내인성 표현 인간의 RYR1 변종의 기능적 특성화

이 프로토콜은 환자 물질을 사용하기 때문에 중요합니다. 환자가 질병이 있는 경우에, 그들의 세포를 사용하여 환자의 생물학 반응을 더 정확하게 반영해야 합니다. 이 기술은 수행하기 쉽고 간단하며 정교한 장비가 필요하지 않습니다.

이러한 방법은 진단에 사용될 수있다, 예를 들어, RYR1 돌연변이가 기능적으로 칼슘 항상성을 변화한다는 것을 증명하고 화합물의 잠재적 인 치료 기능을 테스트할 수 있습니다. 개별 연구원의 지식과 기술 기술에 따라 실제 환자 샘플을 사용하기 전에 테스트 실험을 수행해야합니다. EBV 변형 B 림프구의 세포내 칼슘 농도의 변화를 모니터링하기 위해, 크렙스 링거의 용액과 후라-2 AM에서 밀리리터 농도당 10~7번째 세포로 불멸의 B 세포를 37도에서 30분 동안 배양하여 최종 농도로 재보설한다.

인큐베이션의 끝에서, 원심분리에 의해 세포를 수집하고, 밀리리터 농도 당 여섯 번째 세포에 2 회 10에 신선한 크렙스 링거의 용액에서 펠릿을 다시 중단. 실험을 시작하기 직전에 세포를 원심 분리하고 0.5 밀리마일라 EGTA로 보충된 Krebs Ringer의 용액의 1.5 밀리리터에서 세포를 신속하게 재일시 중단하지만 칼슘은 첨가하지 않았습니다. 세포를 유리, 3밀리리터 분광로계 큐벳으로 옮기고, 최대 속도로 설정된 자기 교반기가 장착된 분광성계에 형광비를 약 30초 동안 기록한다.

단일 세포에서 칼슘 방출 반응을 평가하기 위해, 1회 106°C의 Fura-2 AM 장전세포를 Krebs Ringer용 용액의 1밀리리터에 1밀리알라 칼슘 염화물을 개별 폴리 L-L-lysine 코팅 유리 커버 슬립에 보충하고, 가습된 세포 배양시 37도에서 커버 슬립을 배양한다. 세포가 부착되면 덮개를 관류 챔버에 넣고 분당 1 밀리마일칼슘으로 보충된 Krebs Ringer용 용액의 2밀리리터에서 세포를 인내하기 시작합니다. 40배의 오일 침수 목표와 적절한 필터를 갖춘 반전형 형광 현미경을 사용하여 고정 노출 시간에 소프트웨어 제어, 충전 결합 장치 카메라 부착으로 온라인 측정을 기록합니다.

세포 자극을 달성하기 위해 12개의 판막이 있는 세포 관류 자극기를 사용하여 다양한 농도의 고뇌를 추가합니다. 인간 근육 생검에서 심포티브를 분리하기 위해 먼저 멸균 PBS로 생검을 헹구고 조직을 작고 0.5 내지 1mm 의 단편으로 다진 전에 과도한 혈액을 제거합니다. 우물당 1.5 밀리리터의 인간 근육 성장 배지와 삽입당 500 마이크로리터를 포함하는 6웰 조직 배양 플레이트의 각 우물에 2~3개의 단편을 개별 삽입에 넣고, 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다.

인간 심튜브의 칼슘 발현의 변화를 측정하기 위해 다핵된 심튜브를 관찰할 수 있을 때, 심오튜브 배양 슈퍼네티를 1밀리머 후라-2AM의 10마이크로리터로 보충된 신선한 분화 매체로 대체하여 세포 배양 인큐베이터에서 30분 간 인큐베이션을 한다. 인큐베이션이 끝나면 유리 커버 슬립 배양식을 관류 챔버로 옮기고, 2밀리알라 칼슘 염화물로 보충된 크렙스 링거의 용액으로 세포를 헹구는 다. 그런 다음 20배의 수질 침수 목표를 사용하여 입증된 온라인 칼슘 측정을 수행합니다.

본 대표적인 분석에서, 시간이 지남에 따라 서서히 회복 수준으로 되돌아간 고뇌의 첨가 후 EBV 불멸의 B 림프구에서 칼슘의 급속한 증가가 관찰되었다. 유사한 실험에서, 400 나노 몰라 해피가르진의 첨가는 2.4 임의 단위의 피크 형광 값에 도달 큰 칼슘 과도를 일으켰다. 이러한 형광값은 해당 용량 반응 곡선이 시공될 때 100%로 간주되었다.

이 분석에서 불멸의 B 세포는 20초 동안 5밀리머 카페인으로 자극되어 340 및 380나노미터 형광 비의 즉각적인 증가를 초래했습니다. 각 카페인 농도에 대해 340 x 380 나노미터의 형광 비율로 카페인 유발 피크를 계산하고 용량 반응 곡선을 구성하는 데 사용하였다. 분화된 심포우로부터의 칼슘 방출은 염화칼륨, 고뇌의 다른 농도 및/또는 카페인으로 플러싱에 대응하여 평가될 수 있으며, 정상 용량 반응 곡선을 생성할 수 있다.

세포가 Fura-2로 제대로 로드되고 340 및 380 나노미터 파장이 모두 작용제의 첨가에 반응하는지 확인하는 것이 중요합니다. 형광 칼슘 지표를 가진 세포내 칼슘 측정은 대부분의 포유류 세포에서 조사될 수 있고 다른 자극에 응하여 세포내 칼슘 변화의 연구 결과에 적용될 수 있습니다.