Name: 형광 기반 측정 인스파디딜세린/포스파디딜리노시톨 4-인산염 교환 막 간 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: 학습하세요 형광 기반 프로토콜을 사용하여 인스파티딜세린과 포스파티딜리노시톨 4-인산염의 추출 및 전달을 측정하는 방법을. 이 기술은 Osh6p 단백질을 이용한 지질 전달 동역학을 정량화하여 진핵세포 막 내 지질 분포 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

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A. Cuttriss 박사가 원고를 주의 깊게 읽은 것에 대해 감사드립니다. 이 작품은 프랑스 국립 연구 기관 보조금 ExCHANGE (ANR-16-CE13-0006)와 CNRS에 의해 지원됩니다.

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

이러한 아세의 결과는 형광 지질 센서의 신호에 직접적으로 의존합니다. 따라서, NBD를 가진 1:1 비율로 표기된 이들 프로브의 정제는 무료 NBD 불소포아 오염 없이 이 프로토콜에서 중요한 단계이다. 또한 검사 중인 LTP가 제대로 접혀 집계되지 않았는지 확인해야 합니다. 추출 분석에서 테스트된 LTP의 양은 이 LTP가 이러한 지질을 효율적으로 추출하는지 여부를 적절하게 측정하기 위해 접근 가능한 PS 또는 PI(4)P 분자보다 동일하거나 높아야 합니다. 실제로, NBD-C2Lact 및 NBD-PHFAPP는 각각 고전적인 포화 결합 곡선에 따라 PS와 PI(4)P에 결합합니다. PS와 PI(4)P에 대한 각각의 친화성을 감안할 때, 이러한 프로브는 리포솜이 이러한 리간드의 잔류 흔적을 포함하더라도 리포솜에 크게 묶여 있습니다. 이것은 LTP가 효율적으로 이 지질을 추출하지 않는다는 잘못된 결론으로 이끌어 낼 수 있습니다. 이 프로토콜은 표준 및 시판 가능한 PC, PS 및 PI(4)P ...

