰라아제(아스퍼질러스 니제르출신)의10% GH 용액(w/v)을 1x 인산완충액 식염수(PBS)로 희석한다. PBS를 차량 제어 처리로 사용합니다.</li>
	<li>효소 활성화를 위해 모든 트리트먼트를 37°C로 30분 간 데우습니다.</li>
</ol>3. 실험 동물 및 수술 전 설정
<ol><li>12h 빛/어두운 사이클과 음식과 물에 대한 적절한 접근이 있는 환경 제어 조건에서 케이지당 5마리의 쓰레기 메이트인 하우스 마우스.</li>
	<li>바람직하게는, 8 주에서 10 주 사이에서 여성 스위스 웹스터 마우스를 사용합니다.</li>
	<li>투여할 적정량을 결정하기 위해 마우스를 계량한다.</li>
	<li>100 mg/kg 케타민 10 mg/kg 자일라진의 관면 주사로 마취를 투여하십시오.</li>
	<li>아이 크림 (예 : 새로 고침 P.M.)을 면 봉면을 사용하여 눈에 조심스럽게 바르면 건조함을 줄입니다.</li>
	<li>수술 내내 호흡속도, 피부 색채 및 체온을 포함한 생리학적 파라미터를 모니터링한다.</li>
</ol>4. 등쪽 전체 두께 절제 수술
<ol><li>발가락 핀치및 호흡률 및 노력의 모니터링에 의해 마취의 수술 평면을 평가합니다. 등쪽 표면을 면도하고 10분 동안(또는 제품의 지침에 따라) 탈필 크림을 바르면 부드럽게 제거하여 피부가 건조하도록 합니다.</li>
	<li>통증 관리를 위해, 리도카인0.05 mL을 멸종시킬 영역으로 피하투여하고, 0.02mL의 부프레노르핀을 목 의 스크러프에 피하한다. 통증 관리에 도달 할 수 있도록 10 분 기다립니다.</li>
	<li>절제하기 전에 알코올 면봉을 사용하여 소독 면을 소독하고 1.5cm 직경원을 뒤쪽의 후방 부분으로 그립니다. 시술 내내 멸균 수술장을 유지하고 오토클레이브 기기와 멸균 장갑을 사용하십시오. 오염을 제한하려면 조명이 설치된 분젠 버너로 수술을 수행하고 각 동물에 대한 깨끗한 도구를 사용합니다.</li>
	<li>외과 가위를 가진 panniculus 근육의 수준에 전체 두께, 흥분 피부 상처를 관리합니다.</li>
	<li>절제 후, 반투과성 폴리우레탄 드레싱으로 상처를 즉시 덮습니다.</li>
	<li>드레싱 아래, 상처 침대에 100 μL PBS에 박테리아의 약104 CFU를 주입하여 감염을 확립하십시오. 참고: 상처는 또한 박테리아 및/또는 곰팡이의 다중 종에 동시에 감염될 수 있고, 또는 전형성된생물막(12)또는환자(19)로부터추출한 탈량 조직을 상처 침대에 배치하여 감염될 수 있다.</li>
	<li>감염 후, 그들은 그들의 오른쪽 반사를 회복 할 때까지 가열 패드와 케이지에 마우스를 배치하고 모니터. 참고: 쥐가 감기에 가지 않도록 하십시오.</li>
	<li>48 h에 대한 상처 감염을 설정합니다.</li>
	<li>매일 접착제 드레싱을 검사하여 눈물과 비 준수 부위를 검사하고 필요한 경우 교체하십시오.</li>
</ol>5. 생체 분산 치료
참고: 여기서는 일련의 3개의 국소 상처 관개솔루션(그림 1)을적용하여 분산제의 투여를 설명한다. 그러나, 프로토콜은 젤, 크림 또는 드레싱의 적용과 같은 다른 유형의 전달에 맞게 조정할 수 있다.
<ol><li>치료를 투여하는 동안 마우스를 이소플루란 마취 (산소 분당 3 %와 1 L)에 놓습니다.</li>
	<li>각 마우스에 대해 200 μL의 처리가 포함된 25G 바늘로 3개의 1mL 주사기를 준비합니다.</li>
	<li>효소 용액 또는 PBS 제어200 μL을 조심스럽게 들어 올리고 동물의 머리쪽으로 상처 위에 약간 위에 집게로 피부를 꼬집어 상처에 주입하십시오. 조심스럽게 해제 된 피부를 통해 주사기를 관통하고 천천히 드레싱과 상처 침대 사이의 용액을 주입. 이 연구에서 활용 드레싱은 종종 상처 침대와 주변 조직을 모두 부착합니다.<ol>
