Name: 전이율을 제어하는 절단을 가진 신제닉 직소 성 골육종 스프라그 Dawley 쥐 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: 학습하세요 Sprague-Dawley 쥐를 이용한 골육종 동종이식 모델에서 절단을 통한 전이율 제어 방법을. 정맥 내 약물 전달 및 면역세포 침윤 분석이 가능한 이 플랫폼은 항암 치료제 개발 연구에 활용됩니다.

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국립 암 연구소를 통해 NIH 자금 지원, 보조금 # CA228582. 이시야마 순은 현재 도레이 메디컬(주)으로부터 보조금을 받고 있습니다.

쥐와 관련된 모든 절차와 실험은 존스 홉킨스 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 수행되었다.
1. SD 쥐 OS 세포주 UMR-106 세포 배양 프로토콜
<ol><li>DMEM에서 세포를 성장, 10% (v/v) FBS, 페니실린 (10 U/mL)-연쇄 절제술 (10 U/mL) 37°C에서 가습 5% CO2 대기. 2-812의구절을 가진 세포를 사용하여 실험을 수행합니다.</li>
</ol>2. OS 셀 프로토콜의 내적 주입
참고: 시간 제고 임신 한 SD 쥐는 동물 시설에서 출산하고 3 주에, 쓰레기가 사용됩니다 (UMR 106 세포주는 SD 쥐에 합성되기 때문에, 조사가 필요하지 않습니다).
<ol><li>유도<ol>
<li>중간 크기의 유도 챔버에 쥐를 놓고 2 %-3 %의 이소플루란으로 마취를 유도합니다. 발가락 핀치, 호흡 속도 및 문자에 반사하여 마취의 깊이를 지속적으로 모니터링합니다.</li>
		<li>코를 노세콘에 삽입합니다. 필요한 경우 테이프로 고정하십시오.</li>
		<li>오른쪽 다리의 머리카락을 복부까지 제거하고 등쪽 하복부를 클리퍼로 제거하거나 탈필제를 사용하십시오. 쥐를 척추 위치에 놓습니다.</li>
		<li>수술 부위를 70% 에탄올을 사용하여 무균으로 스크럽하고 클로르헨시딘 아세테이트를 희석하거나 베타딘을 희석시하십시오. 무릎 의 영역 주위에 시작하고 근교와 dismally 모두 원형 모션으로 스크럽. 이 단계를 세 번 반복합니다. 어떤 커튼종양 이식에 사용 되지 않습니다.</li>
		<li>마취로 인한 각막 탈수를 방지하기 위해 쥐의 양쪽 눈에 눈 윤활제를 적용하십시오. 쥐를 낮은 열 세팅 가열 패드에 놓습니다. 쥐가 정상 체온(37°C)과 정상 호흡속도를 가지고 있는지 확인합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>외과<ol>
<li>이소플루란을 ~1.5%-2%에서 켭니다(유지 보수용). 동물이 발가락 핀치 반사의 부족을 통해 마취의 적절한 평면에 있는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 이소플루란 비율을 2.5%로 늘립니다.</li>
		<li>멸균 바늘(약 22G)을 팁으로부터 10mm로 표시하여 삽입할 깊이를 안내합니다.</li>
		<li>바늘을 경골 고원의 중간에 구부러진 무릎을 입력하여 경골의 diaphysis에 10mm 아래로 삽입하고, 경질 드릴 과 같은 움직임을 사용하여 diaphysis로 메타피시스를 통해 바늘을 확장합니다. 바늘을 제거합니다.</li>
		<li>경골에 주입하기 전에 직접 해밀턴 주사기에 셀 서스펜션을로드합니다. 이렇게 하려면 중력으로 세포가 튜브 의 바닥에 정착하게됨에 따라 주사기로 그리기 전에 세포를 부드럽게 섞습니다. 참고: 세포는 조심스럽게 혼합한 후 해밀턴 주사기(100 μL)로 그리기 전에 1.5~2mL 튜브(실온)에 보관할 수 있다. 세포는 이식 절차 동안 2-3 시간 동안 실온에서 보관 할 수 있습니다. 이식 세션 전후에 항상 튜브에서 세포의 세포 생존 가능성을 확인하십시오. Trypan 파란색 제외는 세포 생존 가능성 평가를위한 가장 쉬운 방법입니다.</li>
		<li>뼈가 첫 번째 바늘로 통과되면 세포가 로드된 100 μL 해밀턴 주사기에 부착된 두 번째 바늘(10mm으로 표시된 작은 직경 바늘)을 삽입합니다. 10mm 마크까지 바늘을 동일한 구멍에 삽입하여 다이아피시스로 확장되도록 하십시오.</li>
