Name: 에코HIV 뇌 감염의 쥐 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: 배우세요 EcoHIV를 이용한 쥐 뇌 감염 모델 수립 방법으로, HIV 관련 신경인지장애(HAND) 및 약물 남용 공병증 연구에 활용합니다. 스테레오택식 주사와 바이러스 농축 기술을 통해 미세아교세포 표적 감염 및 신경행동 변화를 분석합니다.

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이 작품은 NIH 보조금 HD043680, MH106392, DA013137 및 NS100624에 의해 지원되었다.

모든 동물 프로토콜은 사우스 캐롤라이나 대학의 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다 (연방 보증 번호 : D16-00028). 6 명의 성인 남성 F344 /N 쥐는 12/12 빛 아래 통제 된 환경에 수용 되었습니다: 음식과 물에 광고 리비툼 액세스 와 어두운 주기. 모든 동물은 실험실 동물의 치료 및 사용에 대한 가이드에서 건강의 국립 연구소에 의해 설립 된 지침을 사용하여 돌보았습니다.
1. 293 FT 셀의 바이러스 포장
<ol><li>DMEM을 가진 75cm2 플라스크를 코팅한 젤라틴293 FT 셀(5×10 5/mL)을 배양하고 10% FBS11을갖는다. 37°C에서 세포를 50% 수축시 로 성장시다.</li>
	<li>1.5mL 마이크로 원심분리기 관및 3s의 소용돌이에서 중간(예: Opti-MEM)의 750 μL에서 22.5 μL의 형질 전환 시약(예: 리포펙타민 3000)을 희석시희석한다.</li>
	<li>에코HIV 플라스미드 DNA 의 20 μg를 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에 750 μL의 배지를 희석하고 잘 섞는다.</li>
	<li>희석된 DNA를 희석된 트랜스페션 시약의 튜브에 넣고 부드럽게 섞습니다. 실온에서 15분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>혼합물을 75cm2 플라스크에 미리 데워진 DMEM 배지의 10mL에 첨가한다. 37°C에서 2일 동안 세포를 배양한다.</li>
	<li>포장 된 렌즈 바이러스를 포함하는 두 플라스크에서 조건부 배지24 mL을 수확하고 결합하십시오.</li>
	<li>원심분리기는 4°C에서 10분 동안 500 x g에서 조건부 배지 의 24mL 을 모두 분리합니다. 멸균 50 mL 튜브에 명확한 상체를 전송합니다.</li>
	<li>렌티-x 농축기 8mL과 24mL의 명확한 상류체(1:3 비율)를 결합합니다. 부드러운 반전으로 섞으세요. 2 일 동안 4 °C에서 혼합물을 배양하십시오.</li>
	<li>원심분리기 혼합물은 4°C에서 45분간 1,500 x g에서 혼합물을 혼합합니다. 상체를 조심스럽게 제거합니다.</li>
	<li>100mM PBS의 100 μL로 펠릿을 부드럽게 다시 일시 중단합니다.</li>
	<li>p24 ELISA 키트를 가진 티터 바이러스 농도.</li>
</ol>2. 에코 HIV-EGFP 바이러스 스테레오탁스 수술
<ol><li>3% 세보플루란을 사용하여 쥐를 마취합니다. 쥐가 유해 자극에 반응하지 않고 반사 신경이 없을 때 2.2 단계로 진행하십시오.</li>
	<li>뇌 부위의 머리카락을 면도하고 70%에탄올과 클로르헨시딘 기반 스크럽으로 피부를 두 번 살균합니다. 스테레오탁스 장치에서 쥐를 수적으로 고정한다.</li>
	<li>두피 미드라인을 따라 피부를 통해 절개(5-6cm)를 만듭니다.</li>
	<li>2개의 드릴링 위치를 0.8mm 측면, 1.2mm 로스트럴에서 브레그마까지 표시하십시오. 각 두개골 위치에 구멍(직경 0.4mm)을 드릴링합니다.</li>
	<li>10 μL 주사 주사기에 titered EcoHIV 렌즈티바이러스 용액 (1.04 × 106 TU / mL)을 채웁니다. 주사기를 스테레오탁스 장치에 고정시하십시오.</li>
	<li>드릴링 구멍의 표면에 가까운 바늘아래로 이동합니다. 깊이 2.5mm를 측정하고 이동합니다.</li>
	<li>0.2 μL/min의 속도로 바이러스 용액 1 μL을 주입합니다. 주사 부위 내부에 바늘을 5 분 동안 보관하십시오. 쥐 두개골 바깥에 들 때까지 바늘을 천천히 위로 움직입니다.</li>
	<li>4-0 실크 실로 피부를 봉합합니다.</li>
	<li>한 번 70 %에탄올로 절개를 살균. 피하 부토르페놀 (도롤렉스, 0.1 mg/kg 체중)을 피하하십시오.</li>
	<li>쥐가 깨어날 때까지 가열 패드가있는 복구 챔버로 전송합니다.</li>
</ol>3. 뇌 섹션의 시각화
참고: EcoHIV 바이러스 주입 후 1~8주 동안 기다립니다.
<ol><li>쥐를 5% 세보플루아네로 마취한다. 쥐가 유해 자극에 반응하지 않고 반사 신경이 없을 때 3.2 단계를 계속합니다.</li>
	<li>연기 후드 내부의 척추 위치에 쥐를 고정합니다.</li>
	<li>흉부 미드 라인을 따라 피부를 절개합니다. 다이어프램을 자르고 흉부 구멍을 엽니다.</li>
	<li>20 G × 25mm 바늘을 왼쪽 심실에 삽입합니다.</li>
	<li>가위로 오른쪽 아트리움을 즉시 엽니다.</li>
	<li>5mL/분 의 속도로 사전 냉각 된 100 mM PBS의 50 mL을 perfuse.</li>
	<li>5 mL /분의 속도로 감기 4 % 파라 포름 알데히드의 100 mL을 Perfuse.</li>
	<li>쥐를 참수, 두피를 열고 뇌를 제거.</li>
	<li>포식알데히드 4%로 하룻밤 사이에 포스트픽스.</li>
	<li>뇌가 바닥까지 떠날 때까지 50mL 튜브에서 100mM PBS에서 30% 자당30%의 40mL로 뇌를 옮기십시오(약 3일).</li>
	<li>스냅에서 2 분 동안 메틸 부타놀에서 뇌를 동결 - 80 °C.</li>
	<li>-20°C 극저온 내부의 금속 플랫폼에서 뇌 조직을 확보하십시오.</li>
	<li>저온을 사용하여 50 μm 두께의 관상 섹션을 잘라냅니다.</li>
	<li>미세 브러시로 뇌 슬라이스를 유리 슬라이드에 옮기십시오.</li>
	<li>0.3mL의 안티페이드 배지에 단면을 장착하고 22mm 50mm 커버립으로 커버합니다.</li>
	<li>유리 슬라이드를 실온에서 건조할 때까지 어둡게 유지합니다.</li>
