다이아몬드 광원의 대상 시리얼 데이터 수집 수정
2021년 2월 26일
다이아몬드 빔라인 I24에서 직렬 싱크로트론 결정예촬영을 위한 고정 대상 샘플 준비, 데이터 수집 및 데이터 처리에 대한 포괄적인 가이드를 제시합니다.
시리얼 싱크로트론 결정학, 또는 SSX는, MX.It의 상대적으로 새롭고 빠르게 개발 영역은 낮은 용량과 실온 실험에 매우 적합하지만, 아마도 가장 중요한 것은, 그것은 역학을 따르는 데 정말 적합합니다. 이를 통해 작용 중인 단백질의 스톱 모션 영화를 만들 수 있습니다. I24에서는 여러 가지 SSX 모드를 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜은 제한된 양의 샘플을 사용하여 광범위한 직렬 실험을 허용하는 고정 대상 SSX에 중점을 둡니다. 실리콘 칩은 익숙하지 않은 경우 로딩 및 청소 할 때 손상 될 수 있습니다. 또한 칩 정렬 프로토콜은 많은 결정학자에게 완전히 새롭고 데이터 처리는 표준 회전 데이터와 약간 다릅니다.
칩 홀더를 준비하려면 폴리에스테르 호일 2장을 약 6-6센티미터 사각형으로 자르고 시트를 두 개의 베이스 플레이트 위에 놓습니다. 금속 밀봉 링을 사용하여 시트를 제자리에 고정한 다음 여분의 호일을 조심스럽게 당겨 주름을 제거합니다. 다음으로, 분석할 결정의 크기에 비해 적절한 크기의 조리개를 가진 실리콘 칩을 선택한다.
글로우는 0.39 밀리바에서 25초 동안 칩을 배출하며, 15밀리암페어 전류를 가짐에 따라 칩을 배출합니다. 핀셋을 사용하여 실리콘 칩을 칩 로딩 스테이지에 배치하고 올려지지 막대가 아래로 향합니다. 그런 다음, 파이펫을 사용하여, 칩의 평평한 쪽에 마이크로 결정 슬러리의 200 마이크로 리터를 적용, 칩의 모든 도시 블록을 커버슬러리를 확산.
칩이 손상된 경우 작은 폴리에스테르 호일로 구멍을 덮어 균일한 진공을 적용할 수 있도록 하십시오. 그런 다음 부드러운 진공을 적용하여 칩을 통해 모든 여분의 액체를 흡입합니다. 칩 로딩 단계에서 칩을 제거하고 필터 용지로 칩의 밑면을 조심스럽게 얼룩서 과도한 액체를 제거합니다.
로드된 칩을 가이드 마크 사이에 칩 홀더의 더 큰 절반에 놓고 평평한 면을 아래로 놓습니다. 칩 홀더의 작은 절반을 칩에 놓아 밀봉합니다. 칩 홀더의 두 반쪽은 제자리에 스냅해야합니다.
그런 다음 육소 볼트를 사용하여 칩을 제자리에 단단히 고정시하십시오. 칩을 정렬하려면 마운트에 접근하는 동안 칩 홀더를 30도 각도로 유지합니다. 그런 다음 운동 용 마운트를 사용하여 로드된 칩을 빔 라인의 XYZ 단계에 배치합니다.
자석이 접촉할 때 칩 홀더가 흐름과 평행하게 회전하도록 하고 제자리를 클릭합니다. 칩이 배치되면 빔 라인 온축 보기 시스템과 칩 정렬 그래픽 사용자 인터페이스를 사용하여 칩의 왼쪽 상단 을 찾습니다. X, Y 및 Z의 Fiducial 0을 중심으로 하려면 초점에서 위아래로 이동하여 Y를 정렬하고 X를 정렬한 다음 Fiducial 0을 클릭합니다.다음 Fiducial 0을 정렬한 후 프록시 1과 2를 같은 방식으로 X선 빔과 정렬한 후 공동 조정 시스템 만들기를 클릭합니다.
그런 다음 블록 확인을 클릭"각 도시 블록의 첫 번째 우물로 XYZ 단계를 이동합니다. X선 십자선이 조리개와 정렬되면 칩이 정렬됩니다. DIALS에서 스팟 검색 결과를 나타내는 이 그래픽 표현에서 업데이트된 적음 플롯을 관찰할 수 있습니다.
히트를 클릭하면 해당 회절 이미지가 DIALS 이미지 뷰어에 표시됩니다. 이 표에서는 방문 중에 데이터가 수집될 때 실시간으로 업데이트되는 현재 인덱싱 및 통합 속도를 시각화할 수 있습니다. 단위 셀 매개 변수의 시각화는 다형성을 나타낼 수 있습니다.