다른 막 사이 및 진핵 세포의 막 내지질의 정확한 분포1,2는 심오한 생물학적 연루가 있습니다. LtP함수가 세포 생물학3,4,5,6에서중요한 문제이며 시험관 내 접근 방식은 이 문제점7,8,9,10,11을해결하는 데 큰 가치가 있다. 여기서, 체외,형광계 전략은 여러 ORP/Osh 단백질이 PS/PI(4)P 교환을세포막(12)과 형성하여 새로운 종류의 LtP를 구성하는 데 중요한 역할을 하고 있다. ER과 PM 사이의 그라데이션을 따라 분포되며, 여기서각각17,18,19의글리세로포스지질의 5-7%와 최대 30%를 나타낸다. 더욱이, PS는 본질적으로 PM의 세포소 전단지에 집중된다. 이 빌드업 및 PM에서 PS의 고르지 않은 파티션은 셀룰러 신호공정(19)에매우 중요합니다. PS 분자의 음전하로 인해 PM의 세포소 전단지는 다른 세포기관1, 2,19,20의세포소 잎보다 훨씬 더 음이온적이다. 이를 통해 정전기력을 통해 채용할 수 있습니다. myristoylated alanine-rich C-kinase 기판 (MARCKS)21,육종 (Src)22,커스틴 쥐 육종 바이러스 종양 유전자 (K-Ras)23,및 Ras 관련 C3 보툴리눔 독소 기판 1 (Rac1) 기판 기판 1 (Rac1) 기판 과 같은 신호 단백질의 산산과 산의 잔디를 긍정적으로 함유하고 있습니다.
PS는 또한 C2도메인(25)을 통해 고정관시 선택적 방식으로 종래의 단백질 키나제 C에 의해 인식된다. 그러나 PS는 ER26에서합성되어 해당 역할을 하기 전에 PM으로 내보내야 한다는 것을 나타냅니다. 효모, Osh6p 및 Osh7p 전송 PS가 ER에서 PM27로전송되는 것을 발견할 때까지19이 어떻게 달성되었는지는 알려지지 않았습니다. 이 LtP는 그의 창립 멤버가 OSBP이고 단백질을 포함하는 진핵생물에 있는 진화적으로 보존된 가족에 속합니다 (인간에 있는 ORP, 효모에 있는 Osh 단백질) 지질 분자를 호스트하는 주머니와 OSBP 관련 도메인 (ORD)를 통합합니다. Osh6p 및 Osh7p는 구조적인 특징이 PS를 특별히 결합하고 멤브레인 간에 전송하도록 조정된 ORD로만 구성됩니다. 그럼에도 불구하고, 이러한 단백질이 ER에서 PM으로 PS를 방향으로 옮기는 방법은 불분명했습니다. Osh6p 및 Osh7p는 PI(4)P를 대체 지질 리간드12로트랩할 수 있다. 효모에서 PI(4)P는 골기내의 포스파디딜리노시톨(PI)과 PM에서 PI 4키나아제, 픽1p 및 Stt4p에 의해 각각 합성된다. 대조적으로, ER 멤브레인에는 PI(4)P가 없으며, 이 지질은 Sac1p 인스파타제에 의해 PI로 가수분해되기 때문이다. 따라서 ER/골기 및 ER/PM 인터페이스모두에 PI(4)P 그라데이션이 존재합니다. Osh6p 및 Osh7p 는 이 두 멤브레인(12) 사이에 존재하는 PI(4)P 그라데이션을 사용하여 PS/PI(4)P 교환 주기를 통해 ER에서 PM으로 PS를 전송한다.
한 주기 내에서, Osh6p는 ER로부터 PS를 추출하고, PM에서 PI(4)P에 대한 PS를 교환하고 PI(4)P를 ER로 다시 전송하여 다른 PS 분자를 추출한다. Osh6p/Osh7p는 Ist2p28과상호작용하며, ER 멤브레인과 PM을 서로 가깝게 연결하고 가져와서29,30,31에서ER-PM 접촉 부위를 생성한다. 또한, Osh6p의 부정적 하전 멤브레인과의 결합은 단백질이 정전기 특징을 수정하는 변형 변화로 인해 지질 리간드 중 하나를 추출하는 즉시 약해진다32. 이를 통해 Osh6p는 멤브레인 거주 시간을 단축하여 지질 전달 활동의 효율성을 유지합니다. Ist2p에 바인딩과 결합, 이 메커니즘은 빠르고 정확하게 ER / PM 인터페이스에서 지질 교환을 실행하는 Osh6p / 7p를 할 수 있습니다. 인간 세포에서, ORP5 및 ORP8 단백질은 뚜렷한 메커니즘을 통해 ER-PM 접촉 부위에서 PS/PI(4)P 교환을 실행한다33. 그들은 Osh6p와 유사한 중앙 ORD를 가지고 있지만, 직접 C 단자 막 세그먼트(33)를 통해 ER에 고정되고 PI (4)P및 PI (4,5)P233,34,35를인식하는 N 단말 플레크스트린 homology (PH) 도메인을 통해 PM에 도킹된다. ORP5/8은 PS를 전송하기 위해 PI(4)P를 사용하며, ORP5/8은 PM PI(4,5)P2 레벨을 추가로 조절하고 신호 경로를 조절하는 것으로 나타났다. 차례로, PI (4)P및 PI (4,5)P2 수준의 감소는 이러한 단백질이 PIP 의존적 방식으로 PM과 연관됨에 따라 ORP5 / ORP8 활성을 낮춥니다. 렌츠-마예스키 증후군으로 이어지는 비정상적으로 높은 PS 합성은 ORP5/836을통해 PI(4)P 수준에 영향을 미칩니다. 두 단백질의 활성이 막히면 PS가 PM에서 덜 풍부해져서단백질(37)의온코겐성 능력을 저하시한다.
반대로, ORP5 과발현은 암세포 침입 및 전이성과정(38)을촉진하는 것으로 보인다. 따라서, ORP5/8 활성에 대한 변경은 지질 항상성의 변화를 통해 세포 행동을 심각하게 수정할 수 있다. 또한, ORP5 및 ORP8은 ER-미토콘드리아 접촉 부위를 점유하고 PS39를공급함으로써 일부 미토콘드리아 기능을 보존한다. 또한, ORP5는 ER-지질 물방울 접촉 부위에 국한하여 PS/PI(4)P 교환40을통해 지질 방울에 PS를 전달한다. 본 명세서에 기재된 전략은 (i) 리포솜및 (ii) PS와 PI(4)P로부터 추출을 측정하기 위해 고안되어 Osh6p/Osh7p12,32의 PS/PI(4)P 교환활성을확립및 분석하기 위해 고안되었으며, 다른 그룹에서 ORP5/ORPP및10PS의활성을 분석하기 위해 사용되었다. 41. 각각 PS와 PI(4)P를 검출할 수 있는 형광판 판독기, 표준 L-포맷 분광계 및 2개의 형광 센서인 NBD-C2Lact 및 NBD-PHFAPP의사용을 기반으로 합니다.
