Name: 다이아몬드 광원의 대상 시리얼 데이터 수집 수정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: 학습하세요 고정 대상 직렬 동기가속기 결정학 방법으로 단백질 역학을 연구하는 기법을. 실리콘 칩 준비와 정렬, 실시간 데이터 처리 과정을 통해 제한된 시료로도 고품질 회절 데이터를 획득할 수 있습니다.

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이 작품은 유럽 위원회의 호라이즌 2020 프로그램에 의해 투자 iNEXT-디스커버리 (그랜트 871037)에 의해 지원되었다.

1. 칩 준비 및 로드
참고: 이 과정은 습도 조절환경(그림 1)내에서 발생하며, 일반적으로 80%에서 90% 이상의 상대 습도가 높으며, 단백질 결정이 건조되는 것을 방지합니다. 일단 장전되고 밀봉되면, 결정은 24 시간 이상 살아남을 수 있습니다. 그러나 이것은 결정 시스템마다 크게 다를 수 있습니다. 챔버 내에서 실리콘 칩(도 1),실리콘 칩, 폴리 에스테르 호일을 가진 칩 홀더(도 2),p200 파이펫, 200 μL 파이펫 팁, 핀셋, 필터 용지 및 단백질 크리스탈 슬러리를 보유하기 위해 적중 단계에 부착 된 저전력 진공 펌프가 필요합니다.
<ol><li>칩 홀더를 준비합니다.<ol>
<li>폴리에스테르 호일 2장을 약 6cm x 6cm 의 사각형으로 자른다.</li>
		<li>폴리에스테르 시트를 두 개의 베이스 플레이트 위에 놓습니다(크고 작은).</li>
		<li>금속 밀봉 링을 사용하여 폴리 에스테르 시트를 제자리에 고정합니다.</li>
		<li>조심스럽게 나중에 쉽게 시각화하고 샘플링 샘플을 중심으로 하기 위해 주름을 제거하기 위해 여분의 폴리 에스테르 호일을 당깁니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>결정의 크기에 비해 적절한 크기의 조리개(7-30 μm)가 있는 실리콘 칩을 선택합니다.</li>
	<li>글로우는 0.39mBar에서 25초 동안 칩을 배출하고 15mA의 전류를 사용하여 칩에 마이크로 크리스탈을 쉽게 퍼뜨릴 수 있도록 합니다.</li>
	<li>실리콘 칩을 칩 로딩 단계에 올려 놓는 막대가 있는 핀셋을 사용하여 놓습니다.</li>
	<li>파이펫을 사용하여 마이크로 크리스탈 슬러리의 200 μL을 칩의 평평한 면에 적용합니다.</li>
	<li>칩의 모든 "도시 블록"을 커버하기 위해 크리스탈 슬러리를 확산.</li>
	<li>칩이 손상된 경우, 균일 한 진공을 적용 할 수 있도록 폴리 에스테르 호일 또는 필터 파이펫 팁의 작은 조각으로 구멍을 덮어.</li>
	<li>모든 여분의 액체가 칩을 통해 흡입 될 때까지 부드러운 진공을 적용합니다.</li>
	<li>핀셋으로 칩 로딩 단계에서 칩을 제거합니다.</li>
	<li>칩 밑면을 필터 용지로 조심스럽게 얼룩서 과도한 액체를 제거합니다.</li>
	<li>로드된 칩을 칩 홀더의 더 큰 절반에 배치하여 가이드 마크 사이에 평평한 면을 표시합니다.</li>
	<li>칩 홀더의 작은 절반을 위에 배치하여 칩을 밀봉하십시오.<ol>
<li>칩 홀더의 두 반쪽이 제자리에 스냅됩니다. 후반부가 플러시앉아 있지 않으면 홀더 180°를 회전하여 자석을 올바르게 정렬합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>칩 홀더를 육사 볼트로 닫은 나사로 고정하여 칩을 제자리에 안전하게 고정시하십시오. 참고: 또는, 칩 홀더(37)의폴리에스테르 호일의 두 층 사이에 끼워진 크리스탈 슬러리(~15μL)의 더 작은 부피로 유사한 방식으로 적재할 수 있거나, 또는 50μm 두께의 양면 접착제 스페이서를 사용하여 더 작은 부피를 적재할 수 있다. . 접착제 스페이서를 사용하면 여러 샘플(또는 리간드 스너브와 같은 샘플의 변형)을 각 칩리스 칩에 로드할 수 있습니다. 실리콘 칩을 로드하는 음향 낙하 배출 (ADE)을 악용하는 보완 적재 접근 방식은 다이아몬드39에서도사용할 수 있습니다. ADE를 사용하면 파이펫 하중보다 적은 양의 크리스탈 슬러리를 사용하여 칩을 로드할 수 있습니다. 그것은 특히 유용한 기술 시료가 부족 할 때, 비록 화학 조성 및 슬러리의 점도 고려 되어야 한다.</li>
</ol>2. 빔 라인에서 GUI 및 설정
<ol><li>간단한 EPICS 디스플레이 관리자(edm) 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)(그림3a)를통해 데이터 수집을 위한 모든 칩 정렬 및 설정을 수행합니다. 이를 통해 빔라인 계측에 대한 포인트 앤 클릭 인터페이스를 제공하고 Python 기반 데이터 수집을 위한 입력 매개 변수를 제공합니다. 서브 윈도우는 샘플 홀더(도 3b)또는 레이저 / LED 펌프 프로브 실험(도 3c)의하위 영역에서 수집하기위한 추가 제어를 제공합니다.</li>
</ol>3. 칩 정렬
<ol><li>운동 탈것을 사용하여 XYZ 단계에 로드된 칩을 빔라인(그림 4a에도시됨)에 놓습니다.<ol>
<li>여행 방향을 따라 스테이지를 당기는 것을 피하십시오. 운동성 마운트의 자석은 매우 강하기 때문에 우연히 매우 쉽게 수행 할 수 있습니다.</li>
		<li>마운트에 접근할 때 칩 홀더는 약간의 각도(±30°)로 유지되어야 합니다. 자석이 접촉하면 칩 홀더가 바닥 (0 °)에 평행하게 회전할 수 있으며 칩 홀더가 제자리에 클릭합니다(그림 4b).</li>
		<li>칩을 언로드할 때 역방향 경로를 따릅니다. 칩 홀더를 멀리 당기기 전에 칩을 회전시키고 스테이지에서 멀리 각도로 향합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>빔라인의 축 보기 시스템과 칩 정렬 GUI를 사용하여 칩의 왼쪽 상단 을 찾습니다. 신탁은 서로 직각에서 세 개의 사각형, 두 개의 작은 하나 큰(그림 5a)입니다. 칩이 다시 켜지므로 칩이 흰색 사각형으로 조리개가 있는 어둡게 나타납니다.</li>
