이동식 XY 단계가 있는 플랫폼 인큐베이터: 단백질의 세포 내 빠른 광화학 산화 를 구현하기위한 새로운 플랫폼
2021년 5월 17일
새로운 정적 플랫폼은 단백질의 세포 내 빠른 광화학 산화(IC-FPOP)라고 불리는 단백질 발자국 기술을 활용하여 네이티브 세포 환경에서 단백질 구조 및 상호 작용 부위를 특성화하는 데 사용됩니다.
이 방법은 오늘날의 까다로운 생물학적 질문에 대한 해결책을 제공합니다. 세포 내 FPOP 실험에서, 우리는 단백질 리간드 상호 작용, 단백질 단백질 상호 작용 사이트 및 형성 변화의 지구를 연구할 수 있습니다. 이 기술의 장점은 세포를 성장하고 레이저에서 바로 세포 FPOP 연구를 수행 할 수 있도록 자동화 된 6 잘 플레이트 기반IC-FPOP 플랫폼의 사용이다.
이 방법은 제약 및 생명 공학 산업뿐만 아니라 주요 학술 및 임상 연구 기관, 특히 단백질 역학을 연구하는 대학의 생물학적 조사원에 사용될 수 있습니다. 먼저 플랫폼 인큐베이터를 위치 지정 단계에서 풀고 온도, 가스 및 가습기 라인을 분리합니다. 인큐베이터를 70%에탄올로 분무하여 세포 배양 후드에 놓습니다.
플랫폼 인큐베이터에서 6웰 플레이트를 제거하고, 플레이트의 원래 뚜껑을 고정하고, 현미경을 사용하여 세포 의 합류를 확인한 다음, 세포 배양 후드 내부의 플랫폼 인큐베이터에 컨플루언서가 있는 6웰 플레이트를 다시 배치한다. 튜브를 잘 벽에 플러시하여 임베디드 포트를 통해 각 웰에 3개의 미리 절단된 타이곤 튜브를 삽입하고 사용자 정의 3D 인쇄 링으로 고정합니다. 펌프 인출을 위해 통합 소프트웨어 스크립트를 준비합니다.
하나의 연동 펌프를 사용하여 6개의 우물에서 셀 미디어를 완전히 제거합니다. 다른 세 개의 연동 펌프의 각 채널에서 프라임 용매는 시약이 인큐베이터 포트에 도달할 때까지 각각의 교대관에 과산화수소 및 담금절 버퍼를 주입합니다. 레이저 빔이 올바르게 기울어져 있고 무단으로 인큐베이터에 도달하는지 확인합니다.
외부 센서를 사용하여 레이저 에너지를 확인합니다. 빔 정렬을 확인한 후 펌프 주입을 위한 통합 소프트웨어 스크립트를 준비합니다. 분당 35 밀리리터에 과산화수소 200밀리머를 주입하여 첫 번째 우물에 넣습니다.
5초 마크에서 레이저 소프트웨어의 시작 버튼을 눌러 타이머의 11초 마크에서 펄스를 트리거합니다. 레이저 펄스 직후 분당 35 밀리리터에 125 밀리머 커넥드 용액을 주입합니다. 수동으로 위치 단계이동하여 다음 단계를 레이저 빔과 잘 맞추고 모든 우물에 대한 프로세스를 반복합니다.
세포 배양 후드에서 세포 스크레이퍼를 사용하여 각 웰에서 개별 15 밀리리터 원문 튜브로 세포를 전송합니다. 원심분리기 세포는 5분 동안 1, 200배 G에서 세포를 제거합니다. 상체를 버리고 RIPA 리시스 버퍼의 100 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단합니다.
개별 1.2 밀리리터 폴리프로필렌 튜브로 세포를 이송합니다. 플래시는 액체 질소에 있는 모든 견본을 동결하고 사용될 때까지 영하 80도 냉동고에 놓습니다. FPOP 수정을 국소화하기 위해 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석 분석을 사용하여 소화된 셀 용액을 분석한 다음 수정 정도를 계산합니다.
플랫폼 인큐베이터 조건이 레이저 플랫폼에서 세포 배양에 충분한지 확인하기 위해 GCaMP2는 HEK293T로 일시적으로 전환되었고 두 플레이트에 대한 경질 효율을 형광 이미징을 통해 평가하였다. 루시파라제 분석체는 경질 효율을 수량화하기 위해 수행되었다. 유동 시스템에 표지된 HEK293T 셀의 FPOP 수정은 플랫폼 인큐베이터에 표시된 세포와 비교하였다.