NBD-C2Lact는 추정된 PS 결합 부위 근처에서 고유한 용매 노출 시스테인을 포함하도록 재설계된 당단백질, 락타데린의 C2 도메인에 대응한다. 극성 민감성 NBD(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸) 불소호레는 이 잔류물(도1A)12에이와 함께 연결된다. 보다 정확하게 말하자면, 락타데린의 C2 도메인(보스 타우러스, UniProt: Q95114, 잔류물 270-427)은 에셰리히아 대장균의글루타티온 S-transferase(GST)와 융합하여 발현되는 pGEX-4T3 벡터로 복제되었다. 그런 다음 C2Lact 서열은 두 개의 용매 접근 시스테인 잔류물을 대체하기 위해 돌연변이되었다(C270, C427) 알라닌 잔류물을 사용하여 이후에 N,N'-로 표시될 수 있는 퍼티제 PS 결합 부위(H352C 돌연변이) 근처의 부위에 시스테인 잔류물을 도입 디메틸-N-(요오도아세틸)-N'-(7-니트로벤츠-2-옥사-1,3-디아솔-4-yl) 에틸렌 디아민(IANBD) 12. 혈소판에 대한 분열 부위는 C2 도메인의 GST 단백질과 N-종점 사이에 존재한다. 주요 장점은 이 도메인이 다른 알려진 C2 도메인 또는 부속서 A542에반하는 Ca2+독립적인 방식으로 PS를 선택적으로 인식한다는 것입니다. NBD-PHFAPP는 인간 4-인산염 어댑터 단백질 1(FAPP1)의 PH 도메인으로부터 유래되었으며, 이는 PI(4)P 결합부위(도 1A)43근처의 NBD 그룹으로 표지될 수 있는 단일 용매 노출 시스테인을 포함하도록 재설계되었습니다. 인간 FAPP 단백질의 PH 도메인의 뉴클레오티드 서열(UniProt: Q9HB20, 세그먼트 [1-100])은 GST 태그와 함께 발현되는 pGEX-4T3 벡터로 복제되었다. PHFAPP 서열은단백질(43)의막 결합 인터페이스 내에서 고유한 시스테인 잔류물을 삽입하도록 변형되었다. 더욱이, 프로테아제에 대한 접근성을 보장하기 위해 혈전 분열 부위와 PH 도메인의 N-종자 사이에 9잔류 링커가 도입되었다.
리포솜에서 PS 추출을 측정하려면, NBD-C2Lact는 PS에 대한 친화력으로 인해 미량의 PS를 함유하는 인산염(PC)으로 만든 리포솜과 혼합되어 있으며, 이 구조는 리포솜에 결합하고, NBD 형광은 뇌의 소수성 환경과 접촉함에 따라 극성의 변화를 경험하며, 이는 조류가 증가하고 이는 조류가 증가한다. PS가 LTP의 stoichiometric 양에 의해 거의 완전히 추출되는 경우, 프로브는 리포솜과 연결되지 않으며, NBD 신호는 더낮다(도 1B)32. 신호의 이러한 차이는 LTP(예를들어, Osh6p)가 PS를 추출하는지 여부를 결정하는 데 사용됩니다. 유사한전략은 이전에 설명된 바와 같이 PI(4)P 추출(도1B)을측정하기 위해 NBD-PHFAPP와 함께사용된다. 두 개의 FRET 기반 아세약은 (i) LA에서 LB 리포솜으로 PS 수송을 측정하도록 설계되었으며, 이는 각각 ER 멤브레인과 PM을 모방하고(ii) PI(4)P를 역방향으로 수송하도록 설계되었습니다. 이러한 소는 PS/PI(4)P 교환을 측정하기 위해 동일한조건(즉, 동일한 완충, 온도 및 지질 농도)에서수행됩니다. PS 수송을 측정하기 위해, NBD-C2Lact는 PC로 구성된 LA 리포솜과 혼합되어 5 mol% PS와 2 mol%의 형광 로다민 라벨인 포스파디들레타놀라민(Rhod-PE)과 LB 리포솜이 5mol% PI(4)P를 통합한 것으로 나타났다.
시간 제로, Rhod-PE와 FRET는 NBD 형광을 담금질. PS가LA에서 LB 리포솜(예를들어, Osh6p주입 시)으로 수송되는 경우,LA에서 LB 리포좀(도1C)으로NBD-C2Lact 분자의 전역으로 인해 빠른 분해가 발생한다. 접근 가능한 PS의 양을 감안할 때, NBD-C2Lact는 실험(12)의과정을 통해 멤브레인 바운드 상태로 본질적으로 남아 있다. 따라서, NBD 신호의 강도는 LA와 LB 리포솜 사이의 NBD-C2Lact의 분포와 직접 상관관계가 있으며 쉽게 정규화되어 얼마나 많은 PS가 전달되는지 결정할 수 있다. 반대 방향으로 PI(4)P의 전송을 측정하기 위해, NBD-PHFAPP는 LA 및 LB 리포솜과 혼합된다; PI(4)P를 포함하는 LB 리포솜에만 결합하지만 Rhod-PE가 아니라는 점을 감안할 때 형광은 높습니다. PI(4)P가 LA 리포솜으로 옮겨지면 이러한 리포솜으로 배회되고, 로드-PE(도1C)를가진 FRET로 인해 신호가 감소한다. 신호는 정규화되어43로전송되는 PI(4)P양을 결정합니다.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; L-시스테인 &ge; 97 % (FG)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>W326305-100G</td><td>물에 10mM L-시스테인 원액을 준비합니다. 부분 표본은 -20 &deg에 저장됩니다. C</td></tr><tr><td>2 mL 앰버 바이알, PTFE/Rub Lnr, CHCL3</td><td>Wheaton</td><td>W224681</td><td></td></tr><tr><td>4 mm 직경의 유리 구슬</td><td>Sigma</td><td>Z265934-1EA</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 코니컬 원심분리기 튜브</td><td>Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&Auml의 지질 저장용; KTA 청정기</td><td>GE 헬스케어</td><td></td><td>FPLC</td></tr><tr><td>알루미늄 호일</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15는 MWCO가 3 및 10 kDa</td><td>Merck</td><td>UFC900324이고, UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4는 MWCO가 3 및 10 kDa</td><td>Merck</td><td>UFC800324이며, UFC801024</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td></td><td></td><td>은 여과 및 멸균된 물로 50 mg/mL 재고 용액을 준비하고 -20 & deg;C입니다.