	<li>X, Y 및 Z(그림 5b)의신탁 0에 중심. 각각 왼쪽/오른쪽 및 위/아래로 이동하여 X와 Y를 정렬합니다. 칩을 초점 안팎으로 이동하여 Z를 정렬합니다.</li>
	<li>신탁 0 설정을 클릭합니다.</li>
	<li>모든 수탁자(오른쪽 상단, 그림 5c)와fiducial 2(왼쪽 아래, 그림 5d)에대해 3.2를 반복하여 모든 신탁을 X선 빔과 정렬합니다.</li>
	<li>코-좌완 시스템을눌러 좌표 매트릭스를 생성하고, 이는 모든 후속 움직임이 칩 좌표 프레임에서 수행될 수 있도록 하는 스테이지에 비해 칩의 오프셋, 피치, 롤 및 야우를 계산합니다.</li>
	<li>블록 확인을 클릭하여 XYZ 단계를 각 도시 블록의 첫 번째 우물로 이동하여 칩이 잘 정렬되어 있는지 시각적으로 확인합니다.</li>
	<li>X선 십자선이 조리개와 정렬되면 칩이 정렬됩니다. 그렇지 않은 경우 3.2-3.3 단계를 반복하십시오. 참고: 오작동 정렬(파손된 fiducials)의 경우 칩의 다른 조리개를 "정렬 유형" 풀다운 메뉴를 사용하여 정렬에 사용할 수 있습니다. 고정 대상 데이터 수집에는 다양한 유형의 칩이 제공됩니다. 다른 칩 유형은 '칩 유형'풀다운 메뉴를 사용하여 수용됩니다. I24에서 사용되는 가장 일반적인 칩 유형은 '옥스포드'와 '사용자 정의'칩입니다. 칩의 조리개와 신탁의 숫자와 간격은 풀다운 메뉴를 통해 정의된 칩 사전에서 읽습니다. 커스텀 칩을 사용하면 조리개 간격을 즉석에서 정의할 수 있으며, 이는 백막 시트 온 시트 또는 크리스탈이홀더(37)에무작위로 있는 다른 '칩리스' 타입 칩에 특히 유용합니다. 새로운 파이썬 GUI, 이동 - 온 - 클릭 기능과 자동화 된 칩 정렬을 제공하는 현재 개발 중이지만,이 원고의 작성 시 일상적인 사용에 대한 아직 준비가되지 않았습니다.</li>
</ol>4. 데이터 수집 설정
참고: 데이터 수집 설정은 연구 중인 시스템과 수행할 실험에 따라 달라집니다. 이것은 간단한 SSX 실험에서 배열할 수 있습니다., 낮은 복용량 구조를 수집, 레이저 또는 빠른 혼합을 사용 하 여 시간 해결 실험에 다른 시간 지연에 여러 완전 한 데이터 집합을 필요로 하는 반응을 시작 하기 위해. 데이터 수집을 설정하려면 다음 매개 변수를 정의해야 합니다.
<ol><li>실험 변수: 폴더, 파일 이름, 노출 시간, 전송 시간, 검출기 거리 및 조리개당 샷 수를 적절히 입력합니다.</li>
	<li>칩 유형: 위에서 설명한 바와 같이 칩 유형을 사용 중 칩과 일치시다.<ol>
<li>박막 또는 '칩리스' 칩을 사용하는 경우 칩 유형을 없음으로 설정합니다.</li>
		<li>GUI에서 x와 y 모두에서 단계 및 단계 크기를 정의합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>맵 유형 설정: 이를 통해 데이터 수집을 위해 칩의 하위 섹션을 선택할 수있습니다(그림 3b). '없음'은 칩의 모든 조리개에서 데이터를 수집한다는 것을 의미합니다. '라이트'는 칩의 선택된 도시 블록에서 데이터를 수집함을 의미합니다(그림3b). 예를 들어 칩 영역이 제대로 로드되지 않거나 비어 있는 것으로 알려진 경우에 유용할 수 있습니다. 'Full'을 사용하면 데이터 수집을 위해 개별 조리개를 선택할 수 있습니다. 이 경우 올바르게 포맷된 텍스트 파일을 제공해야 합니다. 자세한 내용과 템플릿은 빔라인 직원으로부터 얻을 수 있습니다.</li>
	<li>펌프 프로브: 펌프 프로브 실험 유형과 원하는 시간 지연을 선택합니다. 펌프의 트리거링(일반적으로 LED 또는 레이저)은 종종 특정 실험에 특정하므로 여기에 자세히 설명되지 않습니다.<ol>
<li>'짧은' 지연은 펌프와 프로브 사이의 각 조리개에 거주할 때 실험을 참조합니다(예: 펌프, 프로브, '다음 샘플로 이동). 지연은 일반적으로 1초 또는 수십 밀리초의 순서로 이루어집니다.</li>
		<li>긴 지연은 흥분을 참조하고 다시 방문 (EAVA) 전략, 여기서 조리개는 두 번 방문, 방문 사이의 정의 된 시간 지연 (즉, 펌프, 이동, 펌프, 이동, 프로브, 이동, 프로브, 프로브 등). 시간 지연은 계산되고 X선 노출시간(도 3c)이며일반적으로 ~1초 이상이다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 일반적인 데이터 수집 방법
참고: 수행 중인 실험 유형을 정의하는 주요 매개 변수는 다음과 같습니다. 이 섹션에서는 프로토콜 3의 다른 설정이 "데이터 수집 설정"으로 정의되었다고 가정합니다.
<ol><li>
시나리오 1: 저용량 데이터 수집. 샘플 홀더의 선택한 모든 조리개에서 단일 회절 이미지의 컬렉션입니다.<ol>
<li>조리개당 샷 수를 1개로 설정합니다.</li>
		<li>펌프 프로브를 없음으로 설정합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
시나리오 2: 샘플 홀더의 모든 선택된 조리개에서 순차적으로 n 이미지를 수집하는 용량 시리즈. 칩은 각 조리개에 고정되어 있으며 각 n 이미지 집합이 수집됩니다.<ol>
<li>조리개당 샷 수를'n'으로 설정합니다. n=5, 10, 20 또는 10의 다른 배수인 경우 처리가 단순화됩니다. n 이 5를 < 경우 트렌드를 확립하기가 어렵습니다. 칩을 커버하는 데 필요한 총 시간과 n이 증가할 때 생성된 이미지 파일 수를 고려하는 것이 유용합니다.</li>
		<li>펌프 프로브를 없음으로 설정합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
