Name: 선명도 조직 클리어링 방법으로 전산 망막의 면역 염색 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: 학습하세요 수정된 CLARITY 방법으로 전체 망막을 투명화하여 고해상도 3차원 이미징과 면역염색을 수행하는 기술을. 이 프로토콜은 쥐 망막 신경원의 미세 형태학적 변화를 질병 상태에서 상세히 분석하는 데 활용됩니다.

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빙예, 네이선 스픽스, 하오 류에게 기술지원을 부탁드립니다. 이 작품은 건강 보조금 EY022640 (D.-Q.Z.) 및 오클랜드 대학 프로보스트 학부 학생 연구 상 (E.J.A.)에 의해 지원되었다.

마우스 관리 및 모든 실험 절차는 실험실 동물에 대한 건강의 국가 학회 지침에 따라 실시하고 오클랜드 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다 (프로토콜 번호 18071).
참고: 솔루션 이름과 해당 컴포지션의 이름이 표 1에나열됩니다.
1. 조직 준비
<ol><li>CO2의과다 복용으로 마우스를 안락사시키고 자궁 경부 탈구가 뒤따릅니다.</li>
	<li>구부러진 집게로 눈을 이결시키고 0.1 M PBS(표 1)와함께 작은 페트리 접시로 옮기습니다. 해부 현미경의 밑에, 바늘로 각막-clera 접합을 따라 작은 구멍을 찌르는. 1 시간 동안 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 전송합니다.</li>
	<li>눈을 PBS로 접시에 다시 옮기. 해부 현미경에서, 각막 -clera 접합주위의 모든 방법을 잘라 해부 가위를 사용합니다. 각막과 렌즈를 제거합니다. 시신경의 기지에서 잘라 조심스럽게 망막을 분리하는 집게로 clera를 벗겨.</li>
	<li>망막 주위에 네 개의 작은 컷을 고르게 만들고 PBS에 담근 미세 한 팁 브러시를 사용하여 망막을 안정화시키기 위해 니트로 셀룰로오스 필터 용지에서 작은 사각형 컷에 클로버 모양 (GCL 측면 다운)을 평평하게 놓습니다.</li>
	<li>(장착 된 망막을 만지지 않고) 니트로 셀룰로오스 종이의 모서리를 잡고 1 시간 동안 4 % PFA와 48 웰 플레이트에 배치하려면 집게를 사용하여 망막을 전송합니다.</li>
	<li>필터 용지와 망막을 PBS와 잘 옮기고 씻습니다 (각각 5 분 당 3 배).</li>
	<li>A4P0(표 1)으로옮기고 부드러운 동요와 함께 4 °C에서 하룻밤 을 배양하십시오.</li>
	<li>파이펫 식물성 오일은 A4P0 용액을 완전히 덮습니다. 흔들림 없이 3시간 동안 40°C의 수조에서 배양합니다.</li>
	<li>PBS에서 세척(각 3배 5분)을 세척하여 모든 오일이 헹구었는지 확인합니다. 필요한 경우 파이프를 사용하여 마지막 헹구기 전에 우물 상단에서 남은 오일을 조심스럽게 제거합니다.</li>
	<li>부드러운 흔들림으로 2 일 동안 40 °C에서 10 % SDS로 배양하십시오. 두 번째 날에는 SDS를 신선한 솔루션으로 교체합니다.</li>
	<li>트리톤-X-100(PBST, 표 1)을사용하여 필터 용지와 망막을 PBS로 옮기고 세척(각각 1.5시간 동안 5배).</li>
	<li>PBST에 4°C에 0.01% 나트륨 아지드(NaN3)로저장하거나 면역염색으로 직접 이동하십시오.</li>
</ol>2. 면역 염색 및 굴절률 일치
<ol><li>PBST의 미세 한 팁 브러시로 부드럽게 벗겨서 필터 용지에서 망막을 제거하십시오.</li>
	<li>1차항체(표 2)에서망막을 배양하여 블로킹 용액(표1)에서2일간 40°C에서 부드러운 흔들림으로 배양한다.</li>
	<li>PBST에서 세척(각각 5배, 1.5h).</li>
	<li>적절한 이차항체(표 3)로배양하여 40°C에서 2일간 블로킹 용액에 희석되어 부드러운 흔들림을 하고 나머지 시술을 통해 빛으로부터 보호한다.</li>
	<li>0.02 M 인산염 버퍼(표 1참조)에서 세척(5배, 각 1.5h).</li>
	<li>소르비톨 기반 굴절 인덱스 매칭 솔루션(sRIMS, 표 1참조)에서 하룻밤 사이에 40°C에서 부드러운 흔들림으로 배양합니다.</li>
</ol>3. 장착
<ol><li>유리 현미경 슬라이드 뒷면의 정사각형 경계를 표시하는 미세 팁 영구 마커가있는 18mm x 18mm x 1.5mm 유리 커버 슬립을 간략하게 설명합니다.</li>
	<li>슬라이드를 뒤집어 주사기를 사용하여 슬라이드 앞쪽에 얇은 실리콘 그리스 라인으로 경계를 추적하여 과도한 장착 용액을 피하기 위해 한 모서리에 작은 간격을 남깁니다.</li>
	<li>망막을 경계 영역의 중앙으로 옮기고 미세 한 브러시로 배열하여 유리 슬라이드에 대한 광수용체 측면이 평평하도록 하십시오.</li>
	<li>파이펫약 60 μL의 sRIMS는 평평한 망막을 덮고 망막이 평평하고 제자리에 머무르는 것을 주의하여 인클로저의 한 구석으로 확장합니다.</li>
