Name: CRISPR/CasRx를 사용하여 드로소필라 멜라노가스터 에서 유비쿼터스 및 조직 별 RNA 표적화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: 학습하세요 CRISPR/CasRx를 활용한 Drosophila melanogaster 전체 및 조직 특이적 RNA 표적화 방법을. 이 기술은 유전자 기능 연구와 전사체 공학에 효율적인 도구를 제공합니다.

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이 작품은 DARPA 세이프 유전자 프로그램 보조금(HR0011-17-2-0047)과 NIH 어워드(R21RAI149161A, DP2AI152071)의 자금 지원을 받았습니다.

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O.S.A.는 Agragene, Inc.의 창립자이며 지분 지분을 가지고 있으며 회사의 과학 자문위원회에서 근무하고 있습니다. 이 협정의 조건은 이해 상충 정책에 따라 캘리포니아 대학, 샌디에고에 의해 검토되고 승인되었습니다. 다른 모든 저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.

CasRx 시스템의 세 가지 응용 프로그램 설계로,이 작품은 파리에서 생체 프로그래밍 가능한 RNA 타겟팅에서 입증되었습니다. 다른 전략은 내인성 대 외인성 유전자 표적화 및 조직 특정 RNA 표적화 대 유비쿼터스와 같은 다른 프로젝트 요구를 수용합니다. RNA 표적화의 효력은 CasRx 단백질 및 부수적 활동의 높은 발현과 관련되었던 표적 유전자 특정 표현성 변경, 표적 RNA 전사량 감소 및 간헐적인 치사성 표현형을 포함했습니다. 전반적으로, 이러한 결과는 CasRx 시스템이 프로그래밍 가능하고 효율적인 방식으로 유기체 수준에서 표적 RNA 전사감소가 가능한 것으로 나타났다.
CasRx 시스템의 성공적인 사용자 정의의 주요 요소 중 하나는 gRNA의 설계입니다. 구체적으로, 다음의 조언은 주의해야 한다: 표적 서열은 길이약 30뉴클레오티드, 표적 서열에서 폴리-U 뻗어의 길이는 4기층 이하이며, 표적 서열 GC 함량은 30% -70%의 범위에 있으며, 표적 서열은 강력한 RNA 헤어핀 구조를 형성할 것으로 예측되지 않으며, 표적 서열은 최소한의 예측 RNA 또는 대동맥 구조를 포함한다55.
gRNA 설계 외에도 각 프로토콜의 플라이 유전학 단계는 성공적인 구현에서도 중요합니다. 자손의 부모로부터 계승된 정의된 표현형의 존재 또는 부족은 트랜스페테로지구스 자손에서 CasRx 시스템에 의해 유도된 표현형을 식별하고 정량화하는 데 중요하다. 또한, dCasRx 파리를 병렬로 사용하여 제어 십자가를 설정하는 것은 또한 transheterozygous 자손에서 비 특이적 표현형을 배제하는 데 도움이됩니다.
이러한 결과 밝혀 독성 문제 유비 쿼터스 로 발현 CasRx 와 dCasRx 단백질 즉석에서, CasRx 시스템의 제한. Ubiq promotor에서 단독으로 CasRx 또는 dCasRx의 유비쿼터스 표현은 gRNAs없이, 비 사소한 피트니스 비용과 함께, Ubiq-CasRx 또는 Ubiq-dCasRx 파리는 homozygous 라인으로 설립 될 수 없습니다. 반대로, UASt-CasRx 및 UASt-dCasRx 파리는 건강한 호모자구스 주식으로 확립될 수 있지만, 크로스 계획의 설계로 인해 이중 균형 주식으로 유지되었지만 유비쿼터스 CasRx 단백질 발현에 의해 유발되는 독성의 존재를 뒷받침하는 사실이다. 또 다른 지원 증거는 dCasRx와 관련된 대조 실험에서, 이는 촉매적으로 비활성, F1 세대에 있는 파리의 총 수에서 dCasRx와 gRNA 구조물을 모두 운반하는 파리의 백분율은 일관되게 50% 보다 낮았다, dCasRx 관련 독성이 없는 경우에 Mendelian 유전학에 근거를 둔 예상비율. 이것은 gRNA와 함께 dCasRx를 유비쿼터스로 표현하는 것이 즉석에서 독성을 유도하여 예상보다 적은 상속 비율을 초래한다는 것을 나타냈습니다. transheterozygous UASt-dCasRx, gRNA, GAL4 파리의 상속 비율은 다시 CasRx와 dCasRx 단백질의 유비쿼터스 발현에 의해 특별히 유도된 독성을 건의하는 멘델리안 유전학을 따랐습니다. CRISPR/Cas 시스템의 독성은 새로운 것이 아닙니다. Cas9 단백질의 다량은 flies29,30,31,32를 포함하여 몇몇 유기체에서 유독한 것으로 나타났습니다. 최근 연구는 UAS-Cas9 construct33에서 UAS 서열과 Cas9 서열 사이의 다양한 길이의 개방 독서 프레임을 추가하여 파리에서 발현된 Cas9 단백질의 양을 조정할 수 있는 맞춤형 GAL4/UAS 시스템을 개발했습니다. 따라서 CasRx 단백질 발현 수준을 조정하여 CasRx 유도 독성을 줄이는 방법을 모색할 필요가 있습니다.
CasRx 및 dCasRx 단백질의 유비쿼터스 발현에 의해 유도된 독성 이외에, 결과는 또한 CasRx 시스템의 비특이적 부수적 인 오프 표적 효과에 연결된 치사성, 많은 CRISPR 시스템의 특징1,2,7,34를 보였다. CasRx 및 비 필수 유전자 gRNA 발현 이중 또는 삼중 환화구우스 파리, 예를 들어 노치를 대상으로 할 때, transheterozygous CasRx 파리는 transheterozgyous dCasRx 파리에 비해 생존율의 상당히 낮은 수준을 갖는다. 이들 CasRx 및 gRNA 발현 트랜게테로지구우스의 RNA-seq 분석에서 표적 유전자 전사량의 감소와 비표적 유전자 전사체의 감소가 모두 관찰되었다. 이러한 부수적 효과는 CasRx에 의존적이고 표적에 의존적이었으며, CasRx 단백질과 gRNA를 모두 표현하는 트랜스페테로지구우스 파리에서만 관찰되었습니다. 표적 유전자 중 하나인 흰색은 백색 유전자가 명확한 색소 감소 표현형과는 대조적으로 CasRx에 의해 표적으로 삼았을 때 성적증명서의 제한적, 비통계적으로 유의한 감소만을 보였다는 점을 지적할 가치가 있습니다. 이는 1) RNA-seq 샘플 수집의 타이밍이 백색 유전자가 초기 발달 시 피크 발현에 도달할 때타이밍과 잘 맞지 않았기 때문일 수 있으며, 2) 눈내 백색 유전자의 국소화된 발현은 전바디 샘플 수집만 가능할 때 초기 개발 단계에서 관련 조직을 수집하는 데 어려움을 겪고 있다. CasRx 시스템의 부수적 활동을 줄이기 위해, 미래의 연구는 유기체 수준에서 오프 타겟 현상 시스템의 근본적인 메커니즘을 완전히 이해하도록 요구됩니다.
흥미롭게도, 최근 연구35 파리에서 RNA 표적 Cas13 도구를 설명하는 것은 몇 가지 가능한 이유로 CasRx 발현과 관련된 일반적인 독성을 개량하는 것으로 나타났다. 첫째, 저자는 Drosophila 에서 표현을 최적화하기 위하여 Cas13 전염을 재코딩하고 본 연구 결과에서 사용된 유비퀴틴 프로모터에 비해 더 약한 표현 프로모터 (actin 5C)를 이용하고, 가능성이 Cas13 발현의 낮은 수준으로 이끌어 내고 따라서 더 적은 독성으로 이끌어 냅니다. 실제로, 이것은 UASt 중심의 CasRx및 dCasRx 발현이 이 연구 결과 (그리고 35의 저자)가 UASt-CasRx 파리에 있는 어떤 명백한 치사도 관찰하지 않았기 때문에, 그 자체로, 유독하지 않았다는 관측에 의해 지원됩니다. 더욱이, 이 저자는 그들의 발현에 영향을 미쳤을 지도 모르다 이 연구 결과에 비하여 그들의 gRNA를 다르게 인코딩하고 transheterozygous Cas13/gRNA 파리에 있는 시스템의 독성을 감소시켰습니다. 예를 들어, 연구에서 2gRNA는 U6:3 프로모터를 사용하여 발화되었고 TRNA에 의해 측면화되어 CasRx35를 요구하지 않고 tRNA 성숙시 gRNA 처리를 가능하게 했다. 반대로, 이 연구에서 gRNA는 유전자당 최대 4개의 위치를 대상으로 하는 어레이로 인코딩되었으며 박테리아에서 발견되는 내인성 Cas13 어레이 구조를 모방하여 각 gRNA를 처리하는 Cas13 효소를 필요로 합니다. 이러한 다른 접근은 gRNA 발현 수준 및 전체 시스템의 독성에 내재된 영향을 미칠 수 있는 그밖 요인에 있는 다름으로 이끌어 내수 수 있습니다. 마지막으로, Huynh 외. 대상-Cas/gRNA 상호 작용 및 부수적 활동에 차이 귀착되 고 치사의 관찰 된 수준에 영향을 미칠 수 있습니다 본 연구에서 대상 보다 다른 유전자를 대상으로. 관찰된 독성의 이러한 차이는 전체 시스템을 개선할 수 있는 방법을 확인하기 위해 추가 조사를 보증합니다.
전반적으로, 본 연구는 D. 멜라노가스터에서 기능적 유전적으로 인코딩된 프로그래밍 가능한 RNA 표적 Cas 시스템의 첫 번째 데모이며, CasRx 시스템의 추가 최적화(보고된 내용35에 따라)는 오프 타겟 관련 치사성을 더욱 감소시키고 표적 분열에 대한 CasRx의 효능을 증가시키는 데 필요할 것이다. Cas 효소를 가진 RNA 표적화는 곤충 벡터 제어에서 치료 사용에 이르기까지 많은 잠재적 인 응용 분야를 가진 급속하게 진화하는 분야입니다1,2,3,4,5,6,7, 이 프로토콜은 파리의 첫 번째 CasRx 시스템을 설계하는 데 관심이있는 사람을위한 스타터 패키지를 제공하며 시스템의 사용자 정의 및 추가 최적화와 호환됩니다. 여기에 제시된 예제에서는 이 시스템을 생체 내에서 구현하는 동안 발생할 수 있는 다양한 결과를 보여 주며 응용 프로그램에서 CasRx 시스템의 성능을 평가하는 다른 사용자의 벤치마크 역할을 할 수 있습니다.