시나리오 3: 펌프 프로브 방법<ol>
<li>펌프 프로브 풀다운 메뉴에서 방법을 선택하여 레이저 발산 제어 센터를 엽니다.</li>
		<li>펌프 프로브 실험의 경우 각 조리개 옵션에서 레이저 Dwell을 채웁니다.</li>
		<li>EAVA의 경우 각 조리개와 X선 노출에서 레이저 Dwell을 채우고 계산을클릭합니다.</li>
		<li>원하는 지연 시간에 대해 edm GUI 펌프 프로브 드롭다운 메뉴에서 적절한 반복 옵션을 선택합니다.</li>
		<li>실험에 레이저 2 Dwell 섹션에서 사전 조명 단계 채우기가 필요한 경우.</li>
		<li>모든 실험 변수가 정의된 후 매개 변수 설정 및 짧은 목록을 만듭니다. 이렇게 하면 실험 변수가 지오브릭 컨트롤러에 로드됩니다. 이 작업이 완료되면 시작은 검출기를 이동하고 백라이트를 이동하고 데이터 수집을 시작합니다. 데이터 수집을 설정하는 모든 지점에서 각 단계의 상태 및 결과에 대한 피드백이 인쇄되는 터미널 창을 열어 두는 것이 유용합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 데이터 처리
참고: 피드백이 필요한 긴급성에 따라 광범위하게 말하는 데이터 처리는 세 그룹으로 나눌 수 있습니다. 빠른 피드백은 결정이 존재하는지, 그리고 만약 그렇다면 어떤 숫자로 표시해야 합니다. 이렇게 하면 데이터 수집이 계속됩니다. 데이터 수집과 비교 가능한 시간 척도에서 더 느려질 수 있지만 여전히 수행되어야 하는 데이터 인덱싱 및 통합을 수행합니다. 반사 강도를 구조 용액및 전자 밀도 맵 생성을 위한 mtz 파일로 병합 및 스케일링하면 최종 단계를 나타내며 여전히 느려질 수 있습니다. 여기서 처음 두 단계에 대한 I24의 파이프라인 시작은 실시간 피드백이 실험을 안내하는 데 필요한 만큼 논의될 것이지만, 적중률 및 크기 조정 통계와 같은 메트릭은 전자 밀도 를 검사하는 데 대체되지 않으며, 이는 리간드가 바운드되어 있거나 반응이 발생했다는 유일한 확인을 제공할 수 있습니다. 에서 결정로.
<ol><li>빠른 피드백<ol>
<li>데이터 처리 모듈을 로드하려면 모듈 유형이 빔라인 워크스테이션의 터미널에 i24-ssx를 로드합니다.</li>
		<li>히트 발견 분석 유형 i24-ssx /path/to/visit/directory/를 단말으로 실행하려면 i24-ssx/dl/i24/data/2020/mx12345-6/ 참고: 이 세 개의 터미널 창을 열고, 데이터가 디스크에 기록되면, 고급 광원에 대한 회절 통합 (DIALS) 40,41(그림 6a)에서발견 결과를 찾는 그래픽 표현.<ol>
<li>기본 설정은10th 이미지마다 점수가 매기이며 몇 초마다 새로 고쳐계산 부하를 최소화합니다.</li>
			<li>위의 명령 끝에 인수를 추가하여 기본값을 변경합니다. 예를 들어, 'i24-ssx/dls/i24/데이터/2020/mx12345-6 2' i24-ssx는 다른 모든 이미지에서 적중 검색이 실행됩니다. 그러나 이렇게 하면 클러스터(공유 리소스)에 과도한 부담을 주고 처리 시간을 늦출 수 있습니다. 그래프는 인덱싱이 성공할 가능성에 따라 색상으로 코딩되며, 빨간색 표시는 최소 15개의 브래그 스팟이 발견되었으며(인덱싱의 가능성이 좋음), 파란색은 유용한 회절을 거의 또는 전혀 표시하지 않습니다.</li>
			<li>스팟 파인더 인터페이스의 스팟을 클릭하여 DIALS 이미지 뷰어에 관심 있는 회절 이미지를 봅니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>인덱싱 및 통합 피드백 참고: 회절 데이터의 인덱싱 및 통합은 dials.still_process 함수 40,41을사용하여 DIALS로 수행됩니다. 따라서 결정(예상 결정 공간 그룹, 단위 셀 및 실험 형상)과 관련된 특정 정보를 .phil 텍스트 파일에 넣어야 합니다.<ol>
<li>터미널에서 모듈 로드 다이얼을 입력하여 다이얼을 로드합니다.</li>
		<li>데이터 집합 유형 dials.still_process/경로// / 이미지/ /pathto/phil-file.phil. monitor_stills_process.py 입력하여 stills_monitor 스크립트를 실행하여 데이터 집합을 모두 계속 처리한 진행 상황을 모니터링할 수 있습니다(모듈 로드 i24-ssx를 수행한 후 현재 방문으로 디렉터리 변경)(그림6b).</li>
		<li>인덱싱된 회절 데이터의 단위 셀분포(그림 7a)는명령 ctbx.xfel.plot_uc_cloud_from_experiments/경로/투/다이얼/출력/*refined.expt combine_all_input=true를 사용하여 모니터링할 수 있으며, 이는이전에 설명한 바와 같이 단위 셀 다형성을 식별하고 해결하는 데 특히 유용하다.</li>
		<li>'Visualzie'의 경우, 어떻게, 이 분포는 명령 파이썬 pacman.py/방문/처리/_hit_finding/chip.out을사용하여 2D플롯(도 7b)을생성하여 고정 대상에 따라 다릅니다.</li>
		<li>다이얼스 커맨드 dials.stereographic_projection hkl=0,0,1 expand_to_P 1 =true/path/to/dials/output/*refined.expt를사용하여 모든 인덱싱된 회절 데이터(그림7c)의스테레오그래픽 프로젝션을 생성합니다. 참고: Bravais 격자의 대칭이 병합된 데이터가 완벽한 쌍둥이로 나타나는 공간 그룹 대칭보다 높은 결정에서 스틸 데이터를 처리할 때 일반적인 병리학입니다. 데이터 처리 알고리즘은 이 병리학을 해결하기 위해 진화했다 43,44,45,46 하지만 사용자는 자신의 데이터를 처리하는 동안이 점을 염두에 두어야한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