	<li>스림으로 모퉁이에서 시작하여 커버슬립을 바르고 기포가 형성되지 않도록 사방의 그리스에 닿을 때까지 천천히 낮춥힙슬립을 적용합니다.</li>
	<li>장착된 망막의 양쪽에 3개의 커버립을 스페이서로 놓습니다. 다른 슬라이드의 긴 가장자리를 사용하여 마운트가 평평하고 균일하도록 커버 슬립을 누릅니다.</li>
	<li>이미징까지 4°C에서 평평하게 슬라이드를 저장합니다.</li>
</ol>4. 이미징
<ol><li>기존의 형광 현미경 또는 공초점현미경(재료의 표)에 대한이미지 샘플. 현미경 단계에 슬라이드를 배치하고 샘플을 찾는 것으로 시작합니다. 참고: 반전된 목표 현미경이 사용되는 경우 슬라이드를 무대에 거꾸로 놓고 먼저 슬라이드의 노출된 영역이 모든 실리콘 그리스 및 장착 용액이 지워지도록 합니다.</li>
	<li>공동 표지된 샘플의 z-stacked 이미지를 얻으려면 먼저 각 채널의 신호에 개별적으로 초점을 맞추고 노출 시간 또는 스캔 속도를 각각 설정합니다.</li>
	<li>원하는 범위의 위쪽과 하단에 초점 평면을 수동으로 설정하거나 중간점을 설정한 다음 중간점 주변의 범위를 지정하여 z 스택의 범위를 설정합니다.</li>
	<li>원하는 대로 단계 크기 또는 슬라이스 수를 조정합니다.</li>
	<li>이미지를 캡처하고 원래 파일을 저장하고 TIFF 파일 또는 기타 원하는 형식으로 내보냅니다.</li>
</ol>5. 이미지 분석
<ol><li>선택한 이미지 분석 소프트웨어(재료 표)를 사용하여 단일 이미지와 z스택의3차원 렌더링 모두에서 최적의 선명도가 달성될 때까지 각 채널의 밝기와 콘트라스트를 조정합니다. 참고: 선택한 단계 크기가 충분히 작으면 신호를 향상시키기 위해 3D 데온볼루션도 수행할 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Witkovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+and+retinal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Documenta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">Dopamine and retinal function.</a> Documenta Ophthalmologica. 108 (1), 17-40 (2004).</li>
<li>McMahon, D. G., Iuvone, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+organization+of+the+mammalian+retina%3A+from+gene+regulation+to+physiology+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Circadian organization of the mammalian retina: from gene regulation to physiology and diseases.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 39, 58-76 (2014).</li>
<li>Prigge, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M1+ipRGCs+Influence+Visual+Function+through+Retrograde+Signaling+in+the+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">M1 ipRGCs Influence Visual Function through Retrograde Signaling in the Retina.</a> Journal of Neuroscience. 36 (27), 7184-7197 (2016).</li>
<li>Zhang, D. Q., Belenky, M. A., Sollars, P. J., Pickard, G. E., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanopsin+mediates+retrograde+visual+signaling+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Melanopsin mediates retrograde visual signaling in the retina.</a> PLoS One. 7 (8), 42647(2012).</li>
<li>Liu, L. L., Alessio, E. J., Spix, N. J., Zhang, D. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+GluA2-containing+calcium-impermeable+AMPA+receptors+on+dopaminergic+amacrine+cells+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Expression of GluA2-containing calcium-impermeable AMPA receptors on dopaminergic amacrine cells in the mouse retina.</a> Molecular Vision. 25, 780-790 (2019).</li>
