칼슘 플루오로포어 라벨링 및 나노입자 추적 분석을 사용하여 인간에서 오줌 나노 결정의 추정

이 프로토콜은 특히 인간의 소변에서 칼슘 함유 나노 결정을 감지 할 수 있습니다. 이 기술은 잠재적으로 신장 결석 형성의 초기 단계뿐만 아니라 크리스탈 우레아와 관련된 다른 질병을 예측하는 데 유용 할 수 있습니다. 절차를 보여주는 것은 박사 Parveen Kumar, 내 실험실에서 연구원 IV가 될 것입니다.

참가자는 3 일 동안 낮은 oxalate 다이어트를 소비 하 고 하룻밤 빠른. 그런 다음 참가자들로부터 24시간 소변 샘플을 수집한 후 옥살레이트 부하를 섭취합니다. 약 8 밀리몰의 옥살레이트 부하를 가진 과일과 야채를 포함하는 스무디로 참가자에게 먹이를 주세요.

참가자는 24 시간 동안 그들의 소변을 수집 하 고 다음 날에 그것을 반환. 처리하기 전에 모든 소변 샘플을 실온에서 유지합니다. 소변 pH 및 소변 샘플의 부피를 측정하고 기록합니다.

철저히 섞어서 50밀리리터의 소변을 라벨이 붙은 멸균 50 밀리리터 원내 튜브에 넣습니다. 원심분리기는 벤치 탑 원심분리기를 사용하여 실온에서 10분 동안 1, 200배 G로 샘플을 원심분리합니다. 상체를 버리고 100%에탄올의 5밀리리터로 펠릿을 다시 씻고 다시 놓습니다.

원심분리기는 벤치 탑 원심분리기를 사용하여 실온에서 10분 동안 1, 200배 G로 샘플을 원심분리합니다. 상체를 버리고 100 % 에탄올의 1 밀리리터로 펠릿을 다시 놓습니다. 샘플을 영하 20도에 저장하여 나중에 처리하거나 즉시 샘플을 염색합니다.

1:1, 000의 비율로 초순수수에 100 나노미터 크기의 금 나노 입자를 희석하고 계측기의 설정을 최적화하는 데 사용합니다. 소변 샘플을 20회 물에서 20회 희석한 후 5밀리머 플루오-4 AM을 30분 동안 염색하고 NTA를 사용하여 샘플을 분석한다. NTA 분석 전에 텍스트 원고에 설명된 바와 같이 산화칼슘 과 인산염 결정을 준비한다.

컴퓨터와 계측기를 켜고 소프트웨어를 열고 카메라를 켭니다. 창 왼쪽 상단 모서리에 있는 캡처 아이콘을 클릭하여 캡처 모드를 시작합니다. 플랫폼이 깨끗하게 나타날 때까지 1 밀리리터 주사기를 사용하여 먼저 공기를 펌핑하여 플랫폼을 청소하십시오.

기기에 물을 2~3회 부드럽게 추가하고 또 다른 밀리리터 주사기를 사용하여 기포를 제거합니다. 플랫폼이 깨끗해지면 카메라를 보고 표면에 오염이 있는지 확인한 다음 금 나노 입자를 샘플 로딩 펌프 인젝터에 컨트롤로 추가하여 계측기를 설정합니다. 이미지가 컬러 픽셀을 표시하기 시작할 때까지 화면이나 노브의 노브에서 카메라 레벨을 조정한 다음 카메라 레벨을 줄입니다.

다음으로 화면을 조정하여 이미지를 최적화합니다. 비디오 이미지의 마우스 단추를 클릭합니다. 왼쪽 마우스 버튼을 길게 잡고 이미지를 위아래로 드래그하여 전체 보기를 가져옵니다.

주입 속도를 설정하고 카메라 화면에 금 나노 입자가 보이면 카메라를 집중시킵니다. 금 나노 입자가 검출되도록 초기 설정을 위해 주입 속도를 높게 설정합니다. 일단 감지되면, 금 나노 입자를 시각화하는 분당 50 마이크로 리터로 속도를 감소.

카메라 레벨을 조정하여 파티클을 시각화합니다. 스테인드되지 않은 샘플의 경우 화면 게인을 레벨 5에서 조정하여 카메라 포커스를 달성하고 카메라 레벨을 8으로 설정합니다. 포커스가 설정되면 샘플을 기록합니다.

최적화 후, 튜브가 깨끗하고 입자가 존재하지 않도록 다른 샘플을 평가하기 전에 물로 장치를 다시 청소하십시오. 스테인드 샘플을 분석하려면 적절한 형광 필터를 포함하는 필터 위치로 카메라를 조정하고 희석 및 염색 된 샘플을 샘플 로딩 펌프 인젝터에 적재하여 분석을 위해 분당 20 마이크로 리터로 속도를 줄입니다. 화면 게인을 5로 조정하고 카메라 레벨을 13으로 조정합니다.

각 측정 후 데이터를 저장합니다. 각 개별 샘플에 대한 5개의 판독값모두에 대한 평균 나노입자 수를 계산하고 평균의 표준 편차 또는 표준 오차를 사용하여 데이터를 분석한다. 쌍분석용T 테스트를 사용합니다.

플루오-4 AM은 50~270나노미터 크기의 칼슘 산화결정과 밀리리터당 평균 농도가 1, 2억 6천만 개, 칼슘 인산염 결정은 30~225나노미터사이였으며 평균 농도는 밀리리터당 2, 2억 2천만 개의 입자를 가졌다. 산화 하중 전에 수집된 24시간 소변 샘플에는 110~300나노미터 크기의 일부 오줌 나노결정이 포함되어 있었다. 대조적으로, 옥살레이트 후 샘플에 존재하는 오줌 나노 결정이 현저한 증가가 있었습니다.

방법의 재현성을 확인하기 위해 샘플을 세 번 측정했으며 기술적 복제에는 상당한 변화가 없었습니다. 이 프로토콜을 시도할 때 기기에 거품이 없는 샘플을 추가하는 데 어려움이 있을 수 있습니다. 이를 방지하려면 공기와 물을 기계에 추가한 다음 천천히 샘플을 추가합니다.

또한 샘플을 지속적으로 모니터링하고 거품이 없는지 확인하십시오. 이 새로운 방법은 칼슘 산화 칼슘 신장 결석 질환을 가진 개인에서 질병 진행을 모니터링 하 고/또는 신장 결석 위험을 예측 하는 테스트 됩니다.