클러스터드 의 출현 이후 정기적으로 간격 짧은 Palindromic 반복 (CRISPR) 기술, 이 분야에서 초점의 대부분은 DNA 편집에있었다, 이는 의학 및 생명 공학에 변형 응용 프로그램을 제공합니다1. 그러나 DNA 서열의 영구적인 변경은 윤리적 고려 사항으로 인해 항상 바람직하지는 않습니다. 이에 비추어, 최근 연구는 RNA를 표적으로 하는 CRISPR 기지를 둔 공구를 개발하기 시작하고 CRISPR 기술이 실제로 다양한 생물학 체계2,3,4,5,6,7에서 RNA 표적에 실제로 사용될 수 있다는 것을 보여주었습니다. 테스트된 많은 시스템에서, RNA 및 전사감소를 표적으로 하는 현재 널리 사용되는 접근법은 RNA 간섭(RNAi)이며, 이는 완벽하지 않으며, 생체 내에서 사용될 때 다양한 효능과 높은 오프타겟 활성을 종종 나타내고 있습니다.8,9,10,12,13,15,16,17 . 따라서 이러한 기술의 상태를 감안할 때 RNA 표적화를 위한 CRISPR 기반 도구의 잠재력을 더 탐구할 가치가 있습니다.
한 주목할만한 최근 연구는 Ribonuclease CasRx, Cas13d 클래스의 일원, 효율적으로 인간의 세포 배양에 있는 유전자 성적증명서 수준을 감소시킬 수 있고 매력적인 오프 표적 profile4를 소유한다는 것을 보고했습니다. 이 사실 인정은 이 새로운 ribonuclease가 유기체 수준에서 표적으로 하는 RNA를 위한 그것의 효험 그리고 낮은 오프 표적 비율을 유지할 수 있는지의 질문으로 이끌어 냈습니다. 최근 연구는 CasRx 시스템이 Drosophila melanogaster5에 있는 유비쿼터스 및 조직 특정 유전자 성적증명서 감소를 달성하기 위하여 이용될 수 있다는 것을 보여줌으로써 이 질문을 해결했습니다.
이 최근에 발표된 접근 방식의 유용성을 간소화하기 위해 이 프로토콜은 3가지 주요 부분으로 구성된 이 최근 작업의 방법을 자세히 설명합니다: 1) 2성분 CasRx 시스템을 사용하여 생체 RNA 표적화에서 유비쿼터스; 2) 3성분 CasRx 시스템을 이용한 생체 외인성 RNA 표적화에서 유비쿼터스; 및 3) 3성분 CasRx 시스템을 이용한 조직 특이적 생체내 RNA 표적.
유비쿼터스 프로모터의 통제 하에 상이한 표적 유전자를 표적으로 하는 가이드 RNA(gRNA)가 이러한 gRNA 함유 구조를 발현하는 플라이 라인을 설계하고 플라이 라인이 생성되었다. CasRx는 유비쿼터스 프로모터 또는 GAL4 전사 인자에 의해 활성화 가능한 조건부 업스트림 활성화 서열(UASt) 프로모터의 제어하에, 또한 이러한 CasRx 함유 구조물을 수용하는 라인을 설계및 플라이 라인으로 설계하였다. 촉매비활성 CasRx 구문인 dCasRx는 음의 컨트롤로 설계및 사용되었습니다. 파리에서 유비쿼터스 RNA 타겟팅은 유비쿼터스 캐스락스 표현 플라이 라인으로 gRNA 표현 플라이 라인을 교차하여 달성됩니다. 특정 유전자 전사체와 CasRx 단백질을 대상으로 하는 gRNA 구조를 모두 발현하는 자손은 표적 유전자 전사체의 유비쿼터스 감소를 갖는다. 파리에서 조직별 RNA 표적화는 UASt-CasRx가 파리를 발현하는 gRNA 발현 파리를 처음 건널때 달성되어 gRNA와 UASt-CasRx 구조를 모두 운반하는 트랜스헤터로즈구우스 파리를 얻습니다. 이러한 파리는 차례로 조직 별 GAL4 표현 파리와 교차하여 파리에서 조직별 CasRx 발현 및 RNA 표적화의 생성을 초래합니다.
CasRx 시스템의 프로그래밍 가능한 특성은 생체 내 RNA 표적화에 대한 높은 효능과 낮은 오프 타겟 활동을 달성하는 데 도움이 되는 사용자 정의 및 최적화가능성을 제공합니다. CRISPR 기반 RNA 표적팅의 잠재적인 응용 은 실험실에서 RNAi를 대체하고 야생에서 곤충 벡터 제어에 기여하는 것을 포함하여 수많은 것입니다. 후자의, 글로벌 충족 되지 않은 요구 중 하나는 모기를 통해 전송 하는 RNA 바이러스의 감염을 방지 하기 위해 효율적인 도구의 개발. 뎅기열, Zika 및 chikungunya 바이러스와 같은 많은 RNA 바이러스는 모기를 통해 전달되고, 인간의 건강에 영향을 미치고, 사망을 기여합니다. 질병 예방을 위한 바이러스 저항을 가진 공학 모기 인구를 위한 많은 제안이 만들어졌습니다; 그러나, 현재 기술은 모기가 모든 중요한 RNA 바이러스18,19,20,21,22,23에 동시에 저항하는 것을 만들 수 없습니다. RNA 표적화 Cas 시스템은 모든 모기 매개 RNA 바이러스를 표적으로 하는 프로그래밍 가능한 플랫폼을 가능하게 함으로써 이러한 기술에 대한 출발점을 제공할 수 있다.