</td></tr><tr><td>Bestatin</td><td>Sigma</td><td>B8385-10mg</td><td></td></tr><tr><td>BL21 골드 컴피턴트 셀</td><td>애질런트</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C16:0 Liss&nbsp; (Rhod-PE) in CHCl3 (1 mg/mL)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810158C-5MG</td><td></td></tr><tr><td>C16:0/C16:0-PI(4)P&nbsp; &nbsp;</td><td>Echelon Lipids</td><td>P-4016-3</td>은 <td>1mg의 C16:0/C16:0-PI(4)P 분말을 250 &micro에 용해시킵니다. MeOH의 L 및 250 &마이크로; CHCl3의 L. 그런 다음 CHCl3를 1mL로 만듭니다. 해결책이 명확해져야 합니다.</td></tr><tr><td>CHCl3(10mg/mL)의 C16:0/C18:1-PS(POPS)</td><td></td><td></td>CHCl3(25mg/mL)의 C18:1/C18:1-PC(DOPC)Avanti 극성 지질 850375C-500mg CaCl2&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td></td><td>물에 10mM CaCl2 원액을 준비합니다.</td></tr><tr><td>세포 교란 물질</td><td>상수 역학</td><td></td><td></td></tr><tr><td>클로로포름(CHCl3) RPE-ISO</td><td>Carlo Erba</td><td>438601</td><td></td></tr><tr><td>완전한 EDTA 무함유 프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td>탈이온(Milli-Q) 물</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>디메틸포름아미드(DMF), 무수, >99% 순수</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNAse I 재조합, RNAse 무료, 분말내</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Euromedex</td><td>EU0006-B</td><td>Milli-Q 물에 1 M DTT 원액을 준비합니다. 1mL 부분 표본을 준비하고 -20°C에서 보관합니다.</td></tr><tr><td>Econo-Pac 크로마토그래피 컬럼(1.5 &times; 12 cm).</td><td>Biorad</td><td>7321010</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation 큐벳 2 mm</td><td>Ozyme</td><td>EP102</td><td></td></tr><tr><td>Electroporator Eppendorf 2510</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fixed-Angle Rotor Ti45 and Ti45 tubes</td><td>Beckman</td><td>Spinning the batcerial lysate</td><td></td></tr><tr><td>Glass-syringes (10, 25, and 50 &micro; L) 형광 실험용</td><td>Hamilton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass-syringes (25, 100, 250, 500, and 1000 &micro; L) 지질 원료 용액 처리</td><td>Hamilton</td><td>1702RNR, 1710RNR, 1725RNR, 1750RN type3, 1001RN</td><td></td></tr><tr><td>글루타티온 세파로스 4B 비드</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0756-05</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤 (99% 순수)</td><td>Sigma</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>캡이 있는</td><td></td><td></td><td></td>용혈</tr>관 <tr><td>HEPES, >99% 순수</td><td>Sigma</td><td>H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>Illustra NAP 10 탈염 컬럼</td><td>GE 헬스케어</td><td>GE17-0854-02</td><td></td></tr><tr><td>이소프로필 &베타;-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)&nbsp;</td><td>Euromedex</td><td>EU0008-B</td>는 <td>Milli-Qwater에서 1M IPTG 원액을 준비합니다. 1mL 부분 표본을 준비하고 -20°C에서 보관합니다.</td></tr><tr><td>K-Acetate</td><td>Prolabo</td><td>26664.293</td><td></td></tr><tr><td>Lennox LB 포도당</td><td></td><td></td>이 없는 육수 배지 <td>milli-Q 물로 제조하고 오토클레이브합니다.</td></tr><tr><td>액체 질소</td><td>린데</td><td></td><td></td></tr><tr><td>메탄올 (MeOH) &ge; 99.8%</td><td>VWR</td><td>20847.24</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td></td><td>2 M MgCl2 용액을 준비합니다. 0.45 &micro를 사용하여 용액을 필터링합니다. M 필터.&nbsp;</td></tr><tr><td>Microplate 96 Well PS F-Botom Black Non-Binding</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655900</td><td></td></tr><tr><td>미니 압출기, 1mL 기밀 Hamilton 주사기 2개</td><td>, Avanti Polar Lipids</td><td>610023</td><td></td></tr><tr><td>모노크로메이터 기반 형광 플레이트 리더</td>, <td>TECAN</td><td>M1000 Pro</td><td></td></tr><tr><td>N,N'-Dimethyl-N-(Iodoacetyl)-N'-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Ethylenediamine) (IANBD 아미드)</td><td>분자 프로브는</td><td></td><td>2.5mL의 디메틸설폭사이드(DMSO)에 25mg의 IANBD를 용해하고 100 &micro의 25개 부분 표본을 준비합니다. 