<li>상처 침대 전체가 용액으로 덮여 있는지 확인하기 위해, 부드럽게 집게로 드레싱을 들어 올리고 상처 침대에서 꺼내서 천천히 용액을 주입합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>치료 후, 30 분 동안 자신의 케이지에 다시 마우스를 배치합니다.</li>
	<li>치료에 노출 된 후 30 분 후에 이소플루란으로 마우스를 다시 마취하고 주사기로 용액을 흡습하여 이전과 동일한 부위에 구멍을 뚫으십시오. 참고: 이 흡량제 용액에는 분산된 세균 세포가 포함되어 있으며, 이는 다양한 다운스트림 분석을 위해 저장될 수 있습니다.</li>
	<li>매번 새로운 주사기를 사용하여 두 번째 및 세 번째 관개 처리를 첫 번째로 관리합니다.</li>
</ol>6. 생체 분산 이미징 및 분석
참고: 박테리아의 발광 균주가 감염을 개시하기 위하여 이용되는 경우에, In Vivo 화상 진찰 시스템 (IVIS)는 상처 침대에서 분산을 시각화하기 위하여 이용될 수 있습니다.
<ol><li>심상 마우스는 치료 직전과 10 시간 및 20 h 후 처리(도 2 및 보충 도 1)에서처리한다.</li>
	<li>마우스가 IVIS에 개별적으로 배치하고 560 nm의 파장에서 5 s에 대해 각각 을 이미징하여 마취 하에있는 동안 이미징을 수행합니다. 추가 분석을 위해 이미지를 저장합니다. 참고: 최적의 파장 및 노출 시간은 사용된 리포터와 IVIS 기기 및 이미징 소프트웨어에 따라 달라집니다.</li>
	<li>분석을 위해 IVIS 소프트웨어에서 이미지를 열고 도구 팔레트에서 분석할 영역을 선택합니다.</li>
	<li>배경을 고려하려면 사진 의 배경에 원을 배치한 다음 각 마우스의 상처 침대 위에 동일한 크기의 원을 놓습니다.</li>
	<li>측정 값을 업로드하려면 ROI >(관심 영역 보기) 측정을 선택하고 측정 테이블을 스프레드시트에 업로드합니다. 각 상처 침대 측정에서 백그라운드 원을 빼서 각 샘플에 대한 발광을 계산합니다. 다음과 같은 백분율 발광을 계산합니다. ROI 전 치료-ROI 후 치료/ROI 전처리) x 100. 참고: 제어 및 처리된 마우스는 이미지 획득 또는 광채에 영향을 미칠 수 있는 변수에 대해 정규화하기 위해 동시에 분석되어야 합니다.</li>
</ol>7. CFU를 결정하여 분산 평가
<ol><li>100 mg/kg 케타민 10 mg/kg 자일라진을 가진 마취 하에 펜토바르비탈 나트륨(예를 들어, 치명적인 플러스)의 0.2mL의 관전 주사에 의해 마우스를 인간적으로 안락사시킵니다.</li>
	<li>먼저 멸균 집게로 드레싱을 부드럽게 제거한 다음 멸균 수술 가위로 상처 침대 둘레를 잘라내어 상처 침대 조직을 수확하십시오. 가위를 사용하여 근육을 잘라내거나 애타게하는 동안 상처 침대의 한쪽 끝을 집게로 부드럽게 들어 올립니다.</li>
	<li>상처 침대에서 조직을 사전 표지되고 미리 계량한 2mL 균질화 튜브에 PBS 1mL을 함유한다. 샘플을 삽입 한 후 튜브를 다시 계량 한 다음 3-5 번 부드럽게 반전하여 분산되거나 느슨하게 부착 된 박테리아를 헹구고 PBS를 제거하십시오. 신선한 PBS 1mL를 추가합니다.</li>
	<li>비장을 수확하기 위해 마우스를 수핀 해부학적 위치에 배치하고 해부 표면에 사지를 고정하여 고정하십시오. 면적을 소독하고 모피가 시료를 오염시키는 것을 막기 위해 70%의 에탄올로 해부할 영역을 담급니다.</li>