		<li>PBS에서 75,000개의 OS 세포 현탁액의 20 μL을 부드럽게 방전하여 다이아피증과 골수 캐비티로 배출합니다. 참고 : 바늘이 뼈에 흔들리지 않아야하며 안전하다고 느껴야합니다. 바늘이 쉽게 움직이면 피질이 다이아피시스에서 통과되었을 수 있습니다. 세포의 주입 전에 더 단단한 배치를 얻기 위해 삽입을 다시 반복합니다.</li>
		<li>뼈에서 해밀턴 바늘을 제거합니다. 참고: 혈액이 작은 방울이 형성되면 가벼운 압력을 가하십시오. 천지 부위에 명확한 유체 낙하 형태가 있는 경우, 바늘은 뼈에서 충분히 확장되지 않았을 수 있으며 종양 세포 현탁액은 구멍을 통해 다시 유출되었을 수 있습니다. 노트에 이것을 기록하지만 일반적으로 종양 이식은 성공할 것입니다. 경험을 통해 종양 이식 절차는 쥐 당 5 분정도 소요됩니다. 경험을 통해 뼈에 있는 세포의 종양 이식이 쉬워질 것입니다. 뼈 주위 근육에 세포의 우발적 인 주입, 폐 전이에 필요한 종양 미세 환경으로 이어질 수 없습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>복구<ol>
<li>쥐가 규범인지 확인하십시오. 복구를 위해 케이지 아래에 놓인 가열 패드가 있는 새장에 쥐를 놓습니다.</li>
		<li>완전히 깨어, 모바일, 그리고 잘 호흡 후, Buprenorphine와 쥐를 주입 (1.0-1.2 mg/kg SC). 참고: Buprenorphine에 액세스하려면 수의학 직원을 통해 승인 옵션을 확인하여 주문을 하십시오.</li>
		<li>쥐를 다시 케이지청소로 옮기고 매주 하루에 한 번 모니터링합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 측정 및 모니터링
<ol><li>종양 크기를 측정 9-10 이식 후 다음 2 일마다 3 주 까지 이식 후 성장 속도를 설정 합니다. 전자 또는 수동 캘리퍼를 사용하여 경골의 최대 직경을 측정합니다. 종양 볼륨을 계산하기 위해 수식을 사용하여 스프레드시트에 데이터를 저장합니다. 기준선으로 모순 (이식되지 않은 경골)을 측정합니다. 참고: 이식된 뒷다리 직경은 종양 크기의 대리로 사용됩니다. 뒷다리는 사지의 두 가지 측정, 복부/등주 및 미디어/측면 측정을 위해 가장 큰 직경의 경골 긴 축에 수직으로 측정됩니다. 추정종양 부피는 포뮬러11:종양 부피(mm3)= 가장 큰 직경(mm) x 가장 작은 직경(mm)2/2에의해 계산된다.</li>
	<li>종양이 가장 큰 차원에서 15mm 또는 3 주 후 종양 이식에 접근할 때 생존 절단 또는 화학 요법 치료를위한 쥐를 고려하십시오. 이 나이에 대부분의 쥐에 있는 약 7-9 mm를 측정하는 반대로 사지.</li>
</ol>4. 독소루비신 정맥 투여
<ol><li>쥐를 2% 이소플루아네로 마취시합니다. 13에기술된 바와 같이 베타딘과 알코올을 사용하여 세 가지 수술 용 세차로 경정맥위에 피부를 준비한다.</li>
	<li>주의 깊은 해부에서 오른쪽 또는 왼쪽 경정맥을 시각화합니다. 바늘을 과대 근육에 삽입한 다음 쥐의 머리를 경정맥 루멘으로 직접 삽입하여 경정맥 전방에서 가슴 근육에 시각화됩니다.<ol>
<li>바늘이 경정맥에 삽입되면, 적절한 삽입을 보장하기 위해 주사기에 혈액을 부드럽게 그립니다. 바늘이 정맥을 통해 있다고 믿을 수 있지만 바늘은 정맥 아래에 있지 않고 루멘에 있지 않습니다. 경정맥이 너무 작아지면 무딘 해부시 주사가 너무 작아져 서 경정맥을 노출하면 주사에 대한 다른 경정맥을 사용하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>독소루비신(2 mg/kg)을 100-150 μL의 부피로 1분 이상 천천히 주입한다. 용액은 납품 하는 동안 경정맥에서 정맥으로 시각화될 수 있다.</li>
	<li>제어 쥐에 정상적인 식염수의 유사한 볼륨을 주입.</li>
	<li>바늘을 제거하고 멸균 거즈로 정맥에 부드러운 압력을 가하십시오.</li>
	<li>3-4 상처 클립을 사용하여 피부 절개를 닫습니다. 7-10 일 사후 주입에서 클립을 제거합니다. 참고 : 쥐는 일반적으로 금속 클립을 제거하려고하지 않지만 물고 봉합사를 제거합니다. 경정맥 주사 방법은 혈관 외부에 누출되는 약물이 꼬리 절단을 요구할 수 있는 꼬리괴를 유발하기 때문에 독소루비신에 대한 꼬리 정맥 주사를 사용하는 것이 바람직하다.</li>
</ol>5. 뒷다리 절단 프로토콜
<ol><li>유도<ol>