	<li>뇌 영역 경계와 뉴런의 형태학적 특성을 기반으로 Z 스택을 사용하여 공초점 현미경으로 표적 뉴런을 이미지합니다. 참고: 사용된 공초점 현미경 설정은 488 nm의 파장을 사용하여 60 X (A/1.4, 오일)와 0.15 μm (핀홀 크기 30 μm, 백 투영 핀홀 반경 167 nm)의 Z 평면 간격이었습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Illenberger, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+Infection+and+Neurocognitive+Disorders+in+the+Context+of+Chronic+Drug+Abuse%3A+Evidence+for+Divergent+Findings+Dependent+upon+Prior+Drug+History%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmune+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">HIV Infection and Neurocognitive Disorders in the Context of Chronic Drug Abuse: Evidence for Divergent Findings Dependent upon Prior Drug History.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 15 (4), 715-728 (2020).</li>
<li>Joseph, S. B., Swanstrom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+HIV-1+entry+phenotypes+as+a+guide+to+changing+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">The evolution of HIV-1 entry phenotypes as a guide to changing target cells.</a> Journal of Leukocyte Biology. 103 (3), 421-431 (2018).</li>
<li>Potash, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+study+of+systemic+HIV-1+infection%2C+antiviral+immune+responses%2C+and+neuroinvasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A mouse model for study of systemic HIV-1 infection, antiviral immune responses, and neuroinvasiveness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (10), 3760-3765 (2005).</li>
<li>Albritton, L. M., Tseng, L., Scadden, D., Cunningham, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+putative+murine+ecotropic+retrovirus+receptor+gene+encodes+a+multiple+membrane-spanning+protein+and+confers+susceptibility+to+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A putative murine ecotropic retrovirus receptor gene encodes a multiple membrane-spanning protein and confers susceptibility to virus infection.</a> Cell. 57, 659-666 (1989).</li>
<li>Geraghty, P., Hadas, E., Kim, B. H., Dabo, A. J., Volsky, D. J., Foronjy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+infection+model+of+chronic+obstructive+pulmonary+disease+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">HIV infection model of chronic obstructive pulmonary disease in mice.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (4), 500-509 (2017).</li>
<li>Gu, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EcoHIV+infection+of+mice+establishes+latent+viral+reservoirs+in+T+cells+and+active+viral+reservoirs+in+macrophages+that+are+sufficient+for+induction+of+neurocognitive+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">EcoHIV infection of mice establishes latent viral reservoirs in T cells and active viral reservoirs in macrophages that are sufficient for induction of neurocognitive impairment.</a> PLoS Pathogens. 14 (6), 1007061(2018).</li>
<li>Ellenbroek, B., Youn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+in+neuroscience+research%3A+is+it+a+rat+race%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models%2C+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Rodent models in neuroscience research: is it a rat race.</a> Disease Models, Mechanisms. 9 (10), 1079-1087 (2016).</li>
<li>Feduccia, A. A., Duvauchelle, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+apparatus+and+method+for+drug+reinforcement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Novel apparatus and method for drug reinforcement.</a> Journal of Visualized Experiments. (42), e1998(2010).</li>