<table><tbody><tr><td>100% 포도 주스</td><td>Welch Foods Inc.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>활성 건조 효모(908g)</td><td>Red Star Yeast Company, LLC</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>DMC4500 컬러 카메라</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMC4500</td><td></td></tr><tr><td>Dual-Luciferase Reporter Assay System</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td></td></tr><tr><td>GAL4-GMR 비행</td><td>블루밍턴 초파리 재고 센터</td><td>29967</td><td></td></tr><tr><td>GAL4-y 비행</td><td>블루밍턴 초파리 재고 센터</td><td>44373</td><td></td></tr><tr><td>Glomax 20/20 광도계</td><td>Promega</td><td>E5331</td><td></td></tr><tr><td>Illumina HiSeq2500 시퀀서</td><td>Illumina, Inc.</td><td>HiSeq2500</td><td></td></tr><tr><td>M165FC 형광 실체 현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td>M165FC</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop OneC UV-vis 분광 광도계</td><td>ThermoFisher</td><td>NDONEC-W</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II RNA 라이브러리 준비 키트</td><td>New England Biolabs, Inc.</td><td>E7770</td><td></td></tr><tr><td>plasmid # 112686</td><td>Addgene</td><td>112686</td><td></td></tr><tr><td>plasmid # 112688</td><td>Addgene</td><td>112688</td><td></td></tr><tr><td>plasmid # 132416</td><td>Addgene</td><td>132416</td><td></td></tr><tr><td>plasmid # 132417</td><td>Addgene</td><td>132417</td><td></td></tr><tr><td>plasmid # 132419</td><td>Addgene</td><td>132419</td><td></td></tr><tr><td>plasmid # 132420</td><td>Addgene</td><td>132420</td><td></td></tr><tr><td>plasmid # 132421</td><td>Addgene</td><td>132421</td><td></td></tr><tr><td>plasmid # 132422</td><td>Addgene</td><td>132422</td><td></td></tr><tr><td>plasmid # 132425</td><td>Addgene</td><td>132425</td><td></td></tr><tr><td>plasmid # 132426</td><td>Addgene</td><td>132426</td><td></td></tr><tr><td>plasmid # 133304</td><td>Addgene</td><td>133304</td><td></td></tr><tr><td>plasmid # 164586</td><td>Addgene</td><td>164586</td><td></td></tr><tr><td>플라스미드 #132418</td><td>Addgene</td><td>132418</td><td></td></tr><tr><td>plasmid pJFRC81</td><td>Addgene</td><td>36432</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>제한 엔도뉴클레아제 AscI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R0558L</td><td></td></tr><tr><td>제한 엔도뉴클레아제 NotI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R0189L</td><td></td></tr><tr><td>제한 엔도뉴클레아제 PacI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R0547L</td><td></td></tr><tr><td>제한 엔도뉴클레아제 PstI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R0140L</td><td></td></tr><tr><td>제한 엔도뉴클레아제 SwaI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R0604L</td><td></td></tr><tr><td>제한 엔도뉴클레아제 XbaI</td><td>New England Biolabs Inc.</td>생물 분석기 용 <td>R0145L</td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Pico Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Turbo DNase</td><td>Invitrogen</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>U6-3 : 4-gRNA-Fluc flys</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84125</td><td></td></tr><tr><td>U6-3 : 4-gRNA-GFP; OpIE2-GFP 비행</td> 블루<td>밍턴 초파리 재고 센터</td><td>84986</td><td></td></tr><tr><td>U6-3:4-gRNA-N 비행</td><td>블루밍턴 초파리 재고 센터</td><td>84122</td><td></td></tr><tr><td>U6-3:4-gRNA-w 비행</td><td>블루밍턴 초파리 재고 센터</td><td>84124</td><td></td></tr><tr><td>U6-3:4-gRNA-y 파리</td><td>블루밍턴 초파리 주식 센터</td><td>84123</td><td></td></tr><tr><td>UASt-CasRx 파리</td><td>블루밍턴 초파리 주식 센터</td><td>84121</td><td></td></tr><tr><td>UASt-dCasRx 비행</td> 블루<td>밍턴 초파리 재고 센터</td><td>84120</td><td></td></tr><tr><td>Ubiq-CasRx 비행</td><td>블루밍턴 초파리 재고 센터</td><td>84118</td><td></td></tr><tr><td>Ubiq-dCasRx 비행</td><td>블루밍턴 초파리 재고 센터</td><td>84119</td><td></td></tr><tr><td>Ubiq-Firefly-T2A-eGFP-Ubiq-Renilla 파리</td><td>블루밍턴 초파리 재고 센터</td><td>84127</td><td></td></tr><tr><td>자이모클린 젤 DNA 회수 키트</td><td>자이모 리서치 코퍼레이션</td><td>D4007</td><td></td></tr></tbody></table>