<li>중간 크기의 유도 챔버에 쥐를 놓고 2 %-4 %의 이소플루란으로 마취를 유도합니다. 마취의 깊이를 위해 쥐를 지속적으로 모니터링합니다. 참고: 유도 챔버는 숯 통으로 청소되고 다른 모든 가스는 수술에 사용되는 다운 드래프트 테이블에 의해 제거됩니다.</li>
		<li>코를 노세콘에 삽입합니다. 필요한 경우 테이프로 고정하십시오. 참고: 이 절차는 과도한 휘발성 가스(즉, 이소플루란)를 청소하기 위해 다운 드래프트 테이블에서 수행됩니다.</li>
		<li>오른쪽 다리의 머리카락을 복부까지 제거하고 등쪽 하복부를 클리퍼로 제거하거나 탈필제를 사용하십시오. 쥐를 척추 위치에 놓습니다.</li>
		<li>수술 부위를 70% 에탄올을 사용하여 무균으로 스크럽하고 클로르헨시딘 아세테이트를 희석하거나 베타딘을 희석시하십시오. 오른쪽 하복부의 엉덩이 관절 바로 위에 피부 부위에 종아리 의 중간에서 수술을위한 피부를 준비합니다. 다리 근위와 탈경 부위를 둘레로 문질러보시면 됩니다. 이 단계를 세 번 반복합니다.</li>
		<li>쥐의 양쪽 눈에 눈 윤활제를 적용합니다. 쥐에 정상 체온(37°C)과 정상적인 활력 징후가 있는지 확인합니다. 직장 온도 프로브 모니터에 연결된 가열 패드를 사용하여 체온을 모니터링하고 조절합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>외과<ol>
<li>1.5%-3%(유지보수)로 이소플루란을 켭니다. 발가락 핀치에 대한 반응, 호흡 속도 및 문자에 대한 반응을 포함하여 마취 깊이를 모니터링합니다. 마취의 적절한 평면을 유지하기 위해 필요에 따라 이소플루란의 속도를 조정합니다. 참고: 마취 하에 있는 동안 호흡 속도는 분당 50-100 호흡 사이여야 합니다. 깊고 드물게 호흡은 쥐가 너무 깊이 마취되었다는 것을 나타냅니다.</li>
		<li>멸균 기기 팩과 커튼, 돈 멸균 장갑을 엽니다. 절차 의 기간을 통해 멸균을 유지하기 위해주의하십시오. 필요한 기본 멸균 수술 기구는 메스 블레이드 홀더, 집게, hemostats, 바늘 홀더, 가위 및 상처 클립 applier를 포함한다.</li>
		<li>멸균 수술 커튼의 통풍구를 통해 쥐의 다리를 당깁니다. 동물이 발가락 핀치 반사를 통해 마취의 적절한 평면에 있는지 확인합니다.</li>
		<li>메스 블레이드 또는 외과 가위를 사용하여, 할례, 황장 (무릎 관절)에 단지 근위절을 합니다.</li>
		<li>후드 사지의 복부 내측 표면에 대퇴 동맥과 정맥을 노출하기 위해 거즈 또는 무딘 해부를 사용하여 뒷사지를 데글링합니다.</li>
		<li>중간 대퇴골 및 과도 한 분리의 수준에서 4-0 흡수 봉합사를 사용하여 혈관을 리게이트.</li>
		<li>정맥을 염기 적으로 고정하여 근육 해부 중 누출을 줄입니다. 참고: 대퇴동맥혈관 결찰및 근육의 수준으로 대퇴골관절의 수준으로 대퇴양동을 이식한다.</li>
		<li>무딘 해부를 사용하여 측면 바깥쪽 회전으로 엉덩이 관절을 납치합니다.</li>
		<li>대퇴골의 머리를 찾아 아세타불룸에서 분리하십시오. 남은 조직을 잘라내어 다리에 부착된 다리를 유지합니다.</li>
		<li>약 6 mg / kg Ropivacaine와 아세타불룸과 sciatic 신경에 스플래시 블록을 제공합니다.</li>
		<li>간단한 중단 봉합사 (4-0, 흡수 봉합사)를 사용하여 아세타불룸 위에 근육을 닫습니다. 참고: 추가 0.5% 부피바카인 또는 리도카인(0.15-0.2 mg 합계)은 폐쇄된 근육 층(국소 침투/스플래시 블록)을 따라 여러 부위에 주입될 수 있다.</li>
		<li>5-10mm마다 분리된 상처 클립을 사용하여 피부 의 가장자리를 반대하고 닫습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>복구<ol>
<li>케이지 아래에 놓인 가열 패드를 사용하여 열 지지대를 갖춘 깨끗한 복구 케이지에 쥐를 배치합니다. 참고 : 고열증을 방지하기 위해, 가열 패드는 동물과 직접 접촉해서는 안되며 40 ° C를 초과해서는 안됩니다.</li>
		<li>동물이 완전히 회복되고 normothermic (37.5-39 °C)가 될 때까지 동물을 모니터링하십시오. 참고: 동물은 완전히 의식하고 엄격하게 구부러지고 케이지 주위를 쉽게 움직일 때까지 방치해서는 안됩니다.</li>
		<li>완전히 깨어, 모바일, 그리고 잘 호흡 후, Buprenorphine와 쥐를 주입 (1.0-1.2 mg/kg SC). 참고: 마취된 쥐에 부프레노르핀을 주면 회복이 손상될 수 있습니다.</li>