플랫폼 인큐베이터는 변형된 단백질의 수와 해당 단백질의 총 FPOP 커버리지 모두에서 유량 시스템을 능가했습니다. 유동 시스템에서는 2개의 변형된 펩타이드가 검출되어 제한된 구조 정보를 제공했다. 그러나, 액틴 서열을 아우르는 5개의 수정된 펩타이드는 플랫폼 인큐베이터에서 검출되었다.
시스템 및 수정되지 않은 액틴 펩타이드 모두에서 변형된 프롤린을 가진 액틴의 탠덤 MS 스펙트럼이 여기에 나와 있다. 플랫폼 인큐베이터 샘플의 FPOP 수정 잔류물에는 12개의 수정된 잔류물, 유동 시스템의 3개의 수정된 잔류물, 1개의 중복 변형된 잔류물이 포함되어 있습니다. LC-MS MS 분석에 따르면 792개의 단백질이 유동 시스템으로 변형된 545단백질에 비해 플랫폼 인큐베이터에서 생체 내 FPOP에 의해 변형되었다는 사실이 밝혀졌습니다.
멸균 조건 하에서 세포를 유지하는 것이 필수적입니다. 항상 플랫폼 인큐베이터를 멸균 세포 배양 후드에 가져와 필요한 모든 6웰 플레이트, 튜브 및 링을 삽입하십시오. 이렇게 하면 실험의 무결성이 보장됩니다.
개요
본 논문은 질량 분석법(MS)과 결합된 6-웰 플레이트 기반 자동화 플랫폼(PIXY)을 이용한 세포 내 단백질 고속 광화학 산화(Fast Photochemical Oxidation of Proteins, FPOP)의 고급 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 살아있는 세포 배양액에서 신속하고 고효율의 단백질 풋프린팅을 가능하게 하여, 세포 환경 내 단백질 상호작용, 구조적 동역학 및 구조적 변화 연구를 용이하게 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 구조 단백질체학
- 단백질 화학
- 세포 생물학
- 질량 분석법
배경
- FPOP은 단백질 구조와 상호작용을 조사하는 데 사용되는 하이드록실 라디칼 단백질 풋프린팅 기술입니다.
- 전통적인 FPOP 방법은 시간이 많이 소요되며 종종 in vitro 연구로 제한됩니다.
- 최근의 발전으로 살아있는 세포 내에서 단백질 라벨링이 가능해졌으며, 이를 통해 복잡한 세포 환경에서의 단백질 거동에 대한 통찰력을 얻을 수 있게 되었습니다.
- 자동화와 소형화를 통해 처리량과 재현성을 크게 높일 수 있습니다.
연구 목적
- 6-웰 플레이트 시스템을 사용하여 신속하고 자동화된 세포 내 FPOP 플랫폼을 개발하고 검증합니다.
- 새로운 플랫폼 인큐베이터의 효율성 및 커버리지를 기존의 흐름 기반 FPOP 시스템과 비교합니다.
- 살아있는 세포 내 단백질 역학 및 상호작용의 시분해 연구를 가능하게 합니다.
사용된 방법
- 온도, CO2 및 습도가 제어되는 플랫폼 인큐베이터 내에서의 세포 배양 및 일시적 형질도입.
- 6-웰 플레이트 형식에서 연동 펌프와 맞춤형 튜빙을 이용한 자동 시약 주입.
- 각 웰에 대해 단일 레이저 펄스(248 nm KrF 엑시머 레이저)를 통한 하이드록실 라디칼 생성.
- 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS)을 이용한 단백질 변형 분석.
주요 결과
- 플랫폼 인큐베이터를 통해 샘플당 20초 만에 FPOP 분석이 가능했으며, 이는 유동 시스템(flow systems) 대비 분석 시간이 60배 단축된 결과입니다.
- 유동 시스템과 비교하여 플랫폼 인큐베이터에서 더 많은 단백질과 변형 잔기가 검출되었습니다 (단백질 792개 vs 545개; 액틴 내 변형 잔기 12개 vs 3개).
- 플랫폼 인큐베이터에서 펩타이드 커버리지와 구조적 정보가 향상되었습니다.
- 플랫폼 인큐베이터 조건 하에서 형질전환 효율과 세포 생존율이 유지되었습니다.
결론
- 자동화된 6-웰 플레이트 기반 IC-FPOP 플랫폼은 세포 내 단백질 풋프린팅의 처리량과 데이터 품질을 크게 향상시킵니다.
- 이 방법은 살아있는 세포 내 단백질 구조 및 상호작용에 대한 상세한 시간 분해 연구를 가능하게 합니다.