crispr/casrx를 사용하여 드로소필라 멜라노가스터 에서 유비쿼터스 및 조직 별 rna 표적화

Ubiquitous and Tissue-specific RNA Targeting in Drosophila Melanogaster using CRISPR/CasRx

CASRx, RNA 표적 Cas13 가족의 일원은, 세포와 유기체 수준 둘 다에 매력적인 오프 표적 단면도를 가진 효율적인 유전자 전사량 감소에 있는 CRISPR/Cas 기술의 유망한 새로운 추가입니다. 그것은 최근 CRISPR/CasRx 시스템은 Drosophila 멜라노가스터에 있는 유비쿼터스 및 조직 특정 유전자 성적증명서 감소를 달성하기 위하여 이용될 수 있다는 것을 보고됩니다. 본 논문은 2성분 CasRx 시스템을 이용하여 생체 내생 RNA 표적화의 3개 부분으로 구성된 최근 작업에서 의 방법을 자세히 설명한다. 2) 3성분 CasRx 시스템을 이용한 생체 외인성 RNA 표적화에서 유비쿼터스; 및 3) 3성분 CasRx 시스템을 이용한 생체 내 RNA 표적질내 조직별. 관찰된 RNA 표적화의 효력은 CasRx 단백질 및 부수적 활동의 높은 발현과 관련되었던 표적 유전자 특정 표현표 변경, 표적으로 한 RNA 전사량 감소 및 간헐적인 치사성 표현형을 포함합니다. 전반적으로, 이러한 결과는 CasRx 시스템이 프로그래밍 가능하고 효율적인 방식으로 유기체 수준에서 표적 RNA 전사 감소를 할 수 있음을 보여주었으며, 생체 내 전사 타겟팅, 엔지니어링이 실현 가능하고 생체 내 CRISPR 기반 RNA 표적화 기술의 미래를 위한 토대를 마련한다는 것을 입증했다.