	<li>조심스럽게 하복부의 진피에 수술 가위를 가진 중간선에 수직으로 작은 절개를 만들어 내부 장기에서 피부를 위아래로 끌어 당깁니다. 흉골이 도달 할 때까지 중간 선을 따라 내부로 절개를 계속합니다. 복막 구멍이 노출되고 내부 장기가 보이면 비장을 결합 조직으로부터 부드럽게 분리하고 별도의 균질화 튜브에 배치합니다.</li>
	<li>상처 침대 조직에 대해 설명된 대로 PBS로 비장과 헹구는 무게를 측정합니다. 참고: 관심 있는 다른 장기도 마찬가지로 수확할 수 있습니다.<ol>
<li>초기 절개를 할 때, 내장, 또는 다른 장기를 뚫지 않도록주의하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>60s5m/s의 벤치탑 균질화제를 사용하여 2mL 미리 채워진 비드 밀 튜브에서 샘플을 균질화합니다.</li>
	<li>CFU를 열거하려면 선택적 한천에 샘플과 스팟 플레이트를 연속적으로 희석시합니다. 직렬 희석의 경우, 1.5mL 튜브, 소용돌이에서 PBS의 900 μL으로 샘플의 파이펫 100 μL을 반복하고 5회 반복한다. 도 3에도시된 바와 같이 각 희석제의 피펫 10 μL이 한천판에 있다. 참고: 더 정확한 CFU 수량이 필요한 경우 별도의 한천 플레이트에 샘플의 각 희석100 μL을 확산시면 됩니다.</li>
</ol>8. 분산의 Ex vivo 평가(그림 4)
<ol><li>상기에 설명된 바와 같이 약104 PAO1을 감염시키고 감염 후 48h를 안락사시다.</li>
	<li>조심스럽게 멸균 기술을 사용하여 상처 침대를 방해하지 않고, 집게로 드레싱을 제거합니다.</li>
	<li>멸균 수술 가위를 사용하여 침충병침대의 한쪽 끝을 들어 올려 상처 침대와 가위의 한쪽 끝을 들어 올려 감염되지 않은 조직 아래 근육층과 주변의 감염되지 않은 조직으로부터 감염된 상처 조직을 제거하여 감염되지 않은 피부에서 상처 침대의 둘레를 절단하십시오. 상처 침대 샘플을 동일한 부분으로 나누거나 전체를 사용하십시오.</li>
	<li>상처 조직을 비어 있는 2mL 비드 밀균질화 튜브에 넣습니다. 그런 다음 샘플을 추가 한 후 튜브를 다시 계량합니다. 다음을 통해 샘플의 가중치를 계산합니다. 샘플을 추가 한 후 무게 - 샘플을 추가하기 전에 무게.</li>
	<li>PBS 1mL을 추가하고 튜브를 3-5번 부드럽게 반전하여 샘플을 헹구고 판자 세포를 제거합니다. PBS를 제거하고 폐기합니다.</li>
	<li>1mL의 GH 처리(또는 부정적 대조군으로서 PBS)를 샘플에 넣고 80rpm에서 흔들림을 가진 37°C에서 2시간 동안 배양한다.</li>
	<li>생물막 분산용액을 제거하고 별도의 1.5mL 튜브에 넣습니다. 여기에는 분산된 셀이 포함됩니다.</li>
	<li>나머지 조직 샘플에 PBS 1mL을 추가하고 3-5번 부드럽게 반전하여 남은 분산 된 세포를 헹구십시오. PBS를 제거하고 폐기합니다.</li>
	<li>나머지 조직에 1mL의 PBS를 추가하고 벤치탑 균질화제를 사용하여 60 s에 대해 5m/s에서 균질화하십시오.</li>
	<li>1.5mL 튜브에서 PBS의 900 μL에 100 μL의 샘플을 배치하고 총 6 희석제에 대해 5회 반복하여 분산 된 세포 및 균질화 조직 샘플의 용액을 연속적으로 희석시.</li>
	<li>각 희석의 현물판 10 μL은 미디어 선택적 한충(예를 들어, P. aeruginosa용슈도모나스 격리 용 한천)에 있으며 하룻밤 사이에 37°C에서 플레이트를 배양한다.</li>
	<li>CFU를 계산하고 '분산 퍼센트'를 계산합니다(상피/ (생물막 조직의 CFU내CFU)의 CFU) x 100.</li>
</ol>