<li>Liu, L. L., Spix, N. J., Zhang, D. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+Receptors+Contribute+to+Retrograde+Synaptic+Transmission+from+Ganglion+Cell+Photoreceptors+to+Dopaminergic+Amacrine+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NMDA Receptors Contribute to Retrograde Synaptic Transmission from Ganglion Cell Photoreceptors to Dopaminergic Amacrine Cells.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 279(2017).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332(2013).</li>
<li>Poguzhelskaya, E., Artamonov, D., Bolshakova, A., Vlasova, O., Bezprozvanny, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+method+to+perform+CLARITY+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Simplified method to perform CLARITY imaging.</a> Molecular Neurodegeneration. 9, 19(2014).</li>
<li>Epp, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+CLARITY+for+Clearing+Whole-Brain+and+Other+Intact+Organs%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs.</a> eNeuro. 2 (3), (2015).</li>
<li>Magliaro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+CLARITY%3A+Quantitative+Optimization+of+the+Diffusion+Based+Delipidation+Protocol+for+Genetically+Labeled+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Clarifying CLARITY: Quantitative Optimization of the Diffusion Based Delipidation Protocol for Genetically Labeled Tissue.</a> Frontiers in Neuroscience. 10, 179(2016).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li>
<li>Zheng, H., Rinaman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+CLARITY+for+visualizing+immunofluorescence+labeling+in+the+developing+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Structure+and+Function%22%5BJournal%5D)">Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain.</a> Brain Structure and Function. 221 (4), 2375-2383 (2016).</li>
<li>Witkovsky, P., Arango-Gonzalez, B., Haycock, J. W., Kohler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+retinal+dopaminergic+neurons%3A+differential+maturation+of+somatodendritic+and+axonal+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Rat retinal dopaminergic neurons: differential maturation of somatodendritic and axonal compartments.</a> Journal of Comparative Neurology. 481 (4), 352-362 (2005).</li>
</ol>