		<li>견갑골 사이에 10mL의 따뜻한 수유 링거 용액을 피하로 관리하십시오.</li>
		<li>쥐를 깨끗한 케이지로 다시 옮기고 동종으로 재결합합니다.</li>
		<li>홍반, 화농성 분비물 또는 상처 절개를 포함한 모든 동물을 다음 달 동안 매일 두 번 모니터링하여 필로직기, 구부러진 자세 또는 절개 부위 감염의 징후와 같은 통증과 고통의 징후를 모니터링하십시오. 참고: 현재까지 우리는 어떤 동물에서 수술 후 회복 에 이어 임상 징후 (감염 등)를 관찰하지 않았습니다. 단 한 마리의 쥐만이 봉합사로 변함을 보였고, 그 후 상처 클립은 더 이상 문제 없이 상처를 닫는 데 사용되었습니다.</li>
		<li>실험실 동물 수의사와 협의하여 출판 된 복용량에서 통증의 임상 징후를 제시하는 동물에게 buprenorphine 또는 멜록시캠을 투여하십시오.</li>
		<li>항생제 (즉, 세팔로스포린)를 실험실 동물 수의사와 협의하여 출판 된 복용량에서 통증의 임상 징후를 제시하는 동물에게 투여하십시오. 참고: 항생제에 반응하지 않는 감염의 표시를 전시하는 진통제 또는 동물로 향상되지 않는 고통 또는 고통의 연장된 표시를 전시하는 어떤 동물든지 인도적으로 안락사될 필요가 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>6. 엑스레이를 가진 화상 진찰
<ol><li>종양 이식 후, 설치류를 위해 설계된 기계로 X 선을 사용하여 종양 성장을 검출하기 위해 비침습적으로 티바이어스와 폐를 이미지합니다.</li>
	<li>쥐를 이전에 수행한 것처럼 마취시화합니다.</li>
	<li>25 kV에서 6s에 대한 3 배율로 이미지를 가져 가라.</li>
	<li>X선 프로세서를 사용하여 필름을 처리합니다. 방사선 사진도 디지털 스캔할 수 있습니다.</li>
</ol>7. 부검 절차
<ol><li>CO2로쥐를 안락사시다. 심장 박동의 부족을 통해 죽음을 확인하고 즉시 혈청 또는 혈장 샘플을 위한 심혼에서 3 mL 혈액을 그립니다.</li>
	<li>검사를 위해 흉부와 복부를 엽니다.</li>
	<li>기관을 분리하고 (18 G) 카테터로 캐너레이트합니다. 기관지에서 카테터를 고정하려면 카테터와 함께 두 기관 주변에 실크 봉합사를 묶습니다.</li>
	<li>주입 카테터를 3 mL 또는 5 mL 주사기에 연결합니다. 포르말린이나 식염수에 주입하여 더 나은 작사 표본을 위해 폐 엽을 부드럽게 팽창시다. 주입시 폐는 퍼프업되어 폐 전이의 더 나은 시각화를 가능하게 합니다.</li>
	<li>검사, 해부, 모든 선택된 흉부 및 복부 장기 (간, 신장 등)를 무게.</li>
	<li>조직 병리학에 대한 포르말린의 장기를 고정하거나 드라이 아이스, 2-메틸부탄 또는 액체 질소에 동결하십시오.</li>
	<li>서양 얼룩을 사용하여 단백질 발현의 평가를 위해, 냉동 조직의 lysates를 합니다. 쥐 조직과 반응하는 항체는상세한 13입니다.</li>
</ol>8. 면역 작용화학
<ol><li>파라핀에 포함 된 1 차 OS 조직을 처리하고 면역 조직 화학 염색을 위해 그것을 단면.</li>
	<li>구연산 완충(pH 6.0)을 사용하여 항원분해 후 항원을 회수한다. 내생성 과옥시다아제에 30분 동안 메탄올에서 0.3% H2O2의 인큐베이션을 허용한다.</li>
	<li>일반 혈청을 사용하여 5 μm 두께의 파라핀 섹션을 차단합니다.</li>
	<li>4°C에서 하룻밤 사이에 1차 항 CD68 및 CD3 항체(테이블 참조)를 배양한다.</li>
	<li>PBS의 섹션을 헹구고 검출 키트를 사용하여 HRP 폴리머로 배양합니다. 참고: 면역염색은 염색체로서 디아미노벤지딘으로 개발되었습니다.</li>
</ol>9. 웨스턴 블로팅
<ol><li>표준 젤 전기포고및 서부 블로팅을 수행하기 위해 200-300 μL의 용해완충제(14)에서 UMR-106 세포를 lyse.</li>
	<li>4%에서 12%의 비스 트리스 젤을 사용하십시오.</li>
	<li>항-ErbB2, 항-ErbB4, 안티 EGFR, 안티-ERK, β 액틴 또는 항마우스 β2-AR 1차 항체(표 참조) 및 고추냉이 과록시다제-연결된 이차 항체에서 배양한다.</li>
	<li>화학 발광 기판을 추가합니다. 멤브레인을 X선 필름에 노출시킵니다. 참고: β 액틴 레벨은 로드 컨트롤로 사용됩니다.</li>
</ol>