1.5mL 나사 캡 튜브의 L. 캡을 완전히 조이지 마십시오. 그런 다음 동결 건조기에서 DMSO를 제거하여 튜브당 1mg의 건조 IANBD를 얻습니다. 튜브는 닫히고 -20 &deg에서 보관됩니다. 어둠 속의 C.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>시그마</td><td>S3014-1KG</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM NaH2PO4, 1.8 mM KH2PO4, 4°C에서 고압멸균 및 보관.</td></tr><tr><td>배 모양의 유리 플라스크 (25 mL, 14/23, Duran 유리)</td><td>Duran Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin</td><td>Sigma</td><td>p5318-25mg</td><td></td></tr><tr><td>pGEX-C2LACT&nbsp; plasmid</td><td></td><td></td><td>우리 실험실에서 요청 시 사용 가능</td></tr><tr><td>pGEX-PHFAPP 우리</td><td></td><td></td><td>실험실에서 요청 시 사용</td></tr><tr><td>가능 Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) &지; 98.5% (GC)</td><td>Sigma</td><td>P7626-25g</td> 공극 크기가 0.2 &micro인 이소프로판올 포스포라미돈 Sigma R7385-10mg <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>폴리카보네이트 필터(직경 19mm)에 200mM PMSF 원액을 준비합니다. m</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610006</td><td></td></tr><tr><td>Poly-Prep 크로마토그래피 컬럼(0-2 mL 베드 용량 및 10 mL 리저브 포함)Biorad</td><td></td> <td>7311550</td><td></td></tr><tr><td>Prefilters(직경 10 mm).</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610014</td><td></td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>http://pymol.org/</td><td></td> <td>단백질의 3D 모델 구성(그림 1A)</td></tr><tr><td>UV/가시광선 형광용 석영 큐벳(최소 부피 600 &micro; L)</td><td>Hellma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>석영 큐벳</td><td>Hellma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>냉장 원심분리기&nbsp; Eppendorf 5427R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotary evaporator</td><td>Buchi</td><td>B-100</td><td></td></tr><tr><td>Screw-cap microcentriguge tubes (1.5 mL)</td><td>Sarsted</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Small magnetic PFTE stirring bar (5 &times; 2 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Snap-cap microcentriguge tube (0.5, 1, and 2 mL)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYPRO orange</td><td></td><td></td><td>SDS-PAGE 젤에서 단백질을 검출하기 위한 형광 염색</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Starlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>THROMBIN, 인간 플라즈마</td><td>Sigma</td><td>10602400001</td><td>20 단위를 1 mL의 milli-Q 물에 용해시키고 25 &micro를 준비합니다. 0.5 mL Eppendorf tube의 L 분취량. 그런 다음 얼리고 -80 &deg;C에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>Tris, 초순수</td><td>MP</td><td>819623</td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기 L90K</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV/가시광선 분광 광도계</td><td>SAFAS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV/가시광선 분광광도계 온도 제어 셀 홀더 및 교반 장치가 있는</td><td>Jasco 또는 Shimadzu</td><td>Jasco FP-8300 또는 Shimadzu RF-5301PC</td><td></td></tr><tr><td>진공 챔버</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sephacryl S200HR로 패킹된</td> 수조 Julabo <td></td> XK 70/200 컬럼 GE 헬스케어 <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