직렬 싱크로트론 데이터 수집은 MX 빔라인에서 비교적 새로운 기술로 현재 XFELs에서 수행되고 있는 초고속 데이터 수집과 기존 싱크로트론 기반 MX 간의 격차를 해소합니다. 이 원고는 빔 라인 I24, 저용량, 용량 시리즈 및 시간 해결 실험을위한 다이아몬드 광원에서 고정 대상 시리얼 데이터를 성공적으로 수집하는 방법에 대한 개요를 제공하는 것을 목표로합니다. 표준 결정학과 마찬가지로, 샘플 준비는 구조 용액의 주요 병목 목입니다. SSX는 다르지 않으며, 충분한 양으로 균일한 결정 슬러리의 준비는 아직 단일 큰 단백질 결정의 성장과 같은 연구와 정제의 수십 년혜택을받지 못했습니다. 그러나 이러한 슬러리의 준비는 이 논문의 범위를 벗어났으며 다른 곳에서36을요약했습니다. 여기서 설명된 접근 방식의 중요한 단계는 사용하기 쉬운 GUI 인터페이스(3단계) 및 자동화된 데이터 처리 파이프라인(6단계)을 사용하여 사용 가능한 샘플을 신중하게 사용하여 칩 로딩(1단계)과 실험이 어떻게 진행되어야 하는지 를 알리는 것을 포함한다.
빠른 피드백 파이프라인은 사용자가 데이터 수집 중에 초기 적중률을 평가하여 성공적인 데이터 수집을 위해 후속 칩 로딩 프로토콜을 알릴 수 있는 강력한 도구입니다. 적중률이 낮은 <5%에 직면했을 때, 사용자는 불완전한 데이터를 수집하거나 추가 수집으로 빔타임을 낭비할 위험이 있습니다. 이 경우 샘플을 풀레이션하고, 부드러운 원심분리에 의해 농축될 수 있으며, 1.5단계에서 더 큰 부피를 로드할 수 있다. 높은 적중률은 일반적으로 유리하지만 오버로드가 동일한 우물에서 여러 결정으로 이어지는 수익률이 감소하는 지점이 있습니다. 다이얼은 다중 격자 회절데이터(50)를처리할 수 있지만, 인덱싱 및 통합보다 더 큰 관심사는 정확한 시간 해결 실험을 위해 레이저 광 또는 신속한 혼합에 의한 결정의 균일한 활성화에 결정그룹화할 수 있는 해로운 효과이다. 따라서 시간 해결 된 실험에 대한 고정 대상과 부하를 피하기 위해 특별한주의를 기울여야합니다.
인덱싱 및 통합 처리 단계는 빔 방향을 나타내는 중앙 십자가, 개별 격자의 hkl 001 반사 방향을 나타내는 각 점, 빔 축에서 90° 회전을 나타내는 원의 외부 링으로 플롯을 생성합니다. 이는 결정의 기본 방향이 있는 경우 데이터 완성도에 영향을 미치고 더 많은 데이터를 수집하거나 로딩 프로토콜을 변경할 필요성을 나타냅니다. 도 7c의좌측 패널에서 HEWL 결정으로 칩을 과부하는 효과가 나타난다. 조리개가 더 많은 결정으로 채워짐에 따라 임의 방향으로 베이스에 얽히기보다는 조리개 벽에 충실합니다. 두 개의 직교 타원은 빔 방향으로 ~35°인 칩의 내부 벽에 놓인 결정의 결과입니다. 이렇게 하면 로드된 결정의 부피가 줄어들고, 적중률을 감소시키며, 이러한 바람직한 평면에 놓인 결정의 분수를 크게 줄입니다.
LCP 압출기 및 미세 유체 칩과 같은 다른 직렬 접근 방식을 I24에서 사용할 수 있습니다. 이러한 유사한 GUI와 동일한 처리 파이프라인을 사용하므로 다른 기술이 사용되는 경우에도 위의 많은 것이 적용 가능한 상태로 유지됩니다. 여기에 설명된 고정 대상 접근 방식을 넘어서는 SSX 및 SFX 모두에 대해 다수의 일련 접근법이 존재하며, 각각은 수행될 실험과 실험에 사용되는 빔라인에 따라 서로에 비해 특정한 장점이 있다. 직렬 접근 방식이 빠르게 진화함에 따라 최근 업데이트에 대한 빔라인 웹페이지(https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/I24.html)를 확인하고 빔타임을 계획할 때 가능한 한 일찍 빔라인 직원과 대화하는 것이 좋습니다. 표준 및 직렬 실험에 대한 I24에 대한 액세스는 사용 시점에서 무료입니다. 영국과 EU 사용자의 경우 여행 및 숙박 비용은 iNEXT 디스커버리를 통해 부분적으로 적용됩니다.