2성분 CasRx 시스템을 이용한 생체 내 RNA 타겟팅 F1 트랜게테로지구우스파리는 Ubiq-CasRx와 gRNA(내인성 및 외인성 유전자 를 모두 표적으로) 구조체를 모두 발현하는 파리는 Ubiq-dCasRx 및 gRNA 구조물을 표현하는 대조군 파리에 비해 현저한 표현형을 보였다(도 2 및 도 4). 구체적으로, 트랜게테로지구우스 CasRx 파리는 아비크-카스릭스 시스템의 독성을 나타내는 트랜게테로즈기스 dCasRx 파리에 비해 생존율이 현저히 낮습니다(그림 2A 및 도 4A). 그것은 모두 transheterozygous CasRx와 dCasRx 파리는 미만 50% 상속 률, 멘델리안 유전학에 따라 예상 비율입니다 주목할 필요가있다. 세 가지 표적 유전자 중, Ubiq-CasRx/+; U6-gRNAN/+ 파리 및 Ubiq-CasRx/+; U6-gRNAy/+ 파리는 실행 불가능한(0% 상속)이며 두 번째 인스타 애벌레 단계(그림 2A-2B)를 넘어서는 성장하지 않았습니다. 살아남은 Ubiq-CasRx/+; U6-gRNAw/+ 파리, 상속은 12.9%,, 뚜렷한 완전 관통 백눈 표현형(그림 2B)을 보였다. CasRx와 관련되었던 관찰 가능한 특성 이외에, 우리는 3개의 표적 유전자를 위한 표적 유전자 전사체의 유의한 감소를 확인할 수 있었습니다: 노치, 황색 및 GFP (그림 2E-2G). 백색 유전자 전사체의 감소는 Ubiq-CasRx/+, U6-gRNAw/+ 파리에서 관찰되었으며, 대조군 Ubiq-dCasRx/+, U6-gRNAw/+ 파리에 비해 감소는 통계적으로 유의하지 는 않았지만(그림 2E - 2F). CasRx에 의해 유도된 오프 표적 활동의 증거는 dCasRx 표현 파리에서 CasRx 표현 파리및 견본에서 견본 사이 분별 전사체 를 비교할 때 찾아냈습니다 (그림 2E, 2G). 크게 차별화표현된 비표적 성적증명서의 수는 다음과 같습니다: 화이트, 253 (전체 성적증명서의 1.4%). 노치, 300 (1.7 %); 노란색, 41 (0.23 %); GFP, 5,880 (33%) (그림2G). 총 17,779개의 다른 성적증명서 중 6개의 비표적 성적증명서가 4개의 샘플 그룹에서 현저하게 분화되었다. 확인된 6개의 전사체 의 한은 Gadd45, 파리에서 세포 세포 체포에 관련되었던 유전자, CasRx의 효소 작용이 세포 세포 사멸을 직접 트리거하거나 간접적으로 그밖 유전자의 잘못된 표현을 시작할 수 있다는 가능성을 제기했습니다, 차례차례로 apoptosis로 이끌어 내는. 마지막으로, Ubiq-CasRx와 Ubiq-dCasRx 파리는 높은 유비쿼터스 표현에 의해 부여 된 독성으로 인해 동종 가우스 주식으로 설립되지 않았다는 점에 주목할 필요가있다. 그 결과, 이테로지구우스 Ubiq-CasRx/CyO 및 Ubiq-dCasRx/CyO 파리는 호모지구스 gRNA 플라이 라인으로 횡단하는 데 사용되었습니다. 요약하면, 2성분 Ubiq-CasRx 시스템은 관찰 가능한 표현형 및 성적증명서 감소를 초래하는 내인성 및 외인성 표적 모두에 대한 유비쿼터스 RNA 표적을 달성할 수 있다. 이러한 결과는 또한 CasRx 매개 RNA 표적화 생체 내에서 독성을 도입할 수 있음을 보여주었다.
3성분 CasRx 시스템을 이용한 생체 외인성 RNA 표적화유비쿼터스 2단계 십자가의 결과는 표적 유전자의 외인성 특성에도 불구하고 F2 트리플 트랜게터로지고테스(Ubiq-CasRx/+)에서 세 가지 전유전자를 모두 발현하는 것으로 나타났습니다. gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc)는 F2 트리플 트랜게터로즈고테스(Ubiq-dCasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) (3B-C-Figure 3B-C-CLuc)에서 치사도가 관찰되지 않은 Ubiq-dCasRx와 관련된 제어 십자가에 비해 100% 치사율을 초래했습니다. ). 보다 구체적으로 말하자면, 세 가지 전진(Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc)의 조합만 100% 치사율(그림 3B 및 D), 반면(Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/TM6) 및(Ubiq-CasRx/+;+;; Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/TM6) 유전자형은 실행 가능하고 예상멘델리안 전송 률과 일치하는 상속률과 표현형이 부족했습니다. Ubiq-CasRx/+ gRNAFluc와 함께 표적 시퀀스(즉, 반딧불 루시파라제)의 가용성이 관찰된 치사 성 표현형을 초래한 것으로 나타났습니다(아마도 Cas13 enzymes2,8의 부수적 인 활동에서 비롯된 것). . 또한 F1 트랜게터로지고트(Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/+ 또는 Ubiq-CasRx/+)의 상속에 대한 구별가능한 표현형이나 극적인 영향은 없습니다. Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/+)는 Ubiq-dCasRx 컨트롤(Ubiq-dCasRx/+; gRNAFluc/+ 또는 Ubiq-dCasRx/+;+; Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/+)(그림 3B)는 촉매 활성 효소가 관찰된 치사 성 표현형을 얻기 위해 필수적임을 나타냅니다. 또한, 모든 실행 가능한 유전자형의 파리의 Fluc 및 Rluc 발현 수준은 이중 루시파라제 리포터 컨트롤에 비해 Ubiq-dCasRx 삼중 환막(Ubiq-dCasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc)에서 Fluc 발현이 현저한 감소를 보이지 않았습니다. 이것은 Fluc 단백질 발현 수준이 dCasRx 표적화에 의해 감소되지 않았다는 것을 건의합니다 (그림 3D). 종합하면, 두 개의 다른 CasRx 매개 유비쿼터스 RNA 표적화 실험에서 일반적인 치사 성 표현형은 조직에 유비쿼터스로 사용될 때, CasRx 매개 RNA 표적화유기체에 독성이 있을 수 있음을 나타낸다.