형광 기반 측정 인스파디딜세린/포스파디딜리노시톨 4-인산염 교환 막 간

Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes

진화적으로 보존된 옥시스테롤 결합 단백질(OSBP)-관련 단백질(ORP)/OSBP 동종학(Osh) 패밀리의 몇몇 구성원은 최근 효모 및 인간 세포에서 새로운 지질 전달 단백질(LTP) 그룹을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 그들은 내피 성 망상 (ER)에서 PS /phosphatidylinosol 4-인산염 (PI(4)P) 교환 주기를 통해 혈장 막 (PM)으로 인산화 (PS)를 전송합니다. 이 발견은 신호 프로세스에 중요한 PS가 세포 전체에 분포되는 방법과 이 과정과 인포이노시타이드 (PIP) 대사 사이의 링크의 조사를 더 잘 이해할 수 있게 합니다. 새로운 형광 기반 프로토콜의 개발은 분자 수준에서 시험관내의 이 새로운 세포 기계장치의 발견 그리고 특성화에 중요한 역할을 했습니다. 이 논문은 두 개의 형광 표기 지질 센서, NBD-C2Lact 및 NBD-PHFAPP의생산 및 사용을 설명하며, PS 또는 PI(4)P를 추출하는 단백질의 능력을 측정하고 인공 막 사이에 이러한 지질을 전달합니다. 첫째, 프로토콜은 이 두 구문중의 고순도 샘플을 생성, 레이블 및 얻는 방법을 설명합니다. 둘째, 이 논문은 Osh6p를 사례 연구로 사용하여 단백질이 리포솜에서 PS 또는 PI(4)P를 추출할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 형광 마이크로 플레이트 판독기와 이러한 센서를 사용하는 방법을 설명합니다. 마지막으로, 이 프로토콜은 정의된 지질 조성물의 지질성 간의 PS/PI(4)P 교환의 운동학을 정확하게 측정하고 표준 형광계를 사용하여 형광 공명 에너지 전달(FRET)에 의한 지질 전달 속도를 결정하는 방법을 보여줍니다.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62177/62177fig01.jpg"> 그림 1: 형광 지질 센서 및 시험관 내 작용에 대한 설명. (A)소 락타데린의 C2 도메인의 결정 구조를 기반으로 NBD-C2Lact 및 NBD-PHFAPP의 3차원 모델 (PDB ID: 3BN648)및 인간 FAPP1 단백질(PDB4K4K)의 PH 도메인의 NMR 구조(PDB4K: ID). An N,N'-dimethyl-N -(티오아세틸)-N'-(7-니트로벤츠-2-옥사-1,3-diazol-4-yl)에틸렌디아민모에티, 수동으로 그리고 정력적으로 최소화,...