<li>Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Harrod, S. B., Moran, L. M., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+proteins+dysregulate+motivational+processes+and+dopamine+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">HIV-1 proteins dysregulate motivational processes and dopamine circuitry.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7869(2018).</li>
<li>McGaughy, J., Sarter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+vigilance+in+rats%3A+task+validation+and+effects+of+age%2C+amphetamine%2C+and+benzodiazepine+receptor+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Behavioral vigilance in rats: task validation and effects of age, amphetamine, and benzodiazepine receptor ligands.</a> Psychopharmacology. 117 (3), Berl. 340-357 (1995).</li>
<li>Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+filamentous+actin+%28F-actin%29+puncta+in+rat+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Quantification of filamentous actin (F-actin) puncta in rat cortical neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), (2016).</li>
<li>McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Timing%3A+NeuroHIV+Progression+in+the+Post-cART+Era%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era.</a> Scientific Reports. 9 (1), 827(2019).</li>
<li>McLaurin, K. A., Moran, L. M., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Power+of+Interstimulus+Interval+for+the+Assessment+of+Temporal+Processing+in+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The Power of Interstimulus Interval for the Assessment of Temporal Processing in Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), e58659(2019).</li>
<li>Li, H., McLaurin, K. A., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ballistic+Labeling+of+Pyramidal+Neurons+in+Brain+Slices+and+in+Primary+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (158), (2020).</li>
<li>Ko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+but+not+Astrocytes+Harbor+HIV+DNA+in+the+Brains+of+HIV-1-Infected+Aviremic+Individuals+on+Suppressive+Antiretroviral+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmune+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Macrophages but not Astrocytes Harbor HIV DNA in the Brains of HIV-1-Infected Aviremic Individuals on Suppressive Antiretroviral Therapy.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 110-119 (2019).</li>
<li>Sopper, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+simian+immunodeficiency+virus+infection+in+vitro+and+in+vivo+on+the+cytokine+production+of+isolated+microglia+and+peripheral+macrophages+from+rhesus+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The effect of simian immunodeficiency virus infection in vitro and in vivo on the cytokine production of isolated microglia and peripheral macrophages from rhesus monkey.</a> Virology. 220 (2), 320-329 (1996).</li>
<li>Llewellyn, G. N., Alvarez-Carbonell, D., Chateau, M., Karn, J., Cannon, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+infection+of+microglial+cells+in+a+reconstituted+humanized+mouse+model+and+identification+of+compounds+that+selectively+reverse+HIV+latency%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+NeuroVirology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 infection of microglial cells in a reconstituted humanized mouse model and identification of compounds that selectively reverse HIV latency.</a> Journal of NeuroVirology. 24 (2), 192-203 (2018).</li>
</ol>