3성분 CasRx 시스템을 이용한 조직 특이적 생체 내 RNA 표적 유비쿼터스 RNA 표적 실험에서 관찰된 높은 수준의 독성은 방법 섹션에 상세히 기술된 3성분 CasRx 시스템 설계를 사용하여 조직별 RNA 표적화를 탐구하도록 유도하였다. 실제로, 전체 CasRx 발현이 Ubiq 프로모터의 독성에 비해 UASt 프로모터를 사용하여 낮아졌을 때 관찰된 독성 수준이 감소하였고, 이것은 세 가지 측면에서 예시: 1) UASt-CasRx및 UASt-dCasRx 라인은 동형 저선으로 유지되었지만, 2 단계 크로스 방식 이중 균형 UASt-CasRx 및 UASt-dCasRx 라인은 십자가를 수행하는 데 사용되었지만, 2) 모든 F2 세대 dCasRx 트리플 트랜게테로지구스 상속률은 예상 25% 멘델리안 상속률과 일치하며, 3) F2 세대 CasRx 트리플 트랜게터로지구스 치사성 표현형은 적당히 감소하였다. 백색 표적 실험에서, F2 트리플 transheterozygotes에서 예상되는 25% 멘델리안 상속비율의, 단지 0.57% 실행 가능한 성인 파리 (UASt-CasRx/+; gRNAw/GMR-Gal4)는 관찰되었으며, 모두 심한 눈 특이적 색소 침착 및 형태학적 표현형(그림 4A 및 4B)을 나타냈다. 백색 표적 십자가의 경우, CasRx-표현 트리플 트랜게터로즈구스 F2 상속률은 dCasRx-표현 트리플 트랜게테로지구스 대조군(27.6%)보다 현저히 낮았다(그림 4A). 노치 표적 실험에서, 3개의 전염을 모두 운반하는 CasRx 표현 삼중 트랜지터로즈구스는 100% 치명적이었고, dCasRx 제어 상속율은 29.3%였다(그림 4A). 노란색 표적 실험에서, F2 트리플 트랜게테로지구우스 CasRx 표현, gRNAy 및 y-GAL4는 2.67%의 상속률을 가진 흉부 및 복부에 황색 표기의 작은 패치로 한계 치틴 안료 감소를 보였다, dCasRx 대조군 (Figure4A4A)보다 훨씬 낮은 ). 모든 dCasRx 제어 트리플 트랜게터로지구우스 파리는 CasRx 표현 파리로 명백한 표현형을 제시하지 않았다, CasRx의 촉매 활성이 관찰 표현형에 기여했음을 나타내는. CasRx 삼중 환화구우스 그룹의 낮은 상속률은 CasRx RNA 표적화에 존재하는 독성의 2개의 근원이 있다는 것을 건의했습니다: 하나는 CasRx의 높은 발현과 연관되고, 그 독성은 제한적인 CasRx 발현에 의해 감소되고, 다른 하나는 부수적인 활동과 연관된다. 종합하면, 이러한 결과는 CasRx 시스템이 고전적인 Gal4/UASt 시스템을 활용하여 생체 내 RNA 표적화에서 조직별 RNA 표적화를 달성할 수 있으며 그 동안 독성을 감소시키는 것으로 나타났다. 그러나, 독성 및 가끔 치사 성 표현형은 여전히 유비쿼터스 접근법에 비해 심각도의 낮은 수준에서 관찰되었다, 부수적 인 분열 활동이 독성과 연관되어 있음을 나타내는.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62154/62154fig01.jpg"> 도 1: Cas13D 시스템을 이용한 RNA 표적화의 일반적인 개요. (A) 2성분 CasRx 시스템을 이용하여 생체 내 RNA 표적화에서 1단계 유전적 교차의 회로도. (B) 3성분 CasRx 시스템을 이용하여 생체외 유발 RNA 표적화에서 유비쿼터스에서 2단계 유전적 교차의 회로도. (C) 3성분 CasRx 시스템을 이용하여 생체 내 RNA 표적화에서 2단계 유전적 교차의 회로도. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62154/62154fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62154/62154fig02.jpg"> 그림 2: 2성분 CasRx 시스템(reprinted5)을 사용하여 생체 내 RNA 표적화. (A) 비히크-카스릭스(또는 Ubiq-dCasRx) 및 gRNA를 상속하는 트랜게터로즈구스의 총 상속 비율. 상자 플롯의 파란색 그늘은 표현형 관통을 나타냅니다. (B) 대위원류의 표현형이 날아간다. 화살표는 눈에 조직 괴사를 나타냅니다. 'X'로 표시된 흑백 플라이는 치사성을 나타냅니다. (C) Ubiq-CasRx(또는 Ubiq-dCasRx) 및 gRNAGFP-OpIE2-GFP 파리 간 양방향 교차의 트랜게터로지구스의 총 상속 비율. M, CasRx의 모성 상속; P, CasRx의 아버지 상속. (D) 친자 십자가에서 F1 애벌레 자손. (E) 기록기의 최대 후방 은 로그산방 주름 변화에 대한 추정치입니다. DESeq2 파이프라인이 사용되었습니다. (F) CasRx 또는 dCasRx를 대상으로 백만 (TPM) 당 성적 증명서. (G) CasRx-depentent 는 전사체의 성적 증명서 비율을 다르게 표현하였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62154/62154fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62154/62154fig03.jpg"> 도 3: 3성분 CasRx 시스템을 이용한 생체 외인성 RNA 표적화에서 유비쿼터스(A) 2단계 유전적 교차의 회로도. (B) F2 세대에서 나타나는 모든 유전자형에 대한 총 상속 비율. F2 자손에서 세 가지 트랜스진(Ubiq-CasRx, Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc 및 gRNAFLuc)을 모두 상속하여 100% 치사를 초래했으며 Ubiq-dCasRx 삼중 트랜스헤터로지고트 대조군(p= 0.001, t-test)에 비해 현저히 낮았습니다. (C) Ubiq-CasRx/gRNAFluc 단독으로 운반하거나 Ubiq-CasRx및 Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc단독으로 운반하는 것은 심각한 치사율로 이어지지 않았으며, Ubiq-CasRx와 Ubiq-dCasRx transheterozygotes 사이의 상속 비율은 크게 다르지 않았습니다(p = 0.41 및 p = 0.51, t=t). (D) 루시파라제 비율은 Rluc 판독값으로 플루크 판독값을 정상화합니다. Ubiq-CasRx, Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc를 표현하는 트리플 트랜게테로지구우스 파리, gRNAFLuc는 "X"로 비행으로 표현된 배아 치명적인 것으로, 그 결과 루시파아제 발현을 측정하지 못했습니다. Ubiq-CasRx/+, Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/TM6의 Fluc/Rluc 비율, Stb transheterozygotes는 다른 Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc-rluc 표현 그룹(p = 1.2e-06 이하) 보다 현저히 낮았습니다. gRNAFLuc 전용 그룹의 결과는 다른 모든 그룹(p = 1.2e-06 이하, t-test)보다 현저히 낮았다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62154/62154fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62154/62154fig04.jpg"> 도 4: 3성분 CasRx 시스템(reprinted5)을 이용한 조직별 생체내 RNA 표적화( A) 3개의 트랜스게네스(UASt-CasRx 또는 UASt-dCasRx, gRNA 및 Gal4-driver)를 운반하는 삼중 트랜게터로즈구스의 총 상속 비율. (B) 삼중 환원류의 표현형이 날아간다. 흰색 화살표는 흉부에서 치틴 색소 감소를 나타냅니다. 'X'로 표시된 흑백 플라이는 치사성을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62154/62154fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>건설하다</td>