저자는 경쟁 적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

전체 마운트 망막에 대한 CLARITY 프로토콜의 수정. 우리는 대부분의 이전 연구에서 사용되는 것처럼 진공 배출 또는 건조 챔버없이 적절한 중합을 달성하기 위해 CLARITY 프로토콜을단순화7,9,11. 중합 공정은 산소에 의해 억제되며, 프로토콜의 중합 단계 동안 시료를 공기로부터 분리하도록 요구한다. 그러나, 질소로 탈가스를 방출하는 대신, 이전에 문서화된12와같이 철저한 헹구기 후 프로토콜의 나머지 부분에 악영향을 미치지 않으면서 중합화를 허용하기 위해 샘플을 충분히 분리한 오일로 샘플을 덮는 것을 발견하였다. 우리는 또한 조직 브라우닝의 위험과 전기 경화와 관련된 조직 구조의 손상을 제한하는 수동 청산 방법으로 프로토콜을단순화(11)....

척추지통은 아마도 중추 신경계 (CNS)의 가장 접근 할 수있는 부분이며 뇌의 발달, 구조 및 기능을 연구하기위한 훌륭한 모델역할을합니다. 망막에 있는 뉴런의 5개 종류는 2개의 플렉시폼 층에 의해 분리된 3개의 핵 층으로 분포됩니다. 외부 핵층(ONL)은 빛을 전기 신호로 변환하는 고전적인 광수용체(막대 및 원수)로 구성됩니다. 전기 신호는 양극성, 수평 및 막골 세포를 포함하는 내부 핵 층(INL)의 뉴런에 의해 처리된 다음 신경절 세포 층(GCL)에서 망막 신경절 세포(RGC)로 전염된다. RGC는 망막의 출력 뉴런이며, 축축은 이미지 형성 및 비 이미지 형성 시각 기능에 기여하기 위해 뇌에 투사됩니다. 또한, 신경 교 세포의 세 가지 유형 (뮬러 세포, 천체, 마이크로 글리 아) 뉴런에 영양분을 제공 하 고 그들의 세포 외 환경에서 유해한 변화에서 뉴런을 보호.
amacrine 세포의 1개의 특수한 하위 인구는 CNS에 있는 중요한 신경 변조기인 도파민을 생성하고 풀어 놓으며, 빛 적응 도중 망막 신경 회로를재구성1,2. 도파민성 막막 세포(DAC)는 형태학적 프로파일의 독특한 특징을 가지고 있습니다. 그들의 소마타는 내부 플렉시폼 층(IPL)의 가장 단산적인 부분에서 담수체가 마비된 근접 INL에 위치하고 있습니다. DAC의 축슨 과 같은 프로세스는 미근한, 얇고 긴, 희소하게 분기, 곰 정맥류 (도파민 방출의 사이트). 그(것)들은 AII amacrine 세포의 소마타 의 주위에 고리 같이 구조물을 포함하여 IPL에 있는 점선으로 조밀한 신경총을 형성합니다. 축축은 또한 InL을 통해 OPL을 향해 달려가 망막3을가로질러 원심 통로를 형성합니다. 우리는 DAC 프로세스가 양극성 세포 및 본질적으로 감광성 망막 신경절 세포 (ipRGCs)4,5,6을포함하여 사전 시냅스 뉴런에서 글루타민산 방출에 대한 응답으로 수용체를 발현한다는 것을입증했습니다. 그러나, 글루타민체 수용체가 축축산, 원원수 또는 둘 다에 발현되는지 여부는 수직 망막 섹션에서 차단되어 서로 구별될 수 없기 때문에5,6. 면역 염색은 DC의 3차원 분지 및 세포전 구획에 글루타민산 수용체의 존재를 밝히기 위해 전체 마운트 망막에서 수행되어야 합니다. 망막은 상대적으로 투명하지만 마우스 전체 마운트 망막의 두께는 약 200 μm이며, 이는 심부 조직으로 항체의 침투를 제한할 뿐만 아니라 조직 광 산란으로 인한 고해상도 이미징의 광 침투를 감소시킵니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 면역 염색 호환 조직 하이드로겔 탈면 방법 (CLARITY)를 조정하여 최근 두꺼운 뇌 섹션을 위해 전체 마운트 마우스 망막7에적응시켰다.
CLARITY 방법은 원래 두꺼운 뇌 샘플7의면역 염색 및 이미징을 위한 Deisseroth 실험실에 의해 개발되었다. 강력한 세제, 도데딜 황산나트륨(SDS) 및 전기포고를 사용하여 지질 성분(조직 광산란을 유발함)을 제거하여 단백질과 핵산을 제자리에 두고 있습니다. 제거된 지질은 아크릴아미드와 같은 하이드로겔 단량체로 구성된 투명한 스캐폴드로 대체되어 남은 단백질 구조를 지원합니다. 지워진 조직은 면역 조직 화학을 통해 표지될 수 있고 조직을 통해 실질적으로 증가한 광 침투 깊이로 심화될 수 있습니다 (조직 표면 아래 최대 몇 밀리미터). 그 이후, CLARITY 방법은 여러 연구 그룹에 의해 최적화되고 단순화되어8,9,10. 수정된 CLARITY 프로토콜은 수동 클리어링 기술을 사용하여 전뇌 및 기타 온전한장기(11)를지우기 위해 전기전도에 의해 생성된 조직 손상을 방지한다. 그러나 이 방법은 아직 전체 탈산 망막에 적용되지 않았습니다. 여기서, 우리는 면역 히스토케및 이미징을 위해 더 투명하게 하기 위해 전산 망막에 대한 수동 적인 CLARITY 기술을 조정했습니다. 우리는 시험된 망막 단백질의 대다수가 면역 조직화학을 위한 이 프로세스 도중 보존되었다는 것을 것을을 발견했습니다. 굴절지수 매칭 솔루션을 사용하여 ONL에서 GCL까지 약 200μm 두께의 망막 뉴런을 전신망막에서 이미지화할 수 있었습니다.