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<li>Abdou, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Prognostic+role+of+Ezrin+and+HER2%2Fneu+expression+in+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Immunohistochemistry+%26+Molecular+Morphology%22%5BJournal%5D)">The Prognostic role of Ezrin and HER2/neu expression in osteosarcoma.</a> Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 24 (5), 355-363 (2016).</li>
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<li>Khanna, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+drug+development+path+that+targets+metastatic+progression+in+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Toward a drug development path that targets metastatic progression in osteosarcoma.</a> Clinical Cancer Research. 20 (16), 4200-4209 (2014).</li>
</ol>

선언할 공개가 없습니다.

OS 티비알 임플란트를 가진 쥐는 이식 후 3 주까지 측정 가능한 종양을 개발합니다. 종양을 가진 사지가 이식 후 3 주 절단되는 경우에, 폐 전이의 부각은 현저하게 감소됩니다. OS는 골연및 골세포학 둘 다입니다. 절단이 없는 쥐는 방사선 촬영또는 부검시 7주 까지 여러 가지 와 가변크기인 폐 전이를 개발합니다. EGFR, ErbB2 및 ErbB4는 인간OS16,17,18과유사한 쥐 UMR106 OS로 표현된다. CD3 T 세포 및 대식세포는 면역히스토화학 방법에 의해 OS에서 쉽게 검출된다. 경정맥 주사는 OS 환자에게 주어지는 약물인 화학요법 독소루비신의 전달을 위해 정맥을 꼬리에 담는 것을 선호한다. 여기에 설명된 방법은 완전한 콕소페모랄 절단입니다. 이 절차는 정제이며 뼈가 절단되어 환자를 위한 그루터기를 떠나는 수술 방법 (대퇴 골 절제술)을 제거하는 ...

골육종 (OS)은 어린이, 청소년 및 젊은 성인에서 가장 흔한 1 차 적인 뼈 종양입니다. OS의 치료에 가장 최근의 사전은 다중 에이전트 화학 요법이 수술 혼자 에 비해 전반적인 생존을 개선하는 것으로 나타났다 때 1980 년대에 발생1. OS는 빠른 뼈 성장 도중 발전합니다, 일반적으로 대퇴골과 같은 긴 관 뼈에서 생기는, 경골, 및 상완골. 그들은 골연성, 골세포, 또는 주목할만한 periosteal 반응2와혼합 된 외관을 특징으로한다. 화학요법과 외과 절제술은 환자의 65%를 위한 5년 생존을 가진 환자를 위한 결과를 향상할 수있습니다2,3. 불행히도, 전이성 질환을 가진 고급 OS 환자는 20 %의 생존을 가지고 있습니다. OS는 지역적으로 침략하고 폐 또는 그밖 뼈에 주로 전이하고 남성에서 더 널리 퍼집니다. 이 젊은 환자를 위한 가장 강력한 필요는 먼 전이의 생존을 방지하고 제거하는 새로운 치료입니다.
OS 전임상 모델은4,5,6,7및 정형토피OS의 절단을 이용한 사용 가능한 면역능력모델이 거의 개발되었다. 2000년에는 정형소 성 합성 OS 및 절단8을가진 BALB/c 마우스를 사용하여 중요한 모델을 개발하였다. 이 마우스 모델에 비해, 쥐 모델은 유전적 근친교와 10 배 더 큰 동물을 기반으로 몇 가지 장점으로 이어지는. 쥐 UMR106 모델은 세포주9로파생된 스프라그 다울리(SD) 쥐에서 32P유도 OS로부터 개발되었다. 2001년, UMR106-01의 직교 이식은 인간에서 OS와 공통적으로 신속하고 일관된 1차 종양 발달 및 방사선학적, 조직학적 특징을 가진 아티믹 마우스의 이식된 티바이스에서 처음 기술되었다. 폐 전이개발 및 골 미세환경(10)에UMR106의 직교 배치에 의존했다. 2009년, Yu et al.11은 더 큰 수컷 SD 쥐에 UMR106 세포를 사용하여 재현 가능한 직교 대퇴골 OS 쥐 모델을 확립하였다. 절단없이 쥐에서 성공적인 종양 이식 및 폐 전이율은 여기에 제시 된 데이터와 유사했다. 이 연구에서는, 젊은 쥐를 사용하여 모델에 추가 절단이 수행되었다, 이는 1 차 종양 제거의 타이밍이 OS 모델링에 중요하다는 것을 시사, 특히 전이성 진행과 관련된. 이 세련미, 절단 및 생체 내 이미징은 OS에 대한 새로운 약물 평가를 위한 전임상 연구를 위한 이 모델을 향상시킵니다.

<table><tbody><tr><td>AKT</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>4685S</td><td></td></tr><tr><td>흡수성 봉합사</td><td>Ethicon</td><td>J214H</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-actin</td><td>SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY</td><td>sc-47778</td><td></td></tr><tr><td>&beta; 2-AR 항체</td><td>SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY</td><td>sc-569</td><td>는 &beta로 대체되었습니다. 2-AR (E-3): sc-271322</td></tr><tr><td>비스대시; Tris gels</td><td>Thermo Fisher</td><td>NP0321PK2</td><td></td></tr><tr><td>부프레노르핀 SR Lab</td><td>ZooPharm</td><td>IZ-70000-201908</td><td></td></tr><tr><td>CD3 항체</td><td>Dako</td><td>#A0452</td><td></td></tr><tr><td>CD68 항체</td><td>eBioscience</td><td>#14-0688-82</td><td></td></tr><tr><td>Chemiluminescent substrate</td><td>cytiva</td><td>RPN2232</td><td></td></tr><tr><td>CL-Xposure film</td><td>Thermo Fisher</td><td>34089</td><td></td></tr><tr><td>완전한 마취 시스템</td><td>EVETEQUIP</td><td>922120</td><td></td></tr><tr><td>디아미노벤지딘</td><td>VECTOR LABORATORIES</td><td>SK-4100</td><td></td></tr><tr><td>독소루비신</td><td>Actavis</td><td>NDC 45963-733-60</td><td></td></tr><tr><td>EGFR 항체</td><td>SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY</td><td>sc-03</td><td>EGFR (A-10)로 대체: sc-373746</td></tr><tr><td>ERBB2 항체</td><td>SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY</td><td>sc-284</td><td>Neu (3B5)로 대체: sc-33684</td></tr><tr><td>ERBB4 항체</td><td>SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY</td><td>sc-283</td><td>ErbB4 (C-7)로 대체: sc-8050</td></tr><tr><td>ERK 항체</td><td>SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY</td><td>sc-514302</td><td></td></tr><tr><td>eye lubricant</td><td>PHARMADERM</td><td>NDC 0462-0211-38</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton syringe (100 &micro; L)</td><td>Hamilton</td><td>Model 1710 SN SYR</td><td></td></tr><tr><td>서양고추냉이 과산화효소 연계 2차 항체</td><td>cytiva</td><td>NA934</td><td></td></tr><tr><td>HRP 폴리머 검출 키트</td><td>VECTOR LABORATORIES</td><td>MP-7401</td><td></td></tr><tr><td>HRP 폴리머 검출 키트</td><td>VECTOR LABORATORIES</td><td>MP-7402</td><td></td></tr><tr><td>이소플루란</td><td>BUTLER SCHEIN</td><td>NDC 11695-6776-2</td><td></td></tr><tr><td>이소플루란 기화기</td><td>EVETEQUIP</td><td>911103</td><td></td></tr><tr><td>UMR-106 셀</td><td>ATCC</td><td>CRL-1661</td><td></td></tr><tr><td>X선</td><td>Faxitron</td><td>UltraFocus</td><td></td></tr><tr><td>X선 프로세서</td><td>Hope X-Ray Peoducts Inc</td><td>MicroMax X-ray 프로세서</td><td>Hope 프로세서는 더 이상 미국에서 사용할 수 없습니다</td></tr><tr><td>상처 클립</td><td>BECTON DICKINSON</td><td>427631</td><td></td></tr></tbody></table>