어떤 저자도 선언할 이해 상충이 없습니다.

이 프로토콜에서, 우리는 쥐에 있는 EcoHIV 유도한 HIV 감염 모형을 설치했습니다. 구체적으로, 우리는 성공적으로 쥐 뇌에서 활성 HIV 감염을 유도 피질에 에코 HIV의 양측 스테레오테스테레오테시 주입을 설명 7 주사 후 일. Futhermore, 우리는 쥐에 있는 EcoHIV 감염이 HAND의 중요한 양상을 공부하는 좋은 생물학 시스템이 될 수 있었다는 것을 보여줍니다. 8 주 후- EcoHIV 감염, 쥐는 중요한 신경 인지 장애를 전시, 이는 NAc의 MSN에서 시간 적 처리 및 시 냅 스 기능 장애의 변화를 포함. neuroHIV 및 HAND2연구를 위한 동물 모델의 중요성을 감안할 때, 새로운 생물학적 시스템의 발달은 현장 내의 새로운 질문을 해결하는 데 유리할 수 있습니다. 칼륨 외3 먼저 마우스에서 활성 HIV-1 감염을 유도하기 위해 에코 HIV의 사용을보고했다. 구체적으로, 마우스는 테일 정맥<sup class="xref"...

생물학적 시스템은 HIV-1 관련 신경인지 장애(HAND)와 그 근본적인 신경 메커니즘2에대한 우리의 이해를 향상시켰습니다. 어떤 생물학적 시스템이 어떤 연구에 가장 적합한지 결정하는 것은 종종 관심2의문제에 달려 있습니다. 숙주 동물 모델의 범위의 제한은 HIV-1 질병 발달의 연구에 도전합니다. HIV-1 바이러스 복제 및 병인을 조사하기 위해, Potash 외3은 활성 HIV-1 감염의 마우스 모델을 생성하여 HIV 표면 봉투 당단백질, gp120의 코딩 영역을 에코트로픽 MLV gp80으로 대체하여 마우스4에서성공적인 바이러스 복제를 이끌어 냈다. 키메라 HIV(EcoHIV) 마우스에서 꼬리 정맥 주사 후, HIV-1 혈청 양성 개인(예를 들어, 감염된 림프구 및 대식세포, 항바이러스 면역 반응, 염증3,5,6)과유사한 많은 특성이 관찰되었다.
마우스와 쥐는 모두 무리대의 구성원이지만, 근본적인 종 차이는 특정 실험 질문에 대한 적합성에 영향을 미칠 수 있습니다7. 따라서, 쥐에 에코 HIV 감염 모델의 확장 (일반적으로 약물 남용 및 신경 인지 장애의 연구에 사용) neuroHIV의 연구에서 유리 할 것 이다. 예를 들어, 그들의 큰 크기는 약물 자가 투여 절차에 대한 경정맥 카테터 이식을 보다 실용적으로8. 쥐의 약물 자가 투여 기술은 HIV-19의동기 부여를 평가하기 위해 활용되었습니다. 또한, 많은 신경 인지/행동 작업은 처음에 쥐를 위해 설계 되었다10. 여기에서, 우리는 EcoHIV 감염 모형을 확장하고 neuroHIV 및 HAND와 관련있는 새로운 질문을 해결하기 위하여 중요한 기회를 마련하기 위하여 쥐에 있는 EcoHIV의 입체 주사의 활용을 보고합니다.