			<td>묘사</td>
			<td>입문서</td>
			<td>프라이머 시퀀스 (5'~ 3')</td>
			<td>PCR 템플릿</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">OA-1050E</td>
			<td rowspan="2">카스록스</td>
			<td>1050E. C3</td>
			<td>타타타트타트CCAC ATCTCTATTGAC CCGCAGATTAATTA ATGAGCCCCAAGA 아가아</td>
			<td rowspan="2">pNLS-RfxCas13d-NLS-HA (pCasRx)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1050E. C4</td>
			<td>카트가트GTTA TTTTAAAAACGATT 캐트크태그CT 타GCGTAATCTGG 아카아</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">OA-1050R</td>
			<td rowspan="2">dCasRx</td>
			<td>1050E. C3</td>
			<td>타타타트타트CCAC ATCTCTATTGAC CCGCAGATTAATTA ATGAGCCCCAAGA 아가아</td>
			<td rowspan="2">pNLS-dRfxCas13d-NLS-HA (pdCasRx)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1050E. C4</td>
			<td>카트가트GTTA TTTTAAAAACGATT 캐트크태그CT 타GCGTAATCTG 가카와</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">OA-1050L</td>
			<td rowspan="2">UASt 프로모터</td>
			<td>1041.C9</td>
			<td>GCGGGTTCTCGA CGGTCACGGGGG GCATGTCGACGC GGCCGCAACCAA 카카타태그</td>
			<td rowspan="2">pJFRC81</td>
		</tr>
<tr>
<td>1041.C11</td>
			<td>CTGGCCTCCACC TTTCTCtCtCTCT TGGGGCTCATGT 타아카카타트 CCCTATTCAGA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">카스록스</td>
			<td>1050L. C1</td>
			<td>아타카아가가 개트크가아타 GGGAATTGGGT TTAAACATGAGC CCCAAGA아가아</td>
			<td rowspan="2">pCasRx</td>
		</tr>
<tr>
<td>1050E. C4</td>
			<td>카트가트GT 타트타아아악 개트카티크타 GCTAGCTTAAG CGTAATCTGGA ACA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">OA-1050S</td>
			<td rowspan="2">UASt 프로모터</td>
			<td>1041.C9</td>
			<td>GCGGGTTCTC 가그그카그 GCGGGCATGT CGACGCGGCC GCAACCAACAA CACTAGTAG</td>
			<td rowspan="2">pJFRC81</td>
		</tr>
<tr>
<td>1041.C11</td>
			<td>CTGGCCTCCA CCTTTCTCTTC TTCTTGGGGGGCT 캣타아악 CCAATTCCCTA TTCAGA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">dCasRx</td>
			<td>1050L. C1</td>
			<td>아타카아가아그 아가액트크가트 아가트그그그 TTTAAACATGAG CCCCAA아가아가아</td>
			<td rowspan="2">pdCasRx</td>
		</tr>
<tr>
<td>1050E. C4</td>
			<td>카트가트GT 타트타아아악 개트캣츠택 CTAGCTTAAGCG 타트크가카</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">OA-1043</td>
			<td rowspan="2">U6:3 프로모터</td>
			<td>1043.C1</td>
			<td>GGGAATTGGGA ATTGGGCAATAT TTAAAATGGCGGC GCGCCGAATTCT TTTGCTCACCT</td>
			<td rowspan="2">애드진 플라스미드 #164586</td>
		</tr>
<tr>
<td>1043.C23</td>
			<td>아카타그츠가트 CTC타가그택 CGTTGCGGCCG 카아아아아에트GT 아타그CCTCA 아액트가크트 카카액트GCAG CCGACGTTAAT TGAAA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="6">OA-1052B</td>
			<td rowspan="2">우비크 프로모터</td>
			<td>1052B. C1</td>
			<td>GGGAATTGGGCA 아타타아타그C GGCTGCAGCGC GCAGATCGCCGAT</td>
			<td rowspan="2">애드진 플라스미드 #112686</td>
		</tr>
<tr>
<td>1052B. C2</td>
			<td>TTTTTTTTTGTTT TTGGCGTCTTCC ATCCTAGGTCTG CGGGTCAAAATA 가가트</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">T2A-eGFP</td>
			<td>908A1</td>
			<td>ATAAAGAG 아그GCGGAAAAA 가트CGCCGTGG 애그가가가가 아그넥트CTAACAT GC</td>
			<td rowspan="2">애드진 플라스미드 #112686</td>
		</tr>
<tr>
<td>908A2</td>
			<td>TTGTTTTAAAAAAAAAAAAAAAAA ACGATTCATTCTA GGCGCTTA CTTGTACAGCTC GTCCGCC</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">반전 된 Ubiq 프로모터</td>
			<td>908A3</td>
			<td>ACCGTGACCTAC ATCGTCGACACTA GTGGATCTCTAGA CGCGCAGATCGC CGATG</td>
			<td rowspan="2">애드진 플라스미드 #112686</td>
		</tr>
<tr>
<td>908A4</td>
			<td>GGATCATAAACTT TCGAAGTCATGC GGCCGCTCTGCG GGTCAAAATAGAG ATGT</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 이 연구에서 사용되는 분자 구조 및 프라이머 목록. 이 목록에는 모든 구문(ID 및 설명 모두)과 각 구문의 관련 프라이머(ID 및 시퀀스(5'~3')와 사용된 템플릿이 포함됩니다.