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여기서 우리는 생물막 분산제의 효능을 연구하기 위해 활용할 수 있는 프로토콜을 설명합니다. 이러한 프로토콜은 임상 탈면 샘플을 포함하여 분산제, 세균성 종 또는 전 생체 샘플의 다른 유형으로 사용하기 위해 쉽게 적응할 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 분산된 세균 세포를 수집하고 연구하기 위하여 임상적으로 관련있는 모형을 제공합니다. 분산된 세균 세포의 표현형은 판자 또는 생물막 세포의 표현형과 구별되는 것으로 나타났다5,24,25,26; 그러나 생체 내에서 분산된 박테리아의 표현형은 아직 설명되지않았다. 분산제가 치료적으로 사용되는 경우, 이러한 세포가 채택하는 표현형을 이해하는 것 뿐만 아니라 효능을 결정하는 것이 중요합니다. 또한 이 프로토콜은 EP...

전 세계적으로 항생제 내성의 상승은 다양한 세균 감염을 치료하는 항생제 옵션의 부족으로 이어지고 있다1. 항생 저항 이외에, 박테리아는 생물막 관련 생활양식2를채택하여 항생 내성을 얻을 수 있습니다. 생물막은 다당류, 세포외 DNA, 지질 및 단백질3의매트릭스에 의해 보호되는 미생물의 공동체이며, 집단적으로 세포외 중합체 물질 (EPS)이라고 합니다. 항생 저항 위기가 계속됨에 따라 항생제의 사용을 연장하거나 항생제의 효능을 강력하게 하는 새로운 전략이 절실히 필요합니다. 바이오필름 방지 제는 하나의 유망한 솔루션4.
제안된 상이한 항생물막 전략 중, 생물막 EPS의 상이한 성분을 표적으로 하는 분산제의 활용은 치료개발5의최전선에 있다. 글리코사이드 하이드로라스(GH)는 분산제의 이러한 클래스 중 하나입니다. GH는 EPS에 구조적 무결성을 제공하는 다당류 내에서 다른 결합의 분열을 촉매하는 효소의 큰 클래스입니다. 우리 그룹은 다른 사람뿐만 아니라, GH가 효과적으로 생물막을 저하시키고, 분산을 유도하고, 생체 외와 생체 내6,7,8,9,10,11모두에서 다양한 세균성 종에 대한 항생제 효능을 향상시킬 수 있음을 보여주었습니다.
바이오필름 분산에 대한 관심이 증가함에 따라 분산 효능을 평가하는 효과적인 방법을 개발하는 것이 중요합니다. 여기서, 우리는 생쥐의 분산제를 가진 생물막 관련 상처 감염의 치료를 위한 상세한 프로토콜을 제시하고, 분산 효능의 평가, 생체 내 및 전 생체 내. 전반적인 목표는 바이오필름 분산을 효과적이고 효율적으로 측정하기 위해 전임상 모델과 함께 사용할 수 있는 효과적인 방법을 제공하는 것입니다.
뮤린 외과 절제 감염 모형은 생물막 관련 감염을 설치하기 위하여 이 연구 결과에서 이용되었습니다. 우리는 15 년 이상이 모델을 사용하고 광범위하게 우리의관찰을 발표했다7,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21. 일반적으로, 이것은 박테리아가 상처 침대에 국소남아 생물막 관련 (EPS에 둘러싸인 집계에서 본 박테리아) 최대 3 주 지속되는 만성 감염을 설정하는 비 치명적인 감염 모델입니다. 그러나, 마우스가 면역 타협하는 경우에 (타입-1 당뇨병과 같은), 그(것)들은 이 모형에 있는 치명적인 전신 감염을 개발하기에 더 취약해질 수 있습니다.
이 보고서에서, 우리는 상처에서 박테리아의 분산을 평가하기위한 프로토콜을 제공합니다, 모두 생체 내 및 전 생체. 두 프로토콜 모두 분산제의 효능을 검사하고 자신의 강점과 약점을 가지고 사용하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어 생체 내에서 분산을 평가하면 분산 후 신체의 다른 부위에 박테리아가 퍼지는 것과 숙주가 어떻게 반응하는지에 대한 중요하고 실시간 정보를 제공할 수 있습니다. 한편, 분산전 생체내 를 평가하는 것은 조직이 별도로 테스트될 수 있는 여러 부분으로 나눌 수 있으므로, 따라서 요구되는 마우스의 수를 감소시키기 때문에 다중 제제, 투여량 또는 제형을 선별하는 것이 더 바람직할 수 있다. 여러 에이전트를 평가할 때, 당사는 일반적으로 이전에 설명된 6,9,22와같이 시험관 내 분산을 측정합니다. 그런 다음 가장 효과적인 ex vivo를 테스트하고 매우 유망한 에이전트의 제한된 수에 대한 생체 내 테스트를 예약합니다.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 마이크로 원심 분리기 튜브</td><td>Fisher</td><td>14823434</td> 바늘 Fisher 14823434에서 샘플 25G 58<td>의 연속 희석을 완료하는 데 사용</td></tr> 1 <tr><td></td><td></td><td></td><td>mL 주사기에 부착</td></tr><tr><td>암피실린 나트륨 염</td><td>Fisher</td><td>BP1760-5</td><td>50 mg / mL 원액을 만들고 100 &micro를 첨가하십시오. L에서 10 mL의 LB 국물 하룻밤 및 하위 배양</td></tr><tr><td>Amylase</td><td>MP Biomedicals</td><td>2100447</td><td>5% w/v 용액 만들기, 와류 - 다른 분산제를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>부프레노르핀 SR-LAB 5 mL (1 