<table><tbody><tr><td>293FT 세포</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R70007</td><td></td></tr><tr><td>항생제-항진균 용액</td><td>Cellgro</td><td>30004CI</td><td>100X</td></tr><tr><td>Corning BioCoatGelatin 75cm&sup2; 통풍 캡이 있는 직사각형 경사형 목 세포 배양 플라스크</td><td>Life Technologies</td><td>354488</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민, 4.5g/L 포도당 및 피루브산 나트륨이 포함된 Corning DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>10013CV</td><td></td></tr><tr><td>커버 유리</td><td>VWR</td><td>637-137</td><td></td></tr><tr><td>드릴</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 펜치</td><td>월드 정밀 기기</td><td>14097</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Snap-Cap 마이크로 원심분리기 Biopur Safe-Lock 튜브</td><td>Life Technologies</td><td>22600028</td><td></td></tr><tr><td>Ethicon Vicryl Plus 항균, 4-0 Polyglactin 910 봉합사, 27in. FS-2</td><td>Med Vet International</td><td>VCP422H</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 주사기</td><td>Hamilton</td><td>1701</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Lipofectamine 3000 Transfection 시약</td><td>Life Technologies</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>Iris Junps</td><td>World Precision Instruments</td><td>15914</td><td></td></tr><tr><td>Iris Scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>500216</td><td></td></tr><tr><td>렌티바이러스 관련 p24 ELISA 키트</td><td>Cell Biolabs, inc.</td><td>VPK-107-5</td><td></td></tr><tr><td>Lenti-X 농축기</td><td>Takara</td><td>PT4421-2</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I 감소 혈청 매체</td><td>생명 기술</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히</td><td>드 시그마-알드리치</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Sevoflurane</td><td>Merritt 수의학 공급</td><td>347075</td><td></td></tr><tr><td>입체 운동 장치</td><td>Kopf Instruments</td><td>모델 900</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-154%</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 가위</td><td>세계 정밀 기기</td><td>500086</td><td></td></tr></tbody></table>

에코hiv 뇌 감염의 쥐 모델

A Rat Model of EcoHIV Brain Infection

EcoHIV 감염 마우스 모델은 HIV 관련 신경 학적 합병증을 조사하는 데 중요한 유틸리티라는 것을 잘 연구되었습니다. 약물 남용 및 신경 인지 장애의 연구에 대 한 EcoHIV 감염 된 쥐 모델의 설립, neuroHIV와 HIV-1 관련 된 신경 인지 장애의 연구에 도움이 될 것 이다 (HAND). 본 연구에서는, 우리는 키메라 HIV (EcoHIV)를 사용하여 활성 HIV 감염의 쥐 모델의 성공적인 생성을 보여줍니다. 첫째, 에코HIV의 렌티바이러스 구조는 48시간 동안 배양된 293FT 세포로 포장되었다. 이어서, 조건부 배지는 농축되고 흐트러졌다. 다음으로, 우리는 F344/N 쥐 뇌 조직에 EcoHIV-EGFP의 양측 스테레오택시 주사를 수행했습니다. 감염 후 1주일 후, EGFP 형광 신호가 감염된 뇌 조직에서 검출되어 EcoHIV가 쥐에서 활성 HIV 감염을 성공적으로 유발한다는 것을 나타냅니다. 또한, 마이크로글리아세포 마커인 Iba1에 대한 면역염색이 수행되었다. 결과는 microglia가 EcoHIV를 품고 있는 우세한 세포 모형이었다는 것을 표시했습니다. 더욱이, EcoHIV 쥐는 감염 후 8 주 동안 HAND의 잠재적 기본 신경 행동 메커니즘뿐만 아니라 시간 적 처리에 변화를 나타냈다. 종합적으로, 본 연구는 뇌의 HIV-1 바이러스 저장소뿐만 아니라 HAND 및 약물 남용과 같은 관련 comorbidities를 연구하는 귀중한 생물학적 시스템을 제공하는 쥐에 HIV-1 감염의 EcoHIV 모델을 확장합니다.

조건부 배지는 293FT 세포에 감염된 EcoHIV-EGFP의 렌티바이러스로부터 수집되었다. 다음으로, 그것은 집중 하 고 titered, 다음 스테레오로 뇌에 주입 (피 질 영역) F344/N 쥐의. 7일 후 주사 후, 쥐를 희생하고 브레그마 -4.68 mm에 이르는 관상 동맥 뇌 슬라이스에서 촬영되었다. 도 1A에서,특히 피질과 해마 규명 자이루스에서 뇌 전체에 걸쳐 중요한 EcoHIV-EGFP 신호가 있습니다. 더욱이, 이바1and EcoHIV-EGFP 프로브를 통한 이중 라벨링은 마이크로글리아가 뇌에서 에코HIV 발현을 수용하는 우세한 세포 유형이었다는 강력한 증거를제공했다(도 1B). 특히, EcoHIV-EGFP의 분포 패턴은 쥐 뇌의 미세리아의 상대적인 지역 농도(즉, 해마의 피질 및 전염자)와 일치합니다.
후속 연구에서, 우리는 HAND의 주요 측면을 모델링하기...