<table><tbody><tr><td>16% 파라포름알데히드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15710</td><td>고정성</td></tr><tr><td>아크릴아미드</td><td>Fisher Biotech</td><td>BP170</td><td>하이드로겔 단량체</td></tr><tr><td>Axio Imager.Z2</td><td>Zeiss</td><td></td><td>형광 현미경</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600</td><td>차단제</td></tr><tr><td>Eclipse Ti</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>스캐닝 공초점 현미경</td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR</td><td>BDH0258</td><td>버퍼 구성 요소</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>버퍼 구성 요소</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9763</td><td>버퍼 구성 요소</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>버퍼 구성 요소</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0751</td><td>버퍼 구성 요소</td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002</td><td>정균 방부제</td></tr><tr><td>NDS</td><td>Aurion</td><td>900.122</td><td>차단제</td></tr><tr><td>NIS 요소 AR</td><td>Nikon</td><td></td><td>이미지 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>SDS</td><td>BioRad</td><td>1610301</td><td>탈지화제</td></tr><tr><td>소르비톨</td><td>시그마 Aldrich</td><td>51876</td><td>완충액 성분</td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>계면활성제</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337</td><td>계면활성제</td></tr><tr><td>VA-044</td><td>Wako Chemicals</td><td>011-19365</td><td>열 개시제</td></tr></tbody></table>

선명도 조직 클리어링 방법으로 전산 망막의 면역 염색

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

원래 Deisseroth 실험실에서 개발한 조직 하이드로겔 탈지법(CLARITY)은 두꺼운 뇌 샘플의 면역 염색 및 이미징에 널리 사용되었습니다. 그러나 이 첨단 기술은 아직 전체 마운트 망막에 사용되지 않았습니다. 망막은 부분적으로 투명하지만, 약 200 μm (마우스)의 두께는 여전히 고해상도 이미징을위한 광 침투를 감소시킬뿐만 아니라 깊은 조직으로 항체의 침투를 제한합니다. 여기서, 우리는 아크릴아미드 단조로 중합하여 나노다공성 하이드로겔을 형성한 다음 단백질 손실을 최소화하고 조직 손상을 피하기 위해 나트륨 도데실 황산염으로 이를 제거함으로써 마우스 망막 전체를 위한 CLARITY 방법을 적용했습니다. CLARITY 처리망막은 망막 뉴런, 글리아 세포 및 시냅스 단백질을 위한 항체로 면역염색되었고, 굴절지수 매칭 용액에 장착되고, 이미지화되었다. 우리의 데이터는 CLARITY가 전체 마운트 준비에서 망막 뉴런 및 신경교 세포를 위한 표준 면역 조직화학 염색 및 화상 진찰의 질을 향상할 수 있다는 것을 보여줍니다. 예를 들어, 도파민성 막막 세포의 미세 축삭 과 수지상 구조의 3D 해상도는 CLARITY에 의해 훨씬 개선되었습니다. 비가공 된 전체 마운트 망막에 비해, CLARITY는 포스트 냅스 밀도 단백질 95와 같은 시냅스 단백질에 대한 면역 스테인링을 나타낼 수 있습니다. 우리의 결과는 CLARITY가 지질제거 후에 망막을 보다 광학적으로 투명하게 만들고 망막 뉴런과 단백질의 미세한 구조를 보존한다는 것을 보여주며, 이는 망막 뉴런과 그 전산 준비에서 그들의 세포 세포 구조의 고해상도 이미징을 얻는 데 일상적으로 사용될 수 있습니다.

수정 된 CLARITY 처리 망막은 광학적으로 투명한 조직입니다. 적절한 탈착을 제공하고 세포 단백질의 구조적 무결성을 유지하면서 망막내의 면역 조직 화학 적 응용 프로그램과 호환되는 조직 청산 방법을 공식화하기 위해, 우리는 전산 마우스 망막에 CLARITY 조직 클리어링 방법을 적용했습니다. 프로토콜을 단순화하고 전체 마운트 망막용으로 수정할 수 있었습니다(프로토콜 참조). 조직 혼성화, 청산 및 굴절률 매칭을 완료한 후, 이러한 수정된 CLARITY 프로토콜로 처리된 망막은 비처리 된 제어 망막(도1B)에비해 망막의 두께 전반에 걸쳐 거의 완전한 광학 투명성을 보였다. 이 결과는 CLARITY 프로토콜의 이 수정이 충분히 지워진 전체 마운트 망막 조직을 제공한다는 것을 나타냅니다.
수정 된 CLARITY 처리 망막에서 ...