mg/mL)</td> <td>ZooPharm</td><td>RX216118</td><td>통증 주요로 사용 - 다른 옵션을 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>셀룰라아제</td><td>MP Biomedicals</td><td>2150583</td><td>5% w/v 아밀라아제 용액에 5% w/v를 추가하고, 와류를 일으키고, 37°C에서 활성화한다. C 30 분 동안 - 다른 분산제를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>탈모 크림</td><td>월마</td>트 <td>287746</td><td>소량을 사용하여 동물 뒷면의 모낭에 마사지하고 10 분을 할당하여 모발을 제거하십시오</td></tr><tr><td>드레싱 집게, 톱니 모양의 팁</td><td>Fisher</td><td>12-460-536</td><td>다른 형태의 집게를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>삼각 플라스크는 125 mL</td><td>Fisher</td><td>101406</td><td>밤새 성장하고 박테리아의 하위 배양에 사용합니다</td>.</tr><tr><td>FastPrep-24 Benchtop Homogenizer</td><td>MP Biomedicals</td><td>6VFV9</td><td>사용 5m / s 60 초 두 번 조직 균질화</td></tr><tr><td>치명적인 플러스</td><td>Vortech 제약</td><td>0298-9373-68</td><td>주입 0.2 mL intraperitaneal 각 마우스</td></tr><tr><td>균질화 튜브 (비드 튜브 2 mL 2.4 mm 금속)</td> <td>피셔</td><td>15340151</td> Isoflurane 다이아몬드 백 약물 <td>도금을위한 샘플을 균질화하는 데 사용</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>케타민 염산염 / 자일라진 염산염 용액 C-IIIN</td><td>시그마 알드리치</td><td>K4138</td><td>아나세티아로 사용 - 다른 옵션도 아나세티아 LB 국물의 수술 필드를 얻기 위해 활용 될 수 있습니다</td></tr>, <tr><td>밀러</td><td>피셔</td><td>BP1426-2</td><td>25 g / L 및 오토 클레이브</td></tr><tr><td>리도카인 2 % 주사 가능한</td><td>다이아몬드 백 약물</td><td>2468</td><td>표시된 상처 부위 부위의 측면을 통해 0.05mL를 주입하여 마크 중앙에 침착되도록 합니다. 절단 10분 전</td></tr><tr><td>할당 Meropenem</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PHR1772-500MG</td><td>GH 용액에 첨가하여 국소적으로 바르고 15mg/mL 용액을 만들어 주거용 4시간 전 및 6시간 후</td></tr><tr><td>비멸균 면 거즈 스폰지</td><td>Fisher</td><td>13-761-52</td><td>제모 크림</td></tr><tr><td>PAO1 pQF50-lux 박테리아 균주</td> 제거에 사용 <td>Ref [13]</td><td>N/A</td><td>PAO1 pgF50-lux는 본 논문의 대표적인 결과에서 관심 있는 녹농균 균주로 사용되었으며</td></tr>, <tr><td>페트리 접시</td><td>Fisher</td><td>PHR1772-500MG</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충액 식염수 10x</td><td>Fisher</td><td>BP3991</td><td>사용 전 10x에서 1x 희석</td></tr><tr><td>폴리우레탄 드레싱</td><td>Mckesson 66024007</td><td></td><td>둥근 모서리를 잘라내고 나머지 사각형을 4개의 동일한 섹션으로 자릅니다.</td></tr> 슈<tr><td>도모나스 분리 한천</td><td>VWR</td><td>90004-394</td><td>글리세롤 20mL와 45g/mL를 물에 넣고 오토클레이브한 다음 20mL를 페트리 접시에 붓</td></tr>습니다<tr><td>.</td><td>월마트</td><td></td><td>시술 중 건조를 줄이기 위해 눈에 사용하십시오.</td></tr><tr><td>멸균 알코올 준비 패드</td><td>Fisher</td><td>22-363-750</td><td>상처 직전에 피부를 청소하여 해당 부위를 소독하는 데 사용</td></tr><tr><td>스트레이트 섬세한 가위</td><td>Fisher</td><td>89515</td><td>곡선 가위도 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>스위스 웹스터 마우스</td><td>Charles River</td><td>551NCISWWEB</td><td>다른 마우스 균주를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>주사 슬립 팁 1 mL</td><td>Fisher</td><td>14823434</td><td>약물을 투여하는 데 사용됩니다. 효소 치료</td></tr></tbody></table>