여기에서, 우리는 키메라 HIV (EcoHIV)를 사용하여 활성 HIV 감염의 새로운 쥐 모형을 설치하는 프로토콜을 제시합니다, 두뇌에 있는 HIV-1 바이러스 성 저수지의 우리의 이해를 강화하고 HIV 관련 신경 인지 장애 및 관련 comorbidities를 공부하는 시스템을 제공하는 것을 위해 중요합니다 (즉, 약물 남용).

에코HIV 뇌 감염의 쥐 모델

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. ...

쥐를 사용하여, 이 프로토콜은 키메라 HIV를 사용하여 활성 HIV 감염의 새로운 모형을 확립하기 위하여 이용될 수 있습니다. 쥐와 함께, 약물 남용 및 신경 인지 장애의 연구에 대 한 EcoHIV 감염 모델의 설립 신경 HIV와 HIV-1 관련 된 신경 인지 장애의 연구에 도움이 될 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 연구 동료 인 하이롱 리 (Hailong Li)가 될 것입니다.293 T 세포로 바이러스의 포장을 위해, DMEM의 밀리리터 당 다섯 번째 293 T 세포에 5 번 10 을 종자 10% FBS로 보충 두 젤라틴 코팅 75 평방 센티미터 플라스크와 배양이 도달 할 때까지 섭씨 37도에서 세포를 배양하 50% 수렴성. 트랜스펙트 당일, 플라스크당 750마이크로리터의 미약재 22.5마이크로리터를 1.5밀리리터 마이크로센트심분리기 튜브로 희석하고 3초 동안 용액을 소용돌이시다. 플라스크당 1.5 밀리리터 마이크로센심분리기 튜브에 750마이크로리터의 키메라 에코HIV 플라스미드 DNA 20마이크로그램을 철저한 혼합으로 희석시킵니다.희석된 DNA와 희석된 형질 전환 시약을 부드러운 혼합과 결합하고 실온에서 15분 동안 생성된 용액을 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, prewarm DMEM 배지의 10 밀리리터에 각 바이러스 현탁액을 추가하고 293 T 세포의 한 플라스크에 각 바이러스 보충 솔루션을 추가합니다. 세포 배양 이틀 후, 원심분리를 위해 플라스크에서 상체를 풀고 명확한 상체를 새로운 50 밀리리터 튜브로 옮긴다.렌티-X 농축기 8밀리리터를 명확히 된 상체에 넣고 부드러운 반전과 섞으세요. 섭씨 4도에서 2일 간 배양한 후 혼합물을 원심분리하고 상체를 조심스럽게 제거한 다음, 100밀리머 PBS의 100 마이크로리터로 펠릿을 부드럽게 재연하고 P24 ELISA 키트를 사용하여 바이러스 농도를 자극합니다. EcoHIV-EGFP 주사의 경우 페달 반사에 대한 반응부족을 확인한 후 뇌 부위에서 모발을 면도하고 노출된 피부를 70%에탄올과 클로르헨시딘 기반 스크럽으로 두 번 살균합니다.스테레오탁스 장치에서 쥐를 수습된 자세로 고정하고 두피 미드라인을 따라 피부를 통해 5~6센티미터 절개를 합니다. 1개의 드릴링 위치를 측면 0.8밀리미터, 1.2밀리미터 로스트랄로 표시하여 각 두개골 위치에서 직경 0.4mm의 구멍을 뚫습니다. 10 마이크로리터 주사 주사기에 titered EcoHIV Lentivirus 용액의 밀리리터 당 1.04 배 10 ~ 여섯 번째 트랜스듀싱 유닛을 로드하고 스테레오탁스 장치에 주사기를 고정시킵니다.바늘을 하나의 드릴링 구멍의 표면에 가깝게 이동하고 구멍에 바늘 2.5 밀리리터를 삽입합니다. 분당 0.2 마이크로리터의 바이러스 속도로 하나의 마이크로리터의 바이러스 용액을 주입합니다. 