여기서, 우리는 단백질 추출물과 트랜스포파디딜리노시톨 4-인산염이 체외에서인산염을 배출하는지 여부를 결정하기 위해 형광 지질 센서와 리포좀을 사용하는 프로토콜을 설명합니다.

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found ...

이 방법은 형광을 사용하여 단백질이 합성 막 사이의 생물학적으로 중요한 liqids로 전달되는지 확인하고 따라서 진핵 세포 내부의 이러한 지질 분포에 기여합니다. 이 기술은 단백질에 의한 천연 지질의 추출 및 수송을 가능하게 하며, 쉽게 만들 수 있는 형광 세포와 리포솜이 필요합니다. 이 방법은 장기와 막 사이의 몇 가지 필수 지질의 분포 뒤에 단백질에 의해 세포 생물학에 대한 통찰력을 얻기 위해 사용하고 수정 할 수 있습니다.시각적 데모는 형광에 의한 지질 전달의 실시간 측정을 수행하는 방법을 설명하는 것이 중요합니다. 그래서 절차를 시연하는 것은 또한 Maud Magdeleine, 내 실험실에 대한 엔지니어가 될 것입니다. 먼저 신선한 여과 및 탈가스 HEPES 칼륨 아세테이트 버퍼를 준비하여 1밀리알라 마그네슘 염화 마그네슘으로 보충하여 HKM 버퍼를 형성합니다.그런 다음 PC로만 만들거나 2개의 어금니 퍼센트 PS 또는 PI(4)P로 도핑된 리포솜을 준비합니다. 이제 플라스크를 회전 증발기위에 놓고 지질을 진공 상태에서 건조시하십시오. 한 가지 잘, 지질 센서, NBD-C2 Lact와 두 어진 퍼센트 PS를 포함하는 리포솜을 혼합, 250 나노 몰러와 100 마이크로 리터의 최종 농도.3개의 마이크로몰라 지질 전달 단백질 또는 LTP와 혼합된 리포솜 및 NBD-C2 수질의 동일한 양으로 두 번째 를 잘 채웁니다. 순수 80 마이크로몰러 PC 리포솜과 순수한 80 마이크로 몰러 PC 리포좀과 네 번째 잘 혼합 250 나노 몰러 NBD-C2 lact와 세 번째 잘 채우기. 이 단계를 반복하여 세 개의 우물 시리즈를 추가로 준비합니다.그런 다음 형광 판독기에 멀티 웰 플레이트를 배치합니다. 각 웰에 대해 25섭씨 490 나노미터에서 5나노미터 대역폭을 가진 505~650나노미터의 NBD 스펙트럼을 기록한다. 각 계열에 대해 다른 스펙트럼에서 리포솜만으로 기록된 스펙트럼을 뺍니다.PI(4)P 추출 분석의 경우 2개의 어금니 퍼센트 인산염으로 도핑된 리포솜을 준비하고 NBD-PH FAPP 프로브로 측정을 수행한다. 제어 실험을 수행하고 추출 비율을 결정합니다. 압출 리포솜을 마친 후 이 압출 된 리포좀으로 튜브를 채웁니다.갓 탈가스 및 여과된 HKM 버퍼를 준비하고 압출 된 리포솜을 실내 온도에서 유지하는 튜브를 유지하십시오. 알루미늄 호일에 인산염으로 표시된 로다민이 함유된 리포솜을 감싸고 불투명한 상자에 보관

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 비디오에서는 미세유체 플랫폼이라고 하는 지지된 지질 이중층의 포스파티딜에탄올아민 지질에 태그가 지정된 pH 민감 형광 염료를 사용하여 pH 조절 분석을 사용하여 미세유체 패턴의 단백질-포스포이노시티드 상호 작용을 시연합니다. 단백질이 인지질에 결합한 후 pH의 조절은 형광 소멸을 유발합니다.

단백질-포스포이노시티드 상호작용을 검출하기 위해 지원되는 지질 이중층에 대한 pH 조절 분석

편광 기반의 전반사 형광 현미경 (pTIRFM)은 세포막 역학의 실시간 감지를 할 수 있습니다. 이 문서는 규제 세포 외 유출 동안 막 리모델링의 연구 pTIRFM의 구현을 설명합니다. 기술은 직접적으로 또는 간접적으로 막 형상의 변화를 수반 세포 생물학의 다른 프로세스에 일반화이다.

pTIRFM와 이미징 플라즈마 막 변형

원형질막 단백질과 지질의 공간 분포와 시간 역학은 생물학에서 뜨거운 주제입니다. 여기서 이 문제는 개념적으로 동일한 단일 입자 추적의 물리량을 제공하지만 작은 분자 레이블과 표준 현미경 설정을 사용하는 시공간 이미지 변동 분석을 통해 해결됩니다.