여기서 우리는 표준 면역 조직 화학 염색 및 망막 뉴런및 그 하위 세포 구조의 고해상도 화상 진찰의 질을 향상시키기 위하여 전산 망막에 대한 뇌 조직의 CLARITY 방법을 적응하는 프로토콜을 제시합니다.

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...

이 프로토콜은 망막 뉴런의 미세한 형태학의 조사를 허용하고 질병 상태에서 발생하는 세포 및 세포 체형 변화에 대한 통찰력을 줄 수 있습니다. 이 방법은 망막의 광학 적 투명성을 크게 향상시키고 호르몬 망막 준비에서 망막 뉴런의 고해상도, 3 차원 이미징, 회로 배선 및 미세 하위 세포 구조를 허용합니다. 마우스 눈을 구부러진 집게로 이결시키고 0.1 M PBS가 있는 작은 페트리 접시로 옮킨다.실부 현미경의 밑에 바늘과 각막 clera 접합을 따라 작은 구멍을 찌른 다음 1 시간 동안 4%의 힘 포름알데히드로 눈을 전송합니다. 눈을 PBS로 접시에 다시 옮기. 해부 현미경에서 해부 가위를 사용하여 코로클레럴 접합부 주변을 잘라냅니다.각막과 렌즈를 제거합니다. 그런 다음 시신경의 기지에서 잘라 조심스럽게 망막을 분리하는 집게로 clera를 벗겨. 망막 주위에 네 개의 작은 컷을 고르게 만들고 PBS에 담근 미세 한 팁 브러시를 사용하여 니트로 셀룰로오스 필터 용지에서 작은 사각형 컷에 클로버 모양으로 평평한 GCL 면을 놓습니다.니트로셀룰로오스 종이의 모서리를 집게로 집어 들고 48개의 웰 플레이트에 4%의 포름알데히드가 1시간 동안 넣고, 필터 용지와 망막을 PBS로 잘 옮기고 각각 5분간 3회 세척합니다. 얼음에 A4P0 솔루션을 해동. 그런 다음 망막을 A4P0 솔루션으로 옮기고 완만한 동요로 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다.식물성 기름을 우물에 추가하여 A4P0 용액을 완전히 덮습니다. 흔들림 없이 3시간 동안 섭씨 40도에서 수조에 배양하십시오. 그런 다음 PBS에서 세 번 씻고 세척당 5 분간 씻습니다.망막을 섭씨 40도에서 2일 동안 섭씨 40도에서 배양한 다음 필터 용지와 망막을 Triton X-100으로 PBS로 옮기고 세척당 90분 동안 5회 세척합니다. 마지막 세척 후, 0.01%의 아지드 나트륨으로 PBS-T의 섭씨 4도에 망막을 보관하거나 면역 염색으로 직접 이동합니다. PBS-T의 미세 한 팁 브러시로 부드럽게 벗겨서 필터 용지에서 망막을 제거하십시오.1 차적인 항체에서 배양된 것은 부드러운 흔들림으로 섭씨 40도에서 2일 동안 차단용액에 희석됩니다. 인큐베이션 후 PBS-T에서 90분 동안 5회 세척합니다. 완두르기와 함께 섭씨 40도에서 2일 동안 차단용액에 희석된 적절한 이차 항체로 망막을 배양한다.절차의 나머지 부분에서 빛으로부터 샘플을 보호합니다. 망막을 0.02 M 인산염 버퍼로 90분 동안 5회 세척합니다. 마지막으로 부드러운 흔들림으로 밤새 섭씨 40도에서 소르비톨 기반 굴절 지수 매칭 솔루션의 망막을 배양합니다.유리 현미경 슬라이드 뒷면에 사각형 경계를 표시하는 미세 팁 영구 마커와 유리 커버 슬립을 윤곽. 