뮤린 상처에서 생물막 분산 평가

Assessing Biofilm Dispersal in Murine Wounds

생물막 관련 감염은 비 치유 당뇨병 발 궤양, 만성 부비동염, 재발성 중이염 미디어 등과 같은 다양한 만성 질환에 연루되어 있습니다. 이러한 감염 내의 미생물 세포는 항생제를 방지하고 면역 세포가 감염을 지우는 것을 방지할 수 있는 세포외 중합체 물질(EPS)에 의해 보호됩니다. 이 장애물을 극복하기 위하여는, 연구원은 잠재적인 치료로 분산 에이전트를 개발하기 시작했습니다. 이들 제제는 생물막 EPS 내의 다양한 성분을 표적으로 하여 구조를 약화시키고 박테리아의 분산을 시정하여 이론적으로 항생제 효능및 면역통전을 개선할 수 있다. 상처 감염에 대한 분산제의 효능을 결정하기 위해, 우리는 생체 내 생체 및 생체내 생물막 분산을 측정하는 프로토콜을 개발했습니다. 우리는 생물막 관련 만성 상처 감염을 만들기 위하여 잘 기술된 마우스 외과 절개 모형을 이용합니다. 생체 내분산을 모니터링하려면 루시파라제를 표현하는 세균균균으로 상처를 감염시킵니다. 일단 성숙한 감염이 설치되면, 우리는 생물막 EPS의 성분을 저하시키는 효소를 포함하는 용액으로 상처를 관개합니다. 그런 다음 상처 및 여과 기관의 발광 신호의 위치와 강도를 모니터링하여 달성된 분산 수준에 대한 정보를 제공합니다. 생물막 분산증의 전 생체 생체 분석의 경우, 감염된 상처 조직은 생체막 분해 효소 용액에 침수되며, 그 후 박테리아 부하가 조직에 남아 있는 용액의 세균 부하에 비해 평가된다. 두 프로토콜 모두 강점과 약점을 가지고 있으며 분산 치료의 효능을 정확하게 결정하는 데 최적화 될 수 있습니다.

이 실험에서, 8-10 주 된 여성 스위스 웹스터 마우스는 발광 플라스미드 pQF50-lux를 운반 PAO1의 104 CFU에 감염되었다. 전술한 바와 같이, 감염은 PBS(차량 제어) 또는 10% GH(치료)의 3 x 30분 치료를 투여하기 전에 48시간 동안 확립하여 생물막 EPS를 소화하도록 허용하였다. 마우스는 치료 후(0h) 및 10시간 및 20h 의 후 처리 후에 직접 전처리를 이미지하였다. 도 2A 및 보충 도 1은 밝은 생물 발광 신호를 생성하는 상처 침대 내의 확립된 감염을 보여준다. 상처 침대에서 박테리아의 분산은 GH 치료 (0 h) 직후에 시각화 할 수 있지만 PBS 치료 후는 시각화 할 수 없습니다. 그것은 이전 연구에서, 우리는 혈액과 비장의 박테리아를 발견 했다 주목 해야 한다 5 h 게시물 GH 치료7. 기관내 세균성 보급은 <strong class="xf...