시리얼 싱크로트론 결정학(SSX)은 X선 프리 전자 레이저(XFEL)1,2,3에서영감을 받은 데이터 수집의 새로운 방법입니다. XFEL에서, 단 하나 회절 패턴은 결정이 매우 밝은 엑스레이 펄스에 의해 파괴되기 전에 일반적으로 아주 작은 단백질 결정에서 기록됩니다. 이는 일반적으로 다른 회절 패턴4를얻기 위해 X선 빔에 새로운 결정을 도입해야 한다는 것을 의미합니다. 이러한 결정은 지속적으로 보충해야 할 필요가 있으며, 많은 시리얼 샘플 전달 기술5의개발을 주도하고 있다.
싱크로트론에서 클래식(비직렬) 회전 결정예촬영 방법이 널리 적용되어, 고니오미터를 이용하여 X선 빔으로 회전되는 단일 대형 결정법을 활용하여 구조 용액6에대한 완전한 데이터 집합을 수집한다. 완전한 데이터 집합을수집할수 있도록 결정의 수명을 높이고, 또한 선적 및 자동화된 시료 전송을 용이하게 하기 위해, 결정은 데이터 수집을 위해 ~100K로 극저워진다. 강렬한 마이크로포커스 빔라인에서다결정 전략은 방사능 손상으로 자주 채택되어 단일 결정9,10,11로부터완전한 데이터 집합의 수집을 금지할 수 있다. 방사선 손상에 의해 부과된 한계에도 불구하고, 사용된 결정의 수는 상대적으로 적당하며 사용된 접근 방식은 본질적으로 단일 결정 실험과 동일합니다.
반면 SSX는 직렬 샘플 전달을 사용하여 수천 개의 임의 방향 결정에서 단일 여전히 회절 패턴을 가져와 완전한 데이터 집합을 생성합니다. 크리스탈 회전을 통합한 직렬 기술이 개발 중이라는 점에 주목하고있으며,13일은 여전히 회전이 0개, 접근 방식에 초점을 맞추고 있습니다. 다양한 장점과단점을가진 다양한 샘플 전달 시스템이 있는데, 이는 유량 집중/점성제트(15,16,17,미세유체칩18,19)또는 에칭 실리콘칩(20, 21)과같은 고정 표적에 결정의 흐름을 전달하는 것에서부터 다양한 장점이 있고 단점이있다. . 전형적으로, 결정은 실온에서 개최되어 더 큰 형태 적 다양성을 관찰하고 보다 생리적으로 관련된 환경을제공한다(22). SSX는 데이터 세트의 총 용량이 하나의 짧은 X선 노출과 동일하기 때문에 매우 낮은 용량 데이터집합(23)을수집할 수 있게 한다. SSX가 제공하는 또 다른 주요 이점은 시간 해결 방법을 통해 단백질 역학의 연구이며, 레이저 광24,25,26,27또는 결정 및 리간드/기판28,29의혼합에 의해 레이저 광에 노출에 의해 유발되는 반응이다. 더 작은 결정을 사용하면 레이저 광이 결정 전체를 관통할 수 있으며, 다광 흡수 없이 반응을 균일하게 시동하여 서로 다른 시간점(27)에서찍은 회절 데이터에 대해 잘 정의된 반응 중간체를 제공한다. 더 큰 결정 및 회전 기반 데이터 수집 방법의 사용은 제한된 레이저 침투 깊이, 비균일 또는 다광 활성화, 방사선 손상 및 데이터 스윕 내의 기계적 오버 헤드 시간을 앓고 있어 더 빠른 반응 속도로 해석하기가 어렵거나 불가능한 반응 중간체가 혼합됩니다. 더 작은 결정은 리간드가 크리스탈 전체에 걸쳐 신속하고 균일하게 확산될 수 있으므로,30,31,32의서로 다른 시간에 정의된 반응 중간체를 기록할 수 있기 때문에 혼합 실험에서 유사한 이점을 제공한다.
다이아몬드의 마이크로포커스 빔라인 I24에서는 기존의 회전과 SSX 실험을 모두 수행할 수 있다. 여기에 I24의 고정 대상을 사용하여 SSX 샘플 준비 및 데이터 수집을 위한 포괄적인 프로토콜과 Diamond의 직렬 데이터의 데이터 분석을 위한 프로토콜이 제시됩니다. 원고와 함께 제공되는 비디오는 사용자가 I24에서 성공적인 SSX 실험을 수행 할 수 있도록해야하지만, 이것은 빠르게 발전하는 분야이며 접근 방식이 지속적으로 진화하고 있음을 주목해야합니다. 또한 페트라 III(P14-TREXX), MAX IV(BioMAX)33,SLS(PXI 및 PXII)34,NSLS(FMX)35를포함하되 이에 국한되지 않는 다른 싱크로트론 소스에서 직렬 방법을 사용할 수 있다는 점에 유의해야 한다. 직렬 데이터 수집 및 처리의 세부 사항은 소스마다 다르지만 핵심 원칙은 동일하게 유지됩니다. 아래 의정서는 달성될 수 있는 정상회담보다는 기지진영으로 가는 출발점이자 통로를 나타내는 것으로 볼 수 있다.
이 프로토콜은 사용자가 단백질 또는 작은 분자 결정 시스템을 가지고 있다고 가정하며, mL 당 미세 결정밀도가 양호한 0.5-2.0 mL의 순서에 미세 결정 슬러리가 생성되었다고 가정합니다. 크리스탈 슬러리를 얻기위한 프로토콜은 이전에 설명되었다 36. 고정 대상의 많은 다른 유형을 사용할 수 있습니다, I24에서 가장 일반적으로 사용되는 정확하게 정의 된 실리콘 칩을 활용. 다른 칩 레이아웃과 구별하기 위해, 아래와 빔 라인 인터페이스에서이 '옥스포드 칩'이라고합니다. 앞서 설명한 바와 같이 옥스포드 칩 레이아웃은 8×8 '도시 블록'으로 구성되며, 각 조리개는 총 20×20개,21개로구성되어 있다.