상용 현미경에서 라이브 세포막에 분자 확산 법률에 빠른 형광 이미징

우리는 액적 단층을 평평한 단층으로 병합하여 유체-유체 계면에서 표면 활성 종의 측면 확산을 측정하는 새로운 기술을 제시합니다.

액적 병합 후 형광 복구 인지질 단분자막 이차원 확산을 측정하도록

Phosphoinositides는 상대적인 풍부 빠르게 다양한 자극에 대한 반응의 변화 지질 신호된다. 이 문서 추출 및 탈아 실화 다음 3 H-의 미오의 -inositol와 대사 라벨 세포에 의해 phosphoinositides의 풍부를 측정하는 방법을 설명합니다. 추출 글리세 inositides 후 고성능 액체 크로마토 그래피로 분리하고, 섬광 유동에 의해 정량화된다.

고성능 액체 크로마토 그래피 결합 흐름 섬광에 의한 방사성 표지 및 Phosphoinositides의 세포 수준의 정량화

PI (4,5) P (2)는 다양한 세포 기능을 조절하지만, 세포 세포막에서의 나노 조직 잘못 이해된다. 라벨 PI 플렉스 트린 상동 도메인에 융합 된 이중 색상 형광 프로브 (4,5) P (2)에 의해, 우리는 나노 미터 스케일에서 (4,5) P 원형질막 2 공간 분포를 PI를 연구하는 새로운 방법을 기술 .

소설 형광 프로브와 플라즈마 막에서 포스파티딜 이노시톨 -4,5- 비스 포스페이트의 단일 분자 슈퍼 해상도 이미징

우리는 옵신으로 재구성된 큰 단층 리포좀에서 인지질 스크램블을 측정하기 위한 형광 기반 분석을 설명합니다.

인지질 Scramblase 활동의 형광 기반의 분석

pH가 민감한 형광으로 막 단백질의 세포 외 도메인에 레이블, superecliptic pHluorin (-9 월), 세포 내 현지화, 표현, 인신 매매를 결정할 수 있습니다. 촬상 전반사 형광 현미경 (TIRFM)으로 단백질을 -9 월 표지 주연 ER 및 세포막에서 단백질 농도의 정량 분석을 가능하게한다.

pHluorin 태그가 수용체를 활용하여하는 세포 현지화 및 인신 매매를 모니터링하기

이 프로토콜은 세포 엑소사이토시스(exocytosis) 및 세포내이입(endocytosis) 주기 동안 지질 막 이동을 모니터링하기 위해 pH에 민감한 지질 형광단 클래스를 사용하는 형광 이미징 방법을 제시합니다.

pH에 민감한 형광 지질 아날로그 ND6를 사용한 막 지질 회전율 측정

이 프로토콜은 TIRF 현미경을 사용하여 개별 이온 채널을 추적하고 지지된 지질막에서 그 활성을 결정하여 측면 막 이동과 채널 기능 간의 상호 작용을 정의하는 방법을 설명합니다. 멤브레인을 준비하고, 데이터를 기록하고, 결과를 분석하는 방법을 설명합니다.

TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경을 사용한 지질 이중층의 측면 이동성 및 이온 채널 활성에 대한 단일 분자 이미징

우리는 원형질막의 지질과 외인성 지질 사이의 교환을 매개하기 위해 시클로덱스트린을 사용하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 지질 뗏목과 같은 환경에서 뗏목과 같은 환경이 아닌 뗏목과 같은 환경에서 다르게 행동하는 막관통 단백질을 연구하는 실험과 쌍을 이룰 수 있습니다.

살아있는 세포의 지질 교환 분석

학습하세요 형광 기반 프로토콜을 사용하여 인스파티딜세린과 포스파티딜리노시톨 4-인산염의 추출 및 전달을 측정하는 방법을. 이 기술은 Osh6p 단백질을 이용한 지질 전달 동역학을 정량화하여 진핵세포 막 내 지질 분포 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

형광 기반 측정 인스파디딜세린/포스파디딜리노시톨 4-인산염 교환 막 간

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