여기에서, 우리는 마우스에 있는 상처 감염에서 세균성 분산을 평가하기 위한 ex vivo 및 생체 내 방법을 기술합니다. 이 프로토콜은 국소 항균 및 항 생물막 요법의 효능을 테스트하거나 다른 세균성 균주 또는 종의 분산 용량을 평가하는 데 활용 될 수 있습니다.

Biofilm-related infections are implicated in a wide array of chronic conditions such as non-healing diabetic foot ulcers, chronic sinusitis, reoccurring ...

미생물학자와 전염병 의사는 만성 질환에서 생물막 관련 감염이 얼마나 중요한지 깨닫기 시작했습니다. NIH는 만성 감염의 80% 이상이 세균성 생물막 때문이라고 말했습니다. 그래서 이것은 생물막 문제를 해결하고 생물막 문제를 해결하는 치료법을 개발하는 데 중점을 두라고 촉구했습니다.그리고 그 치료법은 생물막에서 생물막에 있는 세균 세포를 분산시키는 데 초점을 맞추고 있기 때문에 더 쉽게 죽일 수 있습니다. 그러나 실제로 이러한 분산 제의 효능을 결정하는 방법을 다루는 현재 문학에 많은 프로토콜이 없습니다. 그래서 우리는 이것이 사용하기에 좋은 프로토콜이라고 느낍니다.그것은 생물막 관련된 세균성 감염의 한 모형입니다. 그리고 우리는 또한 세균성 종의 많은 다른 모형을 연구하기 위하여 아주 쉽게 최적화될 수 있고, 어떻게 생물막을 형성하고 분산하는지, 뿐만 아니라 다른 분산 에이전트를 공부하기 위하여 아주 쉽게 최적화될 수 있다고 생각합니다. 그리고 우리는 우리가 마우스에서 최적으로 작동을 발견한 에이전트의 납품에 특히 뉘앙스가 있다는 것을 보았기 때문에 비디오 형식으로 이것을 전달하는 것이 중요하다고 생각합니다.시작하려면 발가락 핀치에 의해 마취의 평면을 평가하고 호흡 률과 노력을 모니터링합니다. 등쪽 표면을 면도하고 면도 부위에 10분 간 또는 제품의 지침에 따라 탈필 크림을 바르십시오. 디필 크림을 부드럽게 제거합니다.그리고 피부가 건조한지 확인하십시오. 알코올 방지 마커를 사용하여 뒷면의 후방 영역을 향해 직경 1.5cm의 원을 그립니다. 통증 관리를 위해, 투여할 지역에 피하로 리도카인의 0.05 밀리리터를 투여하십시오.그리고 0.02 밀리리터의 부프레노르핀은 목 덜미에 피하한다. 통증 관리에 도달하려면 10 분 동안 기다립니다. 절제하기 전에 알코올 면봉을 사용하여 소독 표면을 소독하십시오.시술 내내 멸균 수술장을 유지하고, 오토클레이브 기기와 멸균 장갑을 사용하여 오염을 제한합니다. 외과 가위와 함께 판니큘러스 근육의 수준으로 전체 두께 의 흥분 피부 상처를 관리합니다. 절제 후, 반투과성 폴리우레탄 드레싱으로 상처를 즉시 덮습니다.해당되는 경우 두 개의 미세 한 양면으로 드레싱과 백업을 조심스럽게 분리하십시오. 약 10 세균의 제 4 CFU에 약 10, 100 마이크로 리터 PBS 드레싱 아래 와 상처 침대에 감염을 설정 합니다. 참고, 상처는 또한 박테리아 및/또는 곰팡이의 다중 종에 동시에 감염될

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Source: Hunt, A. M. A., et al. Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model. J. Vis. Exp.(2017).This video demonstrates the procedure for assessing infection clearance and healing progression in a wounded diabetic mouse using bioluminescent and microscopic images.