<table><tbody><tr><td>칩 홀더</td><td>맞춤형</td><td>제작 N/A</td><td>2개의 마그네틱 베이스 플레이트, 2개의 금속 링 및 운동학적 마운트로 구성된 사내 맞춤형 금속 칩 홀더.</td></tr><tr><td>칩리스 칩 스페이서</td><td>SWISCII</td><td>N/A</td><td>LCP 접착 시트 LCP 모듈식 제품군</td></tr><tr><td>Geobrick LV-IMS-II</td><td>Delta Tau</td><td>N/A</td><td>A&nbsp; 맞춤형 다이아몬드 광원 하드웨어 구성이 있는 다축 컨트롤러/증폭기</td></tr><tr><td>Kinematic Mounts</td><td>ThorLabs</td><td>KB25/M</td><td>칩 홀더에 부착된 삼각형으로 배열된 3개의 자석이 있는 정사각형 베이스.</td></tr><tr><td>KNF Laboport 진공 펌프</td><td>Merck</td><td>Z262285-1EA</td><td>고체 PTFE 진공 펌프, 10 l/min 펌핑 속도.</td></tr><tr><td>Mylar 시트 6 &마이크로; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>15360562</td><td>300피트 롤 6 &마이크로; SPEX SamplePrep</td></tr><tr><td>Mylar Sheets 3 &micro에 의한 m 두께의 마일라 XRF 필름; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-675-4</td><td>300피트 롤 3 &마이크로; SPEX SamplePrep</td></tr><tr><td>Pelco easiGlow Glow Discharge System</td>의 m 두께 마일라 XRF 필름 <td>Ted Pella, INC.</td><td>91000</td><td>친수성 표면을 생산하는 데 사용되는 소형 독립형 글로우 방전 시스템</td></tr><tr><td>실리콘 칩</td><td>University of Southampton</td><td>N/A</td><td>다양한 크기로 제공되는 25,6000개의 조리개가 있는 맞춤형 에칭 실리콘 칩.</td></tr><tr><td>변환 단계</td><td>Smaract</td><td>N/A</td><td>XYZ 샘플 스테이지는 Diamond Light Source와 SmarAct의 협업 설계로, 3개의 선형 변환 50mm 이동 스테이지, 정밀한 교차 롤러 가이드웨이 및 최대 1nm 해상도의 통합 센서를 사용하여 SmarAct가 맞춤 제작했습니다</td></tr>. <tr><td>1byOne 가습기(701UK-0003 )</td><td>1byOne</td><td>B01DENO0EQ</td><td>상용 1.3리터 초음파 가습기</td></tr></tbody></table>