슬라이드를 뒤집어 주사기를 사용하여 슬라이드 전면에 얇은 실리콘 그리스 라인으로 경계를 추적합니다. 여분의 장착 솔루션이 탈출할 수 있도록 한 구석에 작은 간격을 둡니다.망막을 경계 영역의 중앙으로 옮기고 미세 한 팁 브러시로 배치하여 유리 슬라이드에 대한 광수용체 측면과 평평하게 놓습니다. 파이펫 약 60 마이크로리터의 sRIMS를 통해 평평한 망막을 덮고 인클로저의 한 구석으로 확장됩니다. 망막이 평평하고 제자리에 유지되도록 하십시오.커버 슬립을 바르고, 스림으로 모퉁이에서 시작하여 모든 면의 그리스에 닿을 때까지 천천히 낮춥힙. 장착된 망막의 양쪽에 세 개의 커버 슬립을 스페이서로 놓습니다. 다른 슬라이드의 긴 가장자리를 사용하여 마운트가 평평하고 균일하도록 커버 슬립을 누릅니다.슬라이드를 이미징할 때까지 섭씨 4도에 저장합니다. 현미경 단계에 슬라이드를 배치하고 샘플을 찾는 것으로 시작합니다. 샘플의 Z 누적 된 이미지를 얻으려면 먼저 각 채널의 신호에 개별적으로 초점을 맞추고 형광 또는 공초점 현미경에 대한 노출 시간 또는 스캔 속도를 각각 설정합니다.원하는 범위의 위쪽과 하단에 초점 평면을 수동으로 설정하거나 중간점을 설정한 다음 중간점 주변의 범위를 지정하여 Z 스택의 범위를 설정합니다. 원하는 대로 단계 크기 또는 슬라이스 수를 조정합니다. 이미지를 캡처하고 원본 파일을 저장합니다.그런 다음 TIF 파일 또는 다른 원하는 형식으로 내보내. 이미지 분석, 선택한 소프트웨어를 사용하여 단일 이미지와 Z 스택의 3차원 렌더링 모두에서 최적의 선명도가 달성될 때까지 각 채널의 밝기와 대비를 조정합니다. 수정된 CLARITY 프로토콜로 처리될 때 망막의 두께 전반에 걸쳐 광학 투명성을 완료하여 비처리 된 제어 망막에 비해 관찰하였다.ONL의 Arrestin 표지 콘에 대한 Z 누적 이미지, INL에서 DAC로 레이블이 지정된 TH, GCL에서 RG로 표시된 RBPMS가 여기에 표시됩니다. 망막의 전체 두께를 통해 뉴런의 상대적 위치는 오버레이 이미지에서 관찰되었다. TH 염색 및 CLARITY 처리 전체 산 망막 표준 준비에서 얻은 이미지와 비교되었다.DAC의 Dendrites 및 축삭 과 같은 프로세스는 표준 망막에서 보다는 명확하게 가공된 망막에서 더 명확하게 드러났습니다. DACs의 축삭 과 같은 프로세스는 표준 망막에 비해 선명한 망막에 완전한 고리 와 같은 구조를 전시했습니다. 형광 현미경 검사를 사용하여 취한 CLARITY 망막의 고리 같은 구조는 공초점 현미경 검사를 사용하여 관찰된 것과 거의 동일했습니다.축사와 같은 과정은 또한 외부 망막을 향해 달렸다. GluA2 및 PSD-95에 대한 면역 염색은 AMPA 수용체와 퍼티션 포스트 시냅스 부위를 각각 포함하는 개별 GluA2를 드러내는 뚜렷한 말장난을 보였다. 오버레이 이미지는 DAC 프로세스에 대한 몇 가지 말장난을 보여 주었다.공동 지역화의 포인트는 XZ, YZ 및 XY 평면및 TH가 GluA2 및 PSD-95와 함께 명확하게 공동 지역화되었습니다. 지워진 망막이 장착 및 이미징 공정을 위해 평평하게 배치될 수 있도록 하이드로겔 중합 공정 중에 망막이 평평하게 유지하는 것이 중요합니다.