Bioluminescence Imaging to Track Bacterial Infection and Wound Healing in a Mouse Model

이 비디오는 GFP 발현 호중구를 가진 면역 저하 형질전환 마우스의 감염 부위에서 호중구 모집 역학을 연구하기 위한 생체 내 이미징을 보여줍니다. 발광 박테리아를 주입하여 감염을 일으키는 것과 관련이 있습니다. 이는 감염 부위에 호중구가 동원되도록 유도하며, 이미징을 통해 추적이 이루어집니다.

Murine 모델에서 감염 부위의 호중구 모집 역학 및 박테리아 부담 모니터링

이 비디오는 피부 상처 감염의 쥐 모델을 생성하는 기술을 보여줍니다. 호중구에서 형광 단백질을 발현하도록 조작된 쥐를 유전자 변형 생물 발광 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 감염시키면 병원성 박테리아가 발생합니다. 감염 부위의 박테리아 부담과 호중구 동원 역학은 전체 동물 이미징을 사용하여 연구할 수 있습니다.

박테리아 병원체에 대한 면역 반응을 연구하기 위한 쥐 피부 상처 감염 모델

이 비디오는 피하 조직에서 칸디다 알비칸스의 생물막 형성을 연구하기 위한 생체 내 마우스 모델의 개발을 보여줍니다. 이 실험은 생물막 발달을 위해 동물의 등 부위에 칸디다균에 감염된 장치를 이식하는 것을 포함합니다.

칸디다 알비칸스 In Vivo 마우스 모델의 생물막 형성

생리와 병리 설정에서 치료 화합물을 평가하는 데 사용할 수있는 피부 상처 치유의 쥐 모델.

상처 치유의 생쥐 모델

마우스 피하 모델에서 칸디다 알비칸스 생물막 발달의 실험적 절차를 제시합니다. 진균 생물막은 군집 형성 단위의 수를 결정하고 생성되는 빛의 양이 생존 가능한 세포의 수와 일치하는 비침습적 생물 발광 이미징에 의해 정량화되었습니다.

생물 발광 영상에 이어 마우스 피하 모델의 의학 관련 외국 기관에 칸디다 알비 칸스 (Candida albicans)에 바이오 필름 ​​개발

여기는 실시간, 비-침략 적, 발광 녹 농 균의 biofilm 상처 감염의 모니터링을 위한 털 쥐를 활용 하 여 새로운 당뇨병 murine 모델에 설명 합니다. 이 메서드는 다른 세균성 종 및 다 종 biofilms를 포함 하 여 유전자 변형된 미생물의 감염을 평가 하 고 antibiofilm 전략의 효능 테스트에 적용할 수 있습니다.

라이트 사이드에와 서: Vivo에서 당뇨병 털 Murine 모델에 만성 상처에서 녹 농 균 Biofilm 감염의 모니터링

우리는 면역 적격 마우스에서 만성 상처 감염을 생성하기위한 지연 접종 프로토콜을 설명합니다.

만성 슈도모나스 녹농증 상처 감염의 지연 접종 모델

항생제에 내성이 있는 만성 상처는 의료 시스템에 큰 위협이 됩니다. 생물막 감염은 완고하고 적대적이며 기능적 상처 봉합 부족을 유발할 수 있습니다. 우리는 생물막에 감염된 전층 만성 상처의 임상적으로 관련된 돼지 모델을 보고합니다. 이 모델은 기계론적 연구뿐만 아니라 중재 테스트에도 강력합니다.

생물막 감염 및 보이지 않는 상처의 돼지 모델

이 프로토콜은 단일 마우스 내에서 동일한 조건에서 박테리아가 있는 두 개의 임플란트를 동시에 배양할 수 있는 임플란트 관련 감염에 대한 고유한 실험 모델을 설명합니다. 또한 최적화된 비교 분석 방법을 사용하여 임플란트 표면의 생물막 형성을 정밀하게 평가할 수 있으며, 생체 재료의 항균 특성을 평가하기 위한 고급 기술을 입증합니다.

피하 농양에서 외과용 임플란트의 생물막 형성에 대한 정량적 평가를 위한 고유한 마우스 모델

학습하세요 뮤린 상처 모델에서 생물막 분산 효율을 평가하는 방법을. 효소 처리와 생체 내외 분석을 통해 항생제 효능 향상 및 면역 청소 개선을 위한 새로운 치료법 개발에 활용할 수 있습니다.

뮤린 상처에서 생물막 분산 평가

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