이 문서에서는 RNA 표적 Cas13D 효소(RfxCas13D)를 파리에서 사용하기 위한 상세한 프로토콜을 간략하게 설명합니다.

CRISPR/CasRx를 사용하여 드로소필라 멜라노가스터 에서 유비쿼터스 및 조직 별 RNA 표적화

CasRx, a member of the RNA-targeting Cas13 family, is a promising new addition of the CRISPR/Cas technologies in efficient gene transcript reduction with ...

우리의 프로토콜에서 볼 수 있듯이, CRISPR CasRx 기술은 과일 파리에서 유비쿼터스 및 조직 특정 유전자 성적 증명서 감소를 달성하기 위해 사용될 수 있습니다. 우리의 기술은 추가 사용자 정의 및 최적화와 호환되는 동안 과일 파리의 CRISPR 기반 유전자 성적 증명서 감소를 사용하는 데 관심이있는 사람을위한 스타터 패키지를 제공합니다. 두 가지 성분 CasRx 시스템을 사용하여 생체 RNA 타겟팅에서 유비쿼터스를 설정하려면, 균형 잡힌 이종구우스 UbRx CurlyO에서 호모지구스 gRNA 라인에서 10 명의 처녀 성인 여성 파리와 5 명의 성인 남성 파리를 수집합니다.부모의 파리를 100마이크로그램의 드라이 효모 파우더로 보충한 바이알에 넣고 26°C에서 48시간 동안 바이알을 후면합니다. F1 세대의 음모에서 새로운 성인 자손이 등장하고 10 초 동안 이산화탄소를 가진 성인 중 하나라도 마취했는지 확인하기 위해 매일 바이알을 관찰하십시오. 파리가 움직이지 않게되면 연속 이산화탄소가 있는 이산화탄소 탱크에 연결된 플라이 패드에 유리병을 비우고 형광 스테레오 현미경에 연결된 컬러 카메라를 사용하여 파리의 표현형을 점수화하고 이미지화합니다.그런 다음 형광 신호 발현에 따라 다른 표현형을 가진 자손의 수를 계산합니다. Mendelian 유전학에 근거하여, 자손의 50%는 표적으로 한 RNA를 표현하기 위하여 예상됩니다. Ubiq CasRx 시스템의 독성은 3 성분 CasRx 시스템을 사용하여 생체 외인성 RNA 표적화에 유비쿼터스를 설정하기 위해 자음을 표현하는 표적 RNA의 비율을 50 % 미만으로 줄일 수 있으며, 이중 루시파아를 표현하는 라인에서 8 ~10 명의 성인 여성 파리를 수집하고 균형 잡힌 쿠루시카스에서 4 ~5 명의 성인 남성 파리를 수집합니다. 흰색 눈, 곱슬 날개 및 ds 빨간 형광을 동시에 나타내는 STB 라인.100 마이크로그램의 드라이 효모 파우더로 보충된 바이알에 부모의 발걸음을 하나씩 놓고 이 십자가를 섭씨 26도에서 48시간 동안 리어로 배치합니다. 인큐베이션이 끝나면 각 바이알에서 모든 부모 파리를 제거하고 바이알을 섭씨 26도인큐베이터로 14일 이상 반환합니다. 14 일 동안, 앞서 언급 한 바와 같이 gRNA 라인을 세 번 대상으로 호마시구스 반딧불 루시파라제에서 8 ~10 여성 처녀를 수집합니다.매일 1개의 십자가 바이알을 관찰하여 새로운 성인 자손이 푸파에서 나타났는지 확인하고, 이산화탄소로 마취하여 Ubiq CasRx와 이중 루시파라제 기자를 모두 표현하는 4~5마리의 수컷 파리를 수집할 수 있습니다. gRNA 라인을 대상으로 열매 플라이 루시파라제에서 10 버진 암컷과 새로운 유리병에 파리를 배치하고, 48 시간 동안 26섭씨2의 십자가를 배치합니다. Ubiq CasRx와 이중 루시파라제 기자를 1단계 에서 모두 표현하는 5명의 노인 남성을 모아 26도에서 단독으로 2~4일 동안 파리를 배양한 후 섭씨 80도를 뺀 1.5밀리리터 원심분리기로 옮기십시오.인큐베이션이 끝나면 각 단계 2 크로스 바이알에서 모든 부모 바이알을 제거합니다. 그리고 바이알을 섭씨 26도인큐베이터로 20일 이상 반납한다. 매일 2개의 십자가 바이알을 관찰하여 새로운 성인 자손이 음모에서 나타났는지 확인하고, 이산화탄소로 파리를 마취하고, 입증된 바와 같이 표현형을 채점하고 이미징합니다.Mendelian 유전학은 모든 파리가 실행 가능한 경우에, 자손의 25%가 표적으로 한 RNA를 표현해야 한다는 것을 건의합니다. 루시파라제 분석기를 수행하려면, 시연된 바와 같이 삼중 이종화구파리와 컨트롤 플라이를 생성한다. 출생 시 수컷 파리를 모으고 3일까지 노화합니다.3일 된 파리를 1.5 밀리리터 원심분리관으로 옮기고, 시판되는 루시파라제 분석 키트에서 루시파라제 리시스 버퍼의 버퍼를 사용하여 리세합니다. 그런 다음 표준 루시파라제 분석 프로토콜에 따라 각 샘플 및 광미계에서 5개의 소리터를 사용하여 과일 파리와 실행된 Luciferase 활동을 모두 측정합니다. F1, 트랜스 이터로즈구우스 CasRx, 트랜스 이종화구우스 dCasRx 파리에 비해 상당히 낮은 생존율을 가지고있다.3개의 표적 유전자의 Ubiq CasRx 시스템의 독성을 확인하는 U6 gRNA Y 이종구는 실행 가능하지 않으며 두 번째 인스타 애벌레 단계를 넘어 성장하지 않습니다. 살아남은 Ubq CasRx 및 U6 gRNA W heterozygous 파리, 뚜렷한 완전히 관통 넓은 눈 표현형을 보여줍니다. 또한, 3개의 표적 유전자를 위한 표적 유전자 전사체의 현저한 감소도 관찰된다.CasRx에 의해 유도된 오프 표적 활동의 증거는 또한 파리를 표현하는 CasRx에서 샘플 과 시료 사이 차분형 전사체가 dCasRx 표현 파리에서 비교될 때 관찰됩니다. 2단계 십자가에서, 3개의 트랜스 유전자의 조합만이 100%의 치사성 으로 초래된다. 3개의 성분CasRx 시스템 설계를 이용한 조직 특이적 RNA 표적화가 사용되는 경우, Ubiq 프로모터에 비해 UAST 프로모터를 사용하여 전체 CasRx 발현이 낮아질 때 독성 수준이 감소된다.올바른 성별과 올바른 표현형의 파리를 사용하여 유전 적 과정을 올바르게 설정하는 것이 중요합니다.

ubiquitous-tissue-specific-rna-targeting-drosophila-melanogaster

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