immunostaining-whole-mount-retinas-with-clarity-tissue-clearing

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

신생아 쥐 망막에서 혈관 신생을 조절 다른 유전자 또는 약물의 역할의 조사를 허용하는 혈관의 잘 특성화 생리 학적 모델을...

혈관을 조사하기 위해 신생아 마우스 망막의 전체 마운트 면역 형광 염색<em&gt; 생체 내</em

여기에 설명된 프로토콜은 전체산 망막 제제의 구조적 평가를 위한 것입니다. 여기에는 조직 해부에 대한 설명, 친수성 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 멤브레인 삽입물에 장착, 형광 마커를 사용한 볼루스 로딩, 세포 및 시냅스 구성 요소의 면역조직화학 분석을 위한 카르보디이미드 및 파라포름알데히드와의 고정 비교가 포함됩니다.

이미징 및 면역 조직 화학에 대한 망막 Wholemount 준비를 위해 최적화 된 프로토콜

ACT-PRESTO (장기에 거대 분자의 활성 명확하게 기술 압력과 관련된 효율적이고 안정적인 전송) 수동 확산 또는 압력 보조 배달에 의해 삭제 조직으로, 신속하게 효율적으로하지만, 저렴한 조직 청소 및 신속한 항체 침투 할 수 있습니다. 이 방법을 사용하여, 조직의 넓은 범위는 다중 항체 클리어하여 immunolabeled 및 볼륨 - 이미징 될 수있다.

ACT-PRESTO : 생물 조직 지우기 및 볼륨 이미징을위한 Immunolabeling 방법

쥐 망막 microvascular pericytes, 즉, cryo 섹션, 전체 마운트 및 혈관 네트워크의 침투성 절연의 immunohistochemical 시각화를 위한 3 개의 다른 조직 준비 기술을 설명합니다.

망막 Cryo-섹션, Microvascular Pericytes의 Immunohistochemical 시각화에 대 한 전체-마운트 및 소형 고립 된 맥 관 구조

항체 라벨링, 광학 클리어링 및 고급 광 현미경의 조합은 완전한 구조 또는 장기의 3차원 분석을 가능하게 합니다. 여기에 설명된 간단한 방법은 두꺼운 신장 슬라이스의 면역 라벨링, 에틸 시나메이트와 광학 클리어링, 3차원 신장 구조의 시각화 및 정량화를 가능하게 하는 공초점 이미징을 결합하는 간단한 방법입니다.

면역 표지된 신장 조직의 광학 클리어링 및 화상 진찰

이 프로토콜은 전체 마운트 마우스 망막을 분리하고 모든 망막 신경절 세포(RGC)를 표지하기 위해 면역염색을 수행하는 절차를 설명합니다. 그 다음에는 AI 기반 소프트웨어를 사용하여 망막 신경절 세포를 이미징하고 자동으로 계수하여 전체 마우스 망막에서 망막 신경절 세포를 정량화하는 간단하고 빠르며 정확한 방법을 제공합니다.

Whole-Mount Immunostaining and Automatic Counting of Mouse Retinal Ganglion Cells(전체 마운트 면역염색 및 마우스 망막 신경절 세포의 자동 계수)

망막 혈관 구조의 주위 세포는 형광 토마토 렉틴의 역궤도 주사 후 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β로 면역 형광 염색으로 검사했습니다. 표지된 망막은 조직 제거 방법으로 추가로 처리되었으며 컨포칼 현미경으로 망막 혈관 구조를 둘러싼 주위 세포의 3차원 보기를 시각화하기 위해 전체적으로 장착되었습니다.

Immunostaining을 통한 마우스의 망막 혈관 주위 세포의 3D 시각화 

이 프로토콜은 광학 투명화(optical clearing)와 면역 라벨링(immunolabeling)을 결합하여 전체 마운트 망막 오가노이드의 전체 볼륨 컨포칼 이미징을 제공합니다. 3D 구조를 보존하여 주요 신경 경로를 자세히 시각화할 수 있으며, 망막 성숙, 공간 조직, 질병 모델링 및 개인 맞춤형 의학에서의 잠재적 응용에 대한 연구를 개선합니다.

Whole-mount Retinal Organoid Visualization with Cellular Resolution

우리는 개최 준비하는 절차를...

전체 마운트의 배아 신경 계통의 시각화 Drosophila 태아

말초 감각 신경 섬유 subtypes의 Immunocytochemical 식별 (과 그 안의 단백질의 표현 감지)는 주변 센세이션을 기본 분자 메커니즘을 이해하는 데 열쇠입니다. 여기 주변 감각 신경 섬유의 특정 immunostaining 위해 이러한 피부 및 사지 ​​뼈와 같은 주변 기기 / 내장 조직 샘플,의 준비를위한 방법을 설명합니다.

피부와 사지 본즈 Innervating 마우스 감각 신경 섬유의 조직 준비 및 Immunostaining

학습하세요 수정된 CLARITY 방법으로 전체 망막을 투명화하여 고해상도 3차원 이미징과 면역염색을 수행하는 기술을. 이 프로토콜은 쥐 망막 신경원의 미세 형태학적 변화를 질병 상태에서 상세히 분석하는 데 활용됩니다.

선명도 조직 클리어링 방법으로 전산 망막의 면역 염색

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