전이율을 제어하는 절단을 가진 신제닉 직소 성 골육종 스프라그 dawley 쥐 모델

A Syngeneic Orthotopic Osteosarcoma Sprague Dawley Rat Model with Amputation to Control Metastasis Rate

골육종 (OS)의 치료에 가장 최근의 사전은 다중 에이전트 화학 요법이 수술 에 비해 전반적인 생존을 개선하는 것으로 나타났을 때 1980 년대에 발생했습니다. 이 문제를 해결하기 위해, 연구의 목적은 생존을 연장 포괄적 인 히스토마이트, 이미징, 생물학적, 이식 및 절단 수술 접근으로 쥐에서 OS의 덜 알려진 모델을 정제하는 것입니다. 우리는 면역 능력, 근친근 Sprague-Dawley (SD), 이식 UMR106 OS 세포주 (SD 쥐에서 유래)와 시너지 쥐 모델을 사용 (SD 쥐에서 유래) 3 주 된 남성과 여성 쥐에 3 주 된 남성과 여성 쥐 소아 OS를 모델링. 우리는 쥐가 재현 가능한 1 차및 전이성 폐 종양을 개발하고, 3 주 이식 후 이식 후 사지 절단이 폐 전이의 발생률을 현저히 감소시키고 예기치 않은 죽음을 방지하는 것을 발견했습니다. 조직학적으로, 쥐의 1차 및 전이성 OS는 인간 OS와 매우 유사하였다. 면역 조직 화학 방법을 사용하여, 연구 결과는 쥐 OS가 대식세포및 T 세포로 침투한다는 것을 보여줍니다. OS 세포의 단백질 발현 조사는 이 종양이 ErbB 가족 키나아제표현을 한다는 것을 밝힙니다. 이 키나아제는 또한 대부분의 인간 적인 OSs에서 높게 표현되기 때문에, 이 쥐 모형은 치료를 위한 ErbB 통로 억제제를 시험하기 위하여 이용될 수 있었습니다.

면역 능력 SD 근친쥐는 이러한 OS 연구에 사용되며, 이는 그대로 면역 체계를 가진 동물 모델을 제공합니다. 우리는 ATCC에서 UMR106 세포줄을 사용했습니다, SD 쥐에서 처음에 OS에서 격리된 세포에서 개발된. 우리는 SD 쥐에 세포를 이식, 따라서 OS에 대한 동기화 모델을 제공. UMR106 세포는 소아 OS 모델을 시뮬레이션, 3 주 된 남성과 여성 SD 쥐의 경골에 이식된다. 더욱이, 경골 대사/설사로 직접 UMR106 세포의 직교 이식은 관련 종양 미세환경을 제공한다.
종양 세포를 이식할 때, 바늘은 골의 중앙 캐비티로 약 10mm를 연장하는 올바른 각도(뼈 샤프트와 평행)에서 티비알 고원을 통해 올바르게 삽입되어야 한다. 이 절차로, 쥐의 95% (52/55) 무릎에 티바이어스 성향에 종양을 개발. 티비알 주사 경험으로, 쥐의 100%는 종양을 개발했습니다. 절단되지 않은 쥐의...

여기서, 전이 생물학의 전임상 조사에 사용될 수 있는 자발적인 폐 전이와 함께 골육종의 절단 절차를 따르는 회제 성 직소 이식이 기술되고 새로운 치료법의 개발이 설명된다.

전이율을 제어하는 절단을 가진 신제닉 직소 성 골육종 스프라그 Dawley 쥐 모델

The most recent advance in the treatment of osteosarcoma (OS) occurred in the 1980s when multi-agent chemotherapy was shown to improve overall survival ...