다이아몬드 광원의 대상 시리얼 데이터 수집 수정

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

직렬 데이터 수집은 동기화트론 사용자에게 비교적 새로운 기술입니다. I24의 고정 대상 데이터 수집을 위한 사용자 매뉴얼인 Diamond Light Source에는 원활한 데이터 수집을 위한 자세한 단계별 지침, 수치 및 비디오가 제공됩니다.

저용량 데이터 수집 및 시리즈 저용량(5.1단계: 시나리오 1) 및 투여계열(5.2단계: 시나리오 2) 데이터는 I24에서 구리 아질산 환원효소 마이크로 결정에서 수집되어 이전에 42개에공표되었다. 모든 샘플은 1단계에서 설명된 바와 같이 제조되었으며, 3단계, 4, 5단계에 따라 수집된 데이터를 6단계에서 방법을 사용하여 처리하였다. 이 작품에서 급속 용량 계열은 신선한 샘플로 이동하기 전에 각 조리개 (즉, 위에 표시된 데이터 수집 GUI에서 n=20)에서 찍은 20 회절 이미지로 수집되었다. 이들 데이터로부터 공간군 P21 3에서단위 세포의 바이모달 분포가 확인되었다(a = b = c = 97.25 Å, 및 a = b = c = 96.38 Å). 처리를 위한 이러한 단위 셀 다형성을 식별하고 분리하면 데이터 품질 지표가 현저히 개선된 것으로 나타났으며, 모든 데이터를 함께 처리할 때 관찰된 혼합 상태 대신 잔류물 189-193 사이의 유연한 루프에서 두 개의 서로 다른 구조를 밝혀냈습니다. 이러한 다형성을 식별하면 작은 구조적 변화만 예상되는 섬세한 시간 해결 구조 연구에서 모든 차이를 만들 수 있습니다. 더욱이, 수집된 투여계는 더 큰 단위 세포에 찬성하여 인구를 이동증가 용량으로, 결정에서 용량 의존 단위 세포 변화를 공개했다.
유사한 작업은 에브라힘 외(2019)47에의해 수행되었으며, 여기서 투여계(5.2단계: 시나리오 2)는 SSX(5.1단계: 시나리오 1)로부터 염료형 헴 과옥시다아제로부터 수집되어 동일한 표적 시스템에서 측정된 것과 동일한 고용량 구조를 비교하였다. SFX 데이터는 SACLA Beamline BL2 EH3에서 10펨토초의 펄스 길이와 30Hz의 반복 속도로 수집되었습니다. 10 펨토초 펄스 지속 시간은 용량 종속 효과가 SFX 데이터에 존재하지 않도록 합니다. SFX 데이터는 빔라인 I24에서 수집된 SSX 데이터와 비교하여 각 샘플 위치(즉, n=10)에서 10밀리초 노출을 측정했습니다. 철에서 멀리 헴 철 조정 물 분자의 용량 의존 이동을 관찰했다, 뿐만 아니라 SSX 용량 시리즈에서 헴 프로피오네이트 그룹 중 하나에 형태 변화. SFX 구조와 같이 손상이 없는 것은 아니지만, 투여 계열은 제로 용량 데이터 세트(ferric heme)의 Fe-O 본드 길이를 추정할 수 있게 해주었으며, 이는 SFX로부터 얻은 값과 실험 오류 내에서 이에 동의합니다.
여기에 설명된 직렬 결정학 데이터 수집 방법은 또한 실온에서 혐기성 단백질 구조를 연구하기 위하여 새로운 견본 환경을 제공하기 위하여 쉽게 적응될 수 있습니다. Rabe et al 2020 48에설명된 바와 같이, 무성 챔버에 다른 밀봉 필름을 장착한 '시트 온 시트' 샘플 또는 '칩리스 칩'을 적재하여 디산소에 민감한 샘플로부터 구조 데이터를 실온으로 수집할 수 있습니다.
펌프 프로브 다이아몬드 빔린 I24에서 다음과 같은 대표적인 결과는 수집되지 않았지만, 이러한 방법은 직렬 결정학 방법 개발의 표준 방법을 향해 작동하도록 iNEXT 프로그램의 시설 간의 긴밀한 협력을 통해 개발되었습니다. Beamline I24는 위의 프로토콜에 설명된 방법을 사용하여 이러한 실험을 수행하기 위해 아래에 설명된 것과 동등한 수집 방법을 제공하거나 곧 제공할 것입니다.
펌프 프로브: 신속한 혼합 급속한 혼합 SSX는 페라비 등(2019)에 의해 페트라 III의 빔라인 T-REXX에서 수행되었으며, 28은 고정 대상에 대한 반응을 개시하기 위해 압조 구동 액적 인젝터를 사용하여 수행되었다. 이 작품은 칩 혼합 실험에 대한 원리증명을 제시하여 GlcNac3을리소지메 마이크로결정에 결합하고, 75 pL 낙하의 50ms 이내에 발생하는 결합이 샘플에 적용됩니다. 이 연구는 xylose isomerase 활성의 7 구조 시간 해결 된 시리즈와 함께 후속되었다, 내에서 포도당 바인딩을 입증 15 ms 와 60 초 지연 후 포도당 분자에 열린 반지 형성의 형성. 물방울 주입에 대 한 동등한 설정은 현재 I24에 사용 하기 위해 개발 중.
펌프 프로브: 라이트 활성화 조명 활성화 펌프-프로브 직렬 실험은 슐츠 외(2018) 49에제시된다. 플루오로아세테이트 탈수소효소는 광케이지 형광액으로 담그고 320-360 nm 레이저 광으로 펌핑되어 4시점(t=0, 30, 752, 2,052ms)에서 구조물을 생산하였다. 휴게 상태 구조(0 ms)는 몇 가지 물 분자를 제외하고 빈 활성 부위를 나타내며, 두 단백질 하위 단위의 캡 도메인 간의 동등한 밀도를 나타낸다. 30 ms 및 752 ms 빛 활성화 후 전자 밀도의 현저한 감소는 서브유닛 A에 비해 하위 단위 B의 캡 도메인에서 관찰될 수 있다. 서브유닛 B의 캡 도메인에서 전자 밀도의 감소는 752 ms에서 하위 단위 A의 활성 부위에서 형광액의 출현과 일치한다. 2,052 ms의 최종 데이터 집합은 SN2 공격에 대한 올바른 형상을 용이하게 하는 것으로 의심되는 리간드의 추가 구조 적 재배치및 반응에서 중간 상태의 잠재적 형성을 보여줍니다. I24에서는 펨토초 펄스를 제공하는 210-2500 nm에서 튜닝할 수 있는 휴대용 파로스 레이저 시스템을 광 활성화에 사용할 수 있습니다. 초기 실험은 308nm 암초를 사용하여 방출된 리간드의 결합을 사용하여 표적 단백질에 대한 성공적인 활성화를 보여주었다. 빔라인 인사 안전 시스템에 대한 통합을 작성할 때 현재 진행 중이며 2021년 초에는 일상적인 사용자 실험이 예상됩니다. 덜 강렬한 빛의 펄스가 필요한 실험을 위해 TTL 제어 LED를 이용한 광 활성화가 성공적으로 수행되었습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig01.jpg"> 그림 1: 다이아몬드 광원에서 샘플 로딩 장비. 셋업은 진공펌프(a),장갑박스(b),가습기(c)로구성된다. 글러브 박스 내에서 진공 압력은 샘플 블록 (d)에 부착 된 샘플 블록(d)에부착 된칩에 작용하기 위해 사용되며, 압력 조절기(f,노란색 화살표)를 통해 스톱콕(g,파란색 화살표). 습한 공기는 가습기(h)에 부착된 플라스틱 튜브를통해 텐트안으로 펌핑되고, 히그로미터(i)를 사용하여 측정한다. 구성요소는 클램프스탠드(j)를사용하여 제자리에 고정됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig02.jpg"> 그림 2: 샘플 홀더. 그들은 시료 홀더를 샘플 계에 부착하는 데 사용되는 하단 반 스포츠 자기 마운트(d)와함께, 상단(b)및 하부(c)절반에 폴리 에스테르 필름을 클램프금속 O-링(a)을사용합니다. 폴리에스테르 필름(6μm(e)또는 3 μm(f)뿐만 아니라 고무 O-링(white arrows)은 정육점 볼트(g)로 단단히 닫혀있는 샘플 홀더에서 수정으로 적재된 칩이 빠르게 건조되는 것을 방지한다. 칩은 dH2O, 1 M HCl 및 dH2O(h)에서순차적으로 15 분 목욕을 사용하여 청소됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig03.jpg"> 그림 3: I24에서 고정 대상 데이터 수집을 위한 데이터 수집 GUI. (a)칩 정렬 및 데이터 수집 매개 변수 정의에 사용되는 주요 인터페이스를 나타내고,(b)데이터 수집을 위한 칩의 하위 영역을 정의하는 데 사용되는 매핑 라이트 인터페이스이며(c)는 레이저 조명을 위한 매개변수를 정의하는 인터페이스이다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig04.jpg"> 그림 4: 3단계에서 설명한 대로 단계에 칩 홀더를 장착하는 과정은 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig05.jpg"> 그림 5: 칩 정렬. 칩은(a)에표시된 칩에 세 개의 서두마커를 클릭하여 정렬됩니다. 빔라인 온축 보기 시스템을 통해 0, 1 및 2의 뷰가(b),(c)및(d)로표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig06.jpg"> 그림 6: 자동 처리 결과 6.1 단계에서 설명된 대로 시작된 디스플레이. 업데이트된 적중률플롯(a,inset)이 표시됩니다. '히트'를 클릭하면 해당 회절 이미지가 다이얼 이미지 뷰어에 표시됩니다. 현재 데이터 수집에 대한 적중률이 표시됩니다(이 예제에서는 29.6%). 패널(b)은방문 중에 지금까지 수집된 데이터에 대한 현재 인덱싱 및 통합 속도를 보여주는 창의 예를 보여 주며, 실시간으로 업데이트된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig07.jpg"> 그림 7: 보다 심층적인 데이터 분석. 단위 셀 파라미터의 시각화는다형성(a)을나타낼 수 있다. 평균 단위 셀 매개 변수가 계산됩니다. 그러나, 이것은 아직 다형성에 대 한 개별 평균으로 확장 되지 않습니다. 데이터의 작은 하위 집합의 시각화(에브라힘 외 2019에 기술된 데이터로부터 793구리 아질산염 환원효소 결정의 하위 집합은 종종 추세를 밝히기에 충분하다. 유용한 매개 변수의 2차원 플롯은 다가오는 데이터수집(b)에대해 해결할 수 있는 로딩 또는 탈수 효과로 인해 발생하는 변형을 표시하도록 생성될 수도 있습니다. 스테레오그래픽 프로젝션은 로딩프로토콜(c)으로다시 공급되는 존재 또는 부재, 선호방향을 나타낼 수 있다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

다이아몬드 빔라인 I24에서 직렬 싱크로트론 결정예촬영을 위한 고정 대상 샘플 준비, 데이터 수집 및 데이터 처리에 대한 포괄적인 가이드를 제시합니다.