모든 바이러스가 주입되었을 때, 쥐 두개골 이밖에있을 때까지 천천히 바늘을 철회하기 전에 5 분 동안 주사 영역 내부에 바늘을 둡니다.4-0 실크 실 봉합사로 피부 절개를 닫고 70 %에탄올로 용액을 살균 한 다음 쥐를 가열 패드에 놓고 방수까지 모니터링하십시오. 바이러스 주입 후 1~8주 후, 페달 반사에 대한 반응이 부족하다는 것을 확인한 후, 연기 후드 내부의 척추 자세로 쥐를 고정하고 흉부 미드라인을 따라 피부를 절개합니다. 격막을 잘라 흉부 구멍을 열고 왼쪽 심실에 20 게이지를 삽입합니다.즉시 가위로 오른쪽 아트리움을 열고 분당 5 밀리리터로 미리 냉각된 100 밀리리터 PBS의 50밀리리터를 견딜 수 있습니다. 모든 PBS가 전달되면 100 밀리리터의 차가운 4 % 파라 포름알데히드가 제공됩니다. 모든 고정이 전달되면 두개골에서 뇌를 제거하고 신선한 4 %의 파라 포름 알데히드에서 하룻밤 조직을 수정합니다.다음 날 아침, 뇌가 메틸 부타놀에서 뇌 조직을 영하 80도에서 2분 동안 동결하기 전에 약 3일 동안 50 밀리리터 튜브에 100 밀리미터 PBS의 30%의 30%의 자당40밀리리터에 샘플을 놓습니다. 동결 후 영하 20도의 냉동 저온과 미세 한 페인트 브러시를 사용하여 50 미크론 두께의 관상 섹션을 획득하십시오. 모든 단면을 얻을 때, 300 마이크로리터의 페이드 방지 매체로 샘플을 덮고 22 50 밀리리터 커버립으로 장착하십시오.매체가 건조되면, 공초점 현미경검사법에 의해 단면을 이미지. 렌티바이러스 주입 후 7일 후, 쥐 관상 동맥 뇌 슬라이스 이미지는 뇌 조직 전반에 걸쳐 EcoHIV-EGFP 신호의 상당한 존재를 드러냅니다, 특히 피질과 해마 의 장축 자이루스 내에서. 이중 라벨링 및 이바1 및 EcoHIV-EGFP 프로브는 마이크로글리아가 뇌에서 에코HIV 발현을 수용하는 주요 세포 유형이라는 강력한 증거를 제공합니다.8 주 감염 후, EcoHIV 주입 동물은 식염수 대조군에 비해 상대적으로 아첨 간격 기능에 의해 입증 된 바와 같이 상호 자극 간격의 조작에 상대적 무감각을 나타낸다. 또한, EcoHIV 주입 쥐는 대조동물에 비해 머리와 목 직경이 증가하는 짧은 수지상 척추의 상대적 빈도증가에 의해 입증된 바와 같이 수지상 척추 형태에 심오한 변화를 표시합니다. 스테레오탁스 주입 전에 조건 매체의 농도 및 적정은 실험 전반에 걸쳐 일관되고 복제 가능한 결과를 보장하는 데 중요합니다.EcoHIV의 이 특정 지역 입체 주사는 두뇌 내의 능률적인 HIV 감염을 제공하고 쥐에 있는 시간 적 처리 적자를 일으킵니다. 에코 HIV 감염 모델을 확장 하기 위해 쥐에 스테레오 탁스 HIV 주사의 활용은 손에 신경 HIV와 관련 된 새로운 질문을 해결 하기 위한 중요 한 기회를 제공.

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

hypoxic - 허혈성 뇌 손상에 대한 출생 후의 쥐 모델은 인간의 신생아 hypoxic 허혈성 뇌증 (히에)의 잘 설립 모델입니다. 이 문서에서는, 우리는 포스트 나탈 쥐 새끼의 히에의 모델을 설명합니다.

Perinatal 국소 빈혈의 Hypoxic 허혈성 뇌증 모델

이 비디오는 키메라 HIV 바이러스를 쥐의 뇌 피질에 주입하는 절차를 보여주며, 여기서 바이러스 RNA는 숙주 게놈에 통합되고 복제 및 확산되어 실험 모델에서 활성 HIV 감염을 확립합니다.

