TGF-β 매개 내피- 중간엽 전환(EndMT)과 CRISPR/Cas9 유전자 편집을 사용하여 EndMT 이펙터의 기능평가

중간 엽 전이에 내피성 은 내피 세포가 섬유 아세포 와 같은 표현형으로 자신의 조약돌 형태를 변경하는 세포 과정입니다. 그리고 사이토카인 TGF-베타, 성장 인자 베타를 변환, 이 전환의 주요 드라이버. 세포 형태의 변화와 내피 및 중간 엽 마커의 발현 수준을 분석하면 중간엽 전이에 대한 내피발생을 평가할 수 있습니다.

신흥 데이터는 내피전 과정을 암, 심혈관 질환 및 섬유증을 포함한 다양한 질병에 연결합니다. 그리고 데이터는 내정간섭이 치료 이득일지도 모르다는 것을 건의합니다. 배아 발생 및 장기 발달 중에 발생하는 중간엽 전이 과정에 내피를 자극함으로써 연골, 뼈 및 근육과 같은 중간 균 유래 조직을 재생할 수 있습니다.

면역부동 염색에 의한 세포내 단백질을 검출하기 위해, 0.1%트리톤 X-100을 이용한 세포 투과화가 항체가 세포막을 통과할 수 있도록 하는 것이 필요하다. 이 비디오 데모와 함께, 연구원은 중간 엽 전환에 내피에서 TGF 베타와 같은 사이토카인의 역할을 조사하는 방법의 좋은 이해를 얻을 것이다. 첫째, 씨앗 1 x 10^5 미러링 췌장 내막 형 내막 MS1 세포를 DMEM의 내피 성 MS1 세포는 페니실린과 연쇄상 구균의 밀리리터 당 100 단위로 0.1 %의 젤라틴 코팅 배양 플레이트에 보충하였다.

세포 배양 인큐베이터에서 하룻밤 동안 인큐베이션 후, PBS로 세포를 세척한 후 0.25%의 트립신, 0.02%EDTA 용액을 섭씨 37도에서 2분간 치료하기 전에 PBS로 세척한다. 세포가 분리되기 시작하면 완전한 배양 배지의 5 밀리리터로 반응을 담금질하고 결과 세포 현탁액을 원심분리를 위한 15 밀리리터 튜브로 전달한다. 계산을 위한 신선한 완전 매체의 4밀리리터에서 펠릿을 다시 놓습니다.

그리고 씨앗 1 X 10^3 새로운 세포 배양 용기에 입방 센티미터 당 세포. 야간 배양 후, 5개의 마이크로몰라 TGF-베타 수용체 키나아제 억제제 SB-431542 및 DMSO 용매 대조군으로 2개의 우물을 치료한다. 그리고 세포 배양 인큐베이터에 세포를 30 분 동안 배치합니다.

인큐베이션의 끝에서, 차량 제어와 두 개의 우물을 치료 하고 TGF 베타 와 두 개의 우물 2. 3 일 후에, 밝은 필드 화상 진찰의 밑에 각 세포 처리 단의 세포 형태학을 검토하기 위하여 반전된 현미경을 이용합니다. 면역형광 염색에 의한 엔드MT 관련 마커 변경을 평가하기 위하여는, 입증된 바와 같이, 적당한 MS1 세포 배양에서 세포를 분리합니다.

그리고 세포를 1.9 X 10^3 세포 농도에서 종자 0.1%젤라틴 코팅 12 밀리미터 원형 커버 안경은 24웰 플레이트의 개별 우물 내에 배치하였다. 하룻밤 배양 후, TGF-베타의 1 나노 그램 밀리 리터로 세포를 치료 2 3 일 동안. 인큐베이션이 끝나면 PBS로 세포를 세척하고 실온에서 10 분 동안 잘 4 % 포름 알데히드의 300 마이크로 리터로 처리 된 배양을 수정하십시오.

고정의 끝에서, 실온에서 10 분 동안 잘 당 0.1 %의 300 마이크로 리터와 PBS로 세포를 과미화하기 전에 PBS로 세포를 세 번 세척. 인큐베이션이 끝나면 PBS에서 세포를 세 번 세척하고 PBS에서 3%BSA로 세포를 차단합니다. 실온에서 45분 후, 실온에서 45분 동안 1차 PECAM-1 및 SM22-알파 항체로 세포를 라벨로 지정한 다음 PBS에서 3개의 세척을 합니다.

마지막 세척 후, 실온에서 45분 동안 적절한 이차 항체로 세포를 배양하고, DAPI 보충 장착 배지및 커버 슬립으로 세포를 장착하기 전에 PBS로 세포를 세 번 세척한다. 그런 다음 명확한 매니큐어로 커버 슬립의 가장자리를 밀봉하고 표준 이미징 프로토콜에 따라 적절한 필터를 사용하여 형광 공초점 현미경 검사법에 의한 세포 마커 발현을 이미지합니다. TGF-베타 2로 3 일간의 치료 후, 내피 MS1 세포는 조약돌 모양의 구조를 잃고 스핀들 모양의 중간 엽 과 같은 세포로 분화합니다.

이러한 TGF-베타 2 유도된 분화는 세포가 TGF-베타 수용체 키나아제 억제제 SB-431542에 노출될 때 억제된다. 내피 단백질 PECAM-1의 발현은 TGF-베타 2 자극 후 강력하게 감소되는 반면 중간체 인자 SM-22 알파는 심오하게 강화된다. 또한, 달팽이는 TGF-베타 2 노출에 의해 현저하게 강화되는 반면 슬러그 발현은 영향을 받지 않는다.

관찰된 CRISPR-Cas9 유전자 편집은 달팽이 발현을 방해하는 Cas9-현현 MS1 세포로 2개의 독립적인 달팽이 단일 가이드 RNA의 도입을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다. 달팽이의 녹아웃은 MS1 세포에서 TGF-베타 2에 의해 구동 섬유 아세포 같은 세포 형태를 억제하고 TGF 베타 2 중재 PECAM-1 감소 및 SM-22 알파 향상을 차단하기에 충분하다. 면역형광에 의한 내피 및 중간엽 마커의 세포 형태 및 발현의 변화에 대한 평가는 서양 블롯 분석에서 정량적 PCR에 대한 이러한 마커의 발현을 측정함으로써 더욱 검증될 수 있다.

중간 엽 전이에 내피를 검출하기위한이 기술은 연구원이 여러 질병에서 발생하는 생리적 과정으로이 새로운 중요성을 조사 할 수 있었습니다.