유용한 매개 변수의 2차원 플롯을 생성하여 적재 또는 탈수 효과로 인해 발생하는 변형을 나타낼 수도 있습니다. 입체 투영은 로딩 프로토콜에 다시 공급될 수 있는 기본 방향의 존재 또는 부재를 나타낼 수 있습니다. 예를 들어, 이 프로젝션에서는 리조지메 결정으로 칩을 과부하는 효과가 관찰될 수 있다.
칩을 로드할 때 파이펫을 천천히 사용하여 손가락을 사용하여 칩 위에 파이펫을 놓습니다. 이렇게 하면 칩에 닿지 않으며 실리콘의 구멍을 실수로 찌르는 것을 방지할 수 있습니다. 데이터를 처리할 때 자동화된 파이프라인을 사용할 수 있습니다.
이렇게 하면 실험이 어떻게 진행되고 있는지, 그리고 무언가를 변화시켜야 하는 경우 에 대한 좋은 아이디어를 제공합니다. 이 방법은 상당한 양으로 결정화 될 수있는 모든 단백질 시스템에 적용 될 수있다. 그리고 반응은 빛 엑스레이 또는 급속한 혼합에 의해 시작될 수 있습니다.
일련의 구조에 대한 동적 연구는 단백질이 어떻게 작동하는지에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
개요
본 논문은 Diamond 빔라인 I24에서 수행되는 직렬 싱크로트론 결정학을 위한 고정 표적 시료 준비, 데이터 수집 및 데이터 처리 과정을 종합적으로 안내합니다. 특히 칩의 무결성을 보장하면서 제한된 양의 시료로 실험을 수행하는 방법론을 강조합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 구조생물학
- 결정학
- 단백질 동역학
배경
- 직렬 싱크로트론 결정학(SSX)은 거대분자 결정학 분야의 발전하고 있는 영역입니다.
- 이는 저선량 및 상온 실험에 적합합니다.
- SSX를 통해 단백질의 동적 연구가 가능하며, 이를 통해 단백질의 작용을 시각화할 수 있습니다.
- 고정 표적 SSX는 제한된 양의 샘플을 효과적으로 활용할 수 있습니다.
연구 목적
- Diamond 빔라인 I24에서 고정 표적 SSX를 위한 상세 프로토콜을 제공합니다.
- 최적의 데이터 수집을 위해 적절한 칩 준비 및 정렬 방법을 보장합니다.
- 표준 회전 데이터와 비교하여 데이터 처리상의 차이점을 강조합니다.
사용된 방법
- 폴리에스터 호일 및 밀봉 기술을 이용한 실리콘 칩 준비.
- 칩에 미세결정 슬러리 도포 및 진공 흡입.
- 빔라인의 그래픽 사용자 인터페이스를 이용한 칩 정렬.
- 자동화 파이프라인을 이용한 실시간 데이터 시각화 및 처리.
주요 결과
- 칩의 성공적인 정렬은 정확한 데이터 수집으로 이어집니다.
- 실험 중 인덱싱 및 통합 속도의 실시간 모니터링이 가능합니다.
- 단위 격자 파라미터의 시각화를 통해 다형체와 로딩 효과를 확인할 수 있습니다.
- 동적 연구는 단백질 기능에 대한 통찰력을 제공합니다.
결론
- 본 프로토콜은 고정 표적 SSX 실험의 효율성을 향상시킵니다.
- 성공적인 데이터 수집을 위해서는 칩의 적절한 취급과 정렬이 매우 중요합니다.
- SSX를 이용한 동적 연구는 단백질 거동에 대한 이해를 크게 진전시킬 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
고정 표적 직렬 싱크로트론 결정학(Fixed-target serial synchrotron crystallography)을 통해 구조 생물학자는 제한된 시료 양으로도 단백질의 동적 연구를 수행할 수 있으며, 고해상도 구조 분석을 통한 표적 검증이 가능합니다. 이 방법은 데이터 품질을 유지하면서 시료 소모를 줄여주는데, 이는 단백질 발현 및 정제가 병목 구간이 되는 초기 단계의 발견 과정에서 매우 중요합니다. 또한 상온 및 시간 분해 실험을 용이하게 함으로써 단백질 기능에 대한 기전적 이해를 높이고, 전임상 개발 단계에서 리드 최적화 및 리스크 감소 노력에 기여합니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 실제 작동 중인 단백질의 구조를 포착함으로써 치료 가설의 검증을 가능하게 하며, 기능적 표적 유효성 확인을 지원합니다.