쥐 모델에서 활동성 HIV 감염 확립

Encephalopathy of prematurity는 조산으로 인한 손상과 관련된 중추 신경계 이상을 포함합니다. 이 보고서는 융모막염을 모방한 자궁 내 일시적인 전신 저산소증-허혈 및 양수 내 지질다당류 투여(LPS)에 대한 임상적으로 관련된 쥐 모델, 그리고 감염 자극 및 태반 관류 부족이 CNS 발달에 미치는 관련 영향을 설명합니다.

미숙아의 모델링 뇌증은 흰쥐의 내부 - 양수 리포 폴리 사카 라이드와 태아 저산소증 - 허혈을 사용하여

여기에 제시 된 프로토콜은 성인 남성 다크 아구티 쥐에서 두 피질 반구의 광범위한 회색 물질 탈모의 재현을 허용합니다. 상기 방법은 카테터의 인트레이스레브레인 이식, 골엘린 올리고드로시테 당단백질에 대한 임상 접종, 이식된 카테터를 통한 프로염증성 사이토카인 혼합물의 인트레이스레브렐 주입을 포함한다.

프로 염증 성 사이토카인의 인트레이스렐 주입에 의해 유도된 광범위한 대뇌 피질 탈량의 쥐 모델

여기에서, 우리는 신경병의 발달을 표시하기 위하여 중추 신경계 감염의 면역적격 ICR (암 연구 연구소) 뮤린 모형을 만들기위한 프로토콜을 제시합니다. 동일한 질병 점수에 의한 급성 바이러스 성 뇌질환 모니터링은 생체 내에서 뎅기열 바이러스 유발 신경병증을 나타내는 데 수행될 수 있었다.

뎅기열 바이러스 유발 급성 바이러스 뇌염 같은 질병의 뮤린 모델

이 연구의 목적은 1-90 후 중뇌 동맥 폐색 / 재관류 (MCAO / R) 후 뇌 경색 및 감각 운동 기능을 테스트하여 뇌 허혈의 회복 및 후유부단계에서 연구를위한 동물 모델을 확립하고 검증하는 것입니다. 쥐에서 일.

쥐에서 급성 뇌졸중 후 뇌 회복을 평가하는 전임상 모델

여기서 우리는 손상되지 않은 뇌 구조의 일환으로 표적 분자의 보기를 허용하는 소수성 조직 청산 방법을 제시합니다. 이 기술은 지금 F344/N 통제 및 두 남녀의 HIV-1 형질전환 쥐를 위해 검증되었습니다.

쥐 뇌 조직을 위한 소수성 조직 청산 방법

신생아 쥐에서 출혈후 미숙수두증(PHHP)을 융모양막염과 뇌실내 출혈을 결합하여 모델링할 수 있습니다. 이러한 산전 및 산후 사건의 조합은 대두증, 심실 비대증 및 두개내압 상승을 포함한 PHP의 임상적 특징을 수명 전반에 걸쳐 정확하게 요약합니다.

Modeling Posthemorrhagic Hydrocephalus of Prematurity in Rats

이 프로토콜은 EcoHIV 감염과 Tmem119-EGFP 마우스의 조합이 HIV 관련 신경인지 장애의 설치류 모델에서 미세아교세포 변형 및 바이러스 저장소를 조사하기 위한 귀중한 생물학적 시스템을 제공하는 방법을 설명합니다.

Microglia-Manipulated Transgenic Mice에서 EcoHIV 감염 세포 식별

이 기사는 조증과 같은 행동과 우울증과 같은 행동을 모두 포착하는 양극성 장애의 독특한 쥐 모델을 유도하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

양극성 장애에 대한 쥐 모델 개발

배우세요 EcoHIV를 이용한 쥐 뇌 감염 모델 수립 방법으로, HIV 관련 신경인지장애(HAND) 및 약물 남용 공병증 연구에 활용합니다. 스테레오택식 주사와 바이러스 농축 기술을 통해 미세아교세포 표적 감염 및 신경행동 변화를 분석합니다.

에코HIV 뇌 감염의 쥐 모델

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