경골 미세 환경 내부에 골육종 세포를 이식하는 것은 폐 전이를 촉진합니다. 이 모형은 또한 그대로 면역 계통을 요구하는 폐 전이 또는 새로운 암 치료의 기계장치를 공부하기 위하여 유용할 수 있습니다. 일단 종양이 설치되면, 절단은 장기 생존 연구에서 전이의 비율을 통제하기 위하여 필요합니다.우리는 정맥 약물 전달의 시각화를 허용하기 위해 경정맥 주사를 사용합니다. 경정맥 주사는 정확한 약물 전달이 필요한 다른 많은 질병 모델에 유용합니다. 우리는 생체 내 이미징을 위해 나노 입자와 방사성 라벨 리간을 제공하기 위해이 방법을 사용했습니다.우리는 혈액 손실없이 사지 절단의 역학을 마스터하는 실험을 시도하기 전에 5에서 10 안락사 쥐에서 사지를 제거하는 연습을 새로운 사용자를 조언한다. 음경 반사에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, supine 위치에 낮은 열 설정 열 패드에 노세네에 마취 된 쥐를 확보. 복부와 등쪽 하복부까지 오른쪽 다리의 머리카락을 제거합니다.거즈 나 스프레이를 사용하여 70 %의 에탄올과 적절한 희석 된 살균제로 수술 영역을 소독하고 동물의 눈에 연고를 바르습니다. 드릴과 같은 동작을 사용하여 10mm 라고 표시된 22 게이지 바늘을 티비알 고원 한가운데에 있는 경골 의 다이아피시스에 삽입하여 다이아피시스로 바늘을 확장합니다. 바늘을 제거한 후, 상질세포 현탁액을 얻기 위해 관심 있는 종양 세포 현탁액을 부드럽게 혼합하고, PBS의 20 마이크로리터에서 세포의 4분의 4에 7.5 x 10을 로드하여 해밀턴 주사기로 한다.바늘 끝에서 10 밀리미터 의 세포로 해밀턴 주사기를 표시하고 22 게이지 바늘에 의해 만들어진 구멍에 10 밀리미터 마크에 바늘을 삽입합니다. 그런 다음 전체 양의 세포를 골수 구멍으로 부드럽게 배출하고 쥐를 가열 패드에 케이지에 넣고 전체 재복이 있을 때까지 모니터링합니다. 정맥 내 독소 루비신 투여의 경우 마취 확인 후 신중한 해부를 사용하여 오른쪽 또는 왼쪽 경정맥을 시각화하고 바늘을 과측 근육 조직에 삽입하십시오.바늘을 경정맥 루멘으로 향하게 하고, 경정맥 전방에서 펙토랄리스 근육에 시각화되고, 정확한 삽입을 확인하기 위해 바늘 끝에 소량의 혈액을 끌어들입니다. 바늘이 제자리에있을 때, 천천히 1 분 동안 킬로그램 독소루비신 당 2 밀리그램의 100 ~ 150 마이크로 리터를 주입하십시오. 솔루션은 납품 중에 정맥 내에서 표시되어야 합니다.모든 용액이 전달되면 멸균 거즈를 사용하여 정맥에 부드러운 압력을 가하고 3~4개의 상처 클립을 사용하여 절개를 닫습니다. 퇴적을 확인한 후 오른쪽 다리의 머리카락을 복부와 등쪽 하복부까지 제거하고 가열 패드에 쥐를 척추 위치에 놓습니다. 종아리 의 중간에서 오른쪽 아래 복부의 엉덩이 관절 바로 위에 피부를 문질러 동물의 눈에 연고를 적용합니다.멸균 장갑과 악기를 사용하여, 멸균 수술 커튼의 통풍구를 통해 다리를 당기고, 단지 질식에 근위균 을 할례 적인 분리 절개를합니다. 뒷다리를 장갑을 끼고 뒷사지의 복부 내측 표면에 대퇴 동맥과 정맥을 노출시키고 4-0 흡수 가능한 봉합사를 사용하여 중간 대퇴골 및 트랜스펙트 의 수준에서 혈관을 소송합니다. 정맥을 해부 하는 동안 누출을 줄이기 위해 해동 하 고 측면 외부 회전으로 엉덩이 관절을 납치 하는 무딘 해부를 사용 하 여.대퇴골의 머리를 염분에서 찾아 분해하고 남은 조직을 제거하여 다리에 부착된 다리를 유지합니다. 로피바카인 킬로그램당 약 6밀리그램의 아세타불룸및 시스틱 신경에 스플래시 블록을 투여하고, 간단한 중단된 4-0 흡수성 봉합사를 사용하여 아세타부를 통해 근육을 닫습니다. 그런 다음 5~10밀리미터 에 배치된 상처 클립을 사용하여 피부의 가장자리를 닫습니다.종양 감시를 위한 엑스레이 화상 진찰은 뼈 종양 침략의 확인을 허용하고 최근에 절단한 또는 포르말린 고정 사지에 수행될 수 있습니다. 엑스레이 화상 진찰은 또한 전이의 유무에 관계없이 폐의 방사선 학적 형태에 대한 평가를 허용하고, 불필요한 자발적인 죽음을 방지하기 위해 안락사에 대한 필요성을 결정하는 빠르고 쉬운 방법을 제공합니다. 쥐 골육종에서, 골분해성 및 골성 세포 종양 형태는 절단된 사지의 조직병리학에 의해 확인될 수 있다.피질 뼈는 이 예에서 결석하고 인접한 뼈가 피질의 기존 샤프트에 수직으로 지향되는 새로운 직조 뼈로 대체되거나 강화되었다는 점에 유의하십시오. 미숙한 골골의 섬은 또한 종양 내에서 확인할 수 있습니다. 이들 심상에서는, 대표적인 폐 전이의 현미경 형태, 광물화된 뼈 및 종양 혈관 색전증을 가진 몇몇은 관찰될 수 있다.1 차적인 골육종 종양의 면역 염색은 CD68 양성 대식세포 또는 CD3 양성 T 세포와 같은 면역 세포 집단에 의한 종양의 침투를 드러낼 수 있습니다. 종양 세포 단백질 용해의 서양 얼룩은 단백질 키나아제, 단백질 키나아제 수용체 및 이러한 경로와 상호 작용하는 다른 단백질의 발현을 결정하는 데 사용될 수 있다. 티비알 이식의 경우, 첫 번째 티비알 구멍이 만들어지면, 해밀턴 바늘 삽입을 쉽게 하기 위해 피부와 뼈 구멍이 줄지어 있는 것과 같은 각도로 비 지배적인 손에 다리를 계속 고정합니다.경정맥 주사의 경우 바늘을 근육에 삽입하지만 바늘을 너무 많이 각도로 각도로 각도를 두지 마십시오. 절단을 위해, 먼저 안락사 쥐에 대한 반자 연습을.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