- 운영적 가치: 대량의 결정 부피에 대한 의존도를 낮추어, 발현율이 낮은 까다로운 표적의 스크리닝을 가능하게 합니다.
- 예측 신뢰도: 결합 부위 특성 및 작용 기전에 대한 정보를 제공하는 구조적 데이터를 생성하여, 표적 선정 결정의 정확도를 높입니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: 마이크로결정으로부터 정량적 전자 밀도 지도를 생성하여 정밀한 리간드 결합 평가를 가능하게 합니다.
- 운영적 가치: 칩 기반 시스템을 통해 샘플 장착 및 정렬을 표준화하여 스크리닝 캠페인 전반의 재현성을 향상시킵니다.
- 분석 준비성: 프래그먼트 또는 화합물 스크리닝 중 go/no-go 결정을 지원하는 실시간 히트율 및 인덱싱 지표를 생성합니다.
중개 및 전임상 연구
- 과학적 가치: 약물 결합 또는 안정성에 영향을 미칠 수 있는 다형태 및 구조적 변화를 밝혀내어 제형 전략 수립에 도움을 줍니다.
- 운영적 가치: 기능적 분석과 상관관계를 가질 수 있는 시간 분해 구조 데이터를 획득하여, 중개 바이오마커 정렬을 강화합니다.
- 리스크 완화: 로딩으로 인한 인위적 결과물이나 탈수 효과를 조기에 식별하여, 후속 최적화 단계에서의 오해석 위험을 줄입니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
고정 표적 SSX는 표적 식별 및 분석법 개발 이후의 발굴 워크플로우에 통합되어, 리드 물질 식별 및 전임상 검증을 안내하는 구조적 통찰력을 제공합니다. 이는 화합물 결합 및 단백질 동역학에 대한 신속한 구조적 피드백을 제공함으로써 반복적인 설계-제작-테스트-분석(design-make-test-analyze) 사이클을 지원합니다.
- 발견 생물학: 작용 기전과 관련된 리간드 유도 구조 변화 및 단백질 역학을 시각화하여 가설 검증을 지원합니다.
- 스크리닝: 표준화된 칩 준비 및 정렬을 통해 분석 준비 상태를 가능하게 하여 화합물 스크리닝 전반에서 일관된 데이터 품질을 보장합니다.
- 분석: 단위 격자 파라미터, 히트율 및 적분 지표를 포함한 정량적 결과물을 제공하여 실험 조건의 객관적인 비교를 가능하게 합니다.
- 중개 연구: 생체 이용률이나 표적 결합에 영향을 줄 수 있는 역학을 밝힘으로써 구조적 관찰을 기능적 결과와 연결합니다.
- 기업적 재사용: 여러 표적에 대한 구조 스크리닝을 위해 재사용 가능한 플랫폼을 구축하여, 다중 프로젝트 환경에서 재검증 노력을 줄여줍니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 생체 내 조건과 유사한 환경에서 고해상도의 시간 분해 구조 데이터를 제공함으로써 타겟 검증의 예측 신뢰도를 높입니다.
- 운용적 가치: 표준화된 칩 핸들링, 정렬 프로토콜 및 자동화된 데이터 처리 파이프라인을 통해 재현성과 확장성을 향상시킵니다.
- 전략적 가치: 시료 소모를 최소화하고 구조 최적화 캠페인에서 신속한 반복 수행을 가능하게 하여 자본 효율성을 개선합니다.
- 포트폴리오 영향: 타겟-리간드 상호작용의 메커니즘적 모호성을 줄임으로써 위험 조정 기반의 추진 결정력을 지원합니다.
구현 시 고려 사항
- 거대분자 결정학에 대한 전문 지식과 방사광 가속기 기반의 시료 처리 기술에 대한 숙련도가 필요합니다.
- 키네마틱 마운팅, 온-액시스(on-axis) 관찰 및 DIALS와 같은 자동화된 데이터 파이프라인을 갖춘 빔라인 인프라의 접근 권한이 필요합니다.
- 데이터 일관성을 보장하기 위해 칩 준비, 진공 흡입 및 정렬 절차에 대한 팀 간 표준화가 필수적입니다.
- 결정 크기와 공간군에 따른 적응 고려 사항이 포함되며, 이에 따라 조리개 선택 및 분산 기술의 조정이 필요합니다.
- 로딩 및 세척 중의 칩 파손 가능성과 시간이 지남에 따라 결정 품질을 변화시킬 수 있는 탈수 효과에 대한 민감성과 같은 실질적인 제약 사항이 포함됩니다.