- 본 플랫폼은 학술, 임상 및 산업 연구 환경의 다양한 응용 분야에 적합합니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
PIXY 플랫폼은 신속하고 고처리량인 세포 내 단백질 풋프린팅(in-cell protein footprinting)을 가능하게 하여, 생리학적으로 유의미한 환경에서 단백질 구조 및 상호작용에 대한 발견 단계의 조사를 직접적으로 지원합니다. 샘플당 분석 시간을 20분에서 20초로 단축함으로써, 본 시스템은 기전적 리스크 제거(mechanistic de-risking)를 가속화하고 타겟 검증 및 리드 선별을 위한 예측 신뢰도를 높입니다. 자동화와 살아있는 세포 호환성을 통합한 이 플랫폼은 기업 규모의 구조 단백질체학 및 중개 연구를 위한 재사용 가능한 자산으로 활용될 수 있습니다.
바이오 제약 R&D에서의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 살아있는 세포 내에서 단백질-리간드 및 단백질-단백질 상호작용을 직접 분석할 수 있습니다.
- 입체 구조 변화와 상호작용 부위를 매핑하여 기능적 표적 검증을 지원합니다.
- 고해상도, 시분해 구조 데이터를 통해 메커니즘적 리스크 감소를 용이하게 합니다.
- 포트폴리오 내 표적 진행을 위한 예측 신뢰도를 향상시킵니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 후속 스크리닝 워크플로우를 위해 검증된 생리학적 관련 시스템을 준비합니다.
- 어세이 개발을 위한 표준화되고 재현 가능하며 정량적인 변형 데이터를 제공합니다.
- 다양한 조건이나 화합물에 대한 신속하고 병렬적인 분석을 가능하게 합니다.
- 화합물로 유도된 구조적 변화의 신뢰할 수 있는 평가를 지원합니다.
중개 및 전임상 연구
- 단백질 구조에 대한 통찰을 질환 관련 세포 환경과 연계합니다.
- 세포 내 연구를 가능하게 하여 발견 단계부터 전임상 검증까지의 연속성을 제공합니다.
- 맥락 의존적인 단백질 역학을 포착함으로써 중개 연구의 위험을 줄입니다.
- 포괄적인 수식 맵핑을 통해 바이오마커 발굴을 지원합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
PIXY 플랫폼은 초기 발견, 리드 화합물 확인 및 중개 연구의 교차점에 위치하여, 가설 검증부터 전임상 검증까지의 원활한 진행을 가능하게 합니다.
- 발견 생물학(Discovery Biology): 세포 내 구조 분석을 신속하게 수행하여 가설 검증과 경로 규명을 가속화합니다.
- 스크리닝(Screening): 화합물 평가를 위해 분석 준비가 완료된 재현 가능하고 정량적인 결과물을 제공합니다.
- 분석(Analytics): 실험 조건 전반에 걸쳐 강력한 통계적 비교가 가능한 고함량 수정 데이터를 제공합니다.
- 중개 연구(Translational Research): 질환 관련 생체 시스템 연구를 지원함으로써 발견 단계와 전임상 단계 사이의 가교 역할을 합니다.
- 기업적 재사용(Enterprise Reuse): 다양한 단백질 표적 및 세포 모델에 적용 가능한 확장 가능하고 자동화된 플랫폼을 제공합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 표적 검증에서 예측 신뢰도를 높이고 메커니즘적 모호성을 줄입니다.
- 운영적 가치: 워크플로우를 표준화하고 재현성을 높이며 고처리량 확장성을 가능하게 합니다.
- 전략적 가치: 신속하고 실행 가능한 데이터를 제공함으로써 go/no-go 결정의 품질과 자본 효율성을 개선합니다.
- 포트폴리오 영향: 위험 조정 우선순위 설정과 발굴 및 전임상 자산의 진전을 지원합니다.
구현 시 고려사항
- 세포 배양, 질량 분석 및 광화학적 단백질 표지에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 환경 제어 기능과 통합 레이저 광학 장치가 갖춰진 플랫폼 인큐베이터를 사용할 수 있어야 합니다.
- 재현성을 위해 엄격한 무균 기술과 팀 간 표준화가 요구됩니다.
- 검증된 프로토콜 조정을 통해 다양한 세포주 및 표적 단백질에 적용 가능합니다.
- 처리량과 자동화 수준은 펌프, 소프트웨어 및 광학 정렬의 통합 상태에 따라 달라집니다.
바이오 제약 FAQ
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:45
Setting Up the Platform Incubator for IC-FPOP
2:08
IC-FPOP in the Platform Incubator
3:41
Results: Analysis of Cell Transfection Efficiency, Proteins Modified in Single Cell Flow-System and PIXY, and Localization of IC-FPOP Modifications
5:22
Conclusion