에 대한 면역 적격 마우스에 묽은 난소암의 Orthotopic 모델 생체내에</em종양 면역 응답> 종양 이미징 및 모니터링

면역 능력이 쥐의 흉강에 II-45 악성 세포의 이식에 의한 흉막 악성 중피종의 소성을 쥐 모델의 생성이 제공됩니다. 유세포 방법도 기재되어 25 ㎕의 혈액 샘플로부터이 동물 일곱 면역 세포 서브 세트를 분석한다.

II-45 동계 쥐의 Mesothelioma 모델에서 소성을 주입 및 주변 면역 세포 모니터링

동소 유방암 차 종양 모델 원발 종양의 외과 적 제거가 기재되어 자발적 전이를 생성하는 마우스의 수명을 연장한다. 종양 성장 및 진행 모니터링하고 루시퍼 형광 이미징에 의해 정량화된다.

자발적 유방암 전이의 동소 이식 마우스 모델

골 종양 진행; 지원의 프로그래밍 이끌어 낸다 암 파생 extracellular 소포 (EVs)의 직접 분사 그러나, 셀 중재이 효과가 명확 하지 않습니다. 여기, 우리 EV 교육 MSCs 전이에 대 한 중요 한 역할을 드러내는 EV 중재 종양 mesenchymal 줄기 세포 (MSC) 상호 작용에서 vivo에서, 조사 하는 단계별 프로토콜을 설명 합니다.

종양 및 중간 엽 줄기 세포 사이의 세포 외 기 중재 통신을 정의 하는 다리의 전 임상 마우스 모델

이 프로토콜에서, 우리는 테스트 (네오) 보조 요법을위한 연조직 육종의 불완전한 수술 절제술의 마우스 모델을 설명합니다.

시험을 위해 불완전하게 절제술된 연조직 육종의 마우스 모델(Neo) 보조 요법

이 프로토콜은 유방암 뼈 전이의 쥐 모델에서 자기 공명 영상 (MRI) 및 양전자 방출 단층 촬영 /컴퓨터 단층 촬영 (PET/CT)에서 파생 된 이미징 매개 변수의 조합을 사용하여 기계 학습 알고리즘을 훈련하여 조기 전이성 질환을 감지하고 거식세포에 대한 후속 진행을 예측하도록 설계되었습니다.

실험래기 모델에서 뼈 전이를 조기에 감지하기 위한 기계 학습 알고리즘

뼈 전이 모델은 균일하게 또는 100% 발생률로 전이가 발생하지 않습니다. 직접 골내 종양 세포 주사는 폐 색전술을 초래할 수 있습니다. 우리는 고형 종양 이식편을 뼈에 이식하여 원발성 뼈 종양 및 뼈 전이를 모델링하여 재현 가능한 생착 및 성장을 유도하는 기술을 제시합니다.

원발성 뼈 종양 및 뼈에 이식된 고형 종양을 통한 뼈 전이 모델링

본 프로토콜은 동위원소 골육종 및 폐 전이 병변을 지닌 마우스 모델을 생성하기 위해 경막내 골육종 세포 주사를 기술한다.

경골 내 골육종 세포 주사 동위원소 골육종 및 폐 전이 마우스 모델 생성

본 프로토콜은 인간 골육종 조직을 이용하여 환자 유래 이종이식(PDX) 마우스 모델을 확립하는 방법을 설명한다.

인간 골육종 조직을 이용한 환자 유래 이종이식 마우스 모델 구축

이 현재 프로토콜은 난소 절제술을 사용하여 골근감소증의 쥐 모델을 만드는 절차를 간략하게 설명합니다.

난소 절제술을 통한 골연감소증에 대한 쥐 모델 생성

학습하세요 Sprague-Dawley 쥐를 이용한 골육종 동종이식 모델에서 절단을 통한 전이율 제어 방법을. 정맥 내 약물 전달 및 면역세포 침윤 분석이 가능한 이 플랫폼은 항암 치료제 개발 연구에 활용됩니다.

전이율을 제어하는 절단을 가진 신제닉 직소 성 골육종 스프라그 Dawley 쥐 모델

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