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

시리얼 싱크로트론 결정학, 또는 SSX는, MX.It의 상대적으로 새롭고 빠르게 개발 영역은 낮은 용량과 실온 실험에 매우 적합하지만, 아마도 가장 중요한 것은, 그것은 역학을 따르는 데 정말 적합합니다. 이를 통해 작용 중인 단백질의 스톱 모션 영화를 만들 수 있습니다. I24에서는 여러 가지 SSX 모드를 사용할 수 있습니다.이 프로토콜은 제한된 양의 샘플을 사용하여 광범위한 직렬 실험을 허용하는 고정 대상 SSX에 중점을 둡니다. 실리콘 칩은 익숙하지 않은 경우 로딩 및 청소 할 때 손상 될 수 있습니다. 또한 칩 정렬 프로토콜은 많은 결정학자에게 완전히 새롭고 데이터 처리는 표준 회전 데이터와 약간 다릅니다.칩 홀더를 준비하려면 폴리에스테르 호일 2장을 약 6-6센티미터 사각형으로 자르고 시트를 두 개의 베이스 플레이트 위에 놓습니다. 금속 밀봉 링을 사용하여 시트를 제자리에 고정한 다음 여분의 호일을 조심스럽게 당겨 주름을 제거합니다. 다음으로, 분석할 결정의 크기에 비해 적절한 크기의 조리개를 가진 실리콘 칩을 선택한다.글로우는 0.39 밀리바에서 25초 동안 칩을 배출하며, 15밀리암페어 전류를 가짐에 따라 칩을 배출합니다. 핀셋을 사용하여 실리콘 칩을 칩 로딩 스테이지에 배치하고 올려지지 막대가 아래로 향합니다. 그런 다음, 파이펫을 사용하여, 칩의 평평한 쪽에 마이크로 결정 슬러리의 200 마이크로 리터를 적용, 칩의 모든 도시 블록을 커버슬러리를 확산.칩이 손상된 경우 작은 폴리에스테르 호일로 구멍을 덮어 균일한 진공을 적용할 수 있도록 하십시오. 그런 다음 부드러운 진공을 적용하여 칩을 통해 모든 여분의 액체를 흡입합니다. 칩 로딩 단계에서 칩을 제거하고 필터 용지로 칩의 밑면을 조심스럽게 얼룩서 과도한 액체를 제거합니다.로드된 칩을 가이드 마크 사이에 칩 홀더의 더 큰 절반에 놓고 평평한 면을 아래로 놓습니다. 칩 홀더의 작은 절반을 칩에 놓아 밀봉합니다. 칩 홀더의 두 반쪽은 제자리에 스냅해야합니다.그런 다음 육소 볼트를 사용하여 칩을 제자리에 단단히 고정시하십시오. 칩을 정렬하려면 마운트에 접근하는 동안 칩 홀더를 30도 각도로 유지합니다. 그런 다음 운동 용 마운트를 사용하여 로드된 칩을 빔 라인의 XYZ 단계에 배치합니다.자석이 접촉할 때 칩 홀더가 흐름과 평행하게 회전하도록 하고 제자리를 클릭합니다. 칩이 배치되면 빔 라인 온축 보기 시스템과 칩 정렬 그래픽 사용자 인터페이스를 사용하여 칩의 왼쪽 상단 을 찾습니다. X, Y 및 Z의 Fiducial 0을 중심으로 하려면 초점에서 위아래로 이동하여 Y를 정렬하고 X를 정렬한 다음 Fiducial 0을 클릭합니다.다음 Fiducial 0을 정렬한 후 프록시 1과 2를 같은 방식으로 X선 빔과 정렬한 후 공동 조정 시스템 만들기를 클릭합니다.그런 다음 블록 확인을 클릭"각 도시 블록의 첫 번째 우물로 XYZ 단계를 이동합니다. X선 십자선이 조리개와 정렬되면 칩이 정렬됩니다. DIALS에서 스팟 검색 결과를 나타내는 이 그래픽 표현에서 업데이트된 적음 플롯을 관찰할 수 있습니다.히트를 클릭하면 해당 회절 이미지가 DIALS 이미지 뷰어에 표시됩니다. 이 표에서는 방문 중에 데이터가 수집될 때 실시간으로 업데이트되는 현재 인덱싱 및 통합 속도를 시각화할 수 있습니다. 단위 셀 매개 변수의 시각화는 다형성을 나타낼 수 있습니다.유용한 매개 변수의 2차원 플롯을 생성하여 적재 또는 탈수 효과로 인해 발생하는 변형을 나타낼 수도 있습니다. 입체 투영은 로딩 프로토콜에 다시 공급될 수 있는 기본 방향의 존재 또는 부재를 나타낼 수 있습니다. 예를 들어, 이 프로젝션에서는 리조지메 결정으로 칩을 과부하는 효과가 관찰될 수 있다.칩을 로드할 때 파이펫을 천천히 사용하여 손가락을 사용하여 칩 위에 파이펫을 놓습니다. 이렇게 하면 칩에 닿지 않으며 실리콘의 구멍을 실수로 찌르는 것을 방지할 수 있습니다. 데이터를 처리할 때 자동화된 파이프라인을 사용할 수 있습니다.이렇게 하면 실험이 어떻게 진행되고 있는지, 그리고 무언가를 변화시켜야 하는 경우 에 대한 좋은 아이디어를 제공합니다. 이 방법은 상당한 양으로 결정화 될 수있는 모든 단백질 시스템에 적용 될 수있다. 그리고 반응은 빛 엑스레이 또는 급속한 혼합에 의해 시작될 수 있습니다.일련의 구조에 대한 동적 연구는 단백질이 어떻게 작동하는지에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

디지털 micromirror 장치 (DMD)는 흥분의 연결을 제어할 수있는 시간과 공간의 복잡한 패턴을 생성할 수 있습니다. 설계, 건설 및 DMD 시스템의 운영과 관련된 문제가 논의됩니다. 이러한 시스템은 말초 돌기 분기 지점에 걸쳐 비선형 통합의 데모를 활성화.

브랜치 지점 간 돌기 통합을 맡은 이후로 디지털 Micromirror 장치와 패턴 Photostimulation

초파리 유충은 빛에 민감하고 주변 빛의 변화에 반응합니다. 이 동영상은 광점 분석이라고 하는 빛을 피하는 능력을 테스트하는 분석에 대해 설명합니다. 주요 프로토콜은 청색광 LED로 분석을 설정하는 방법과 빛과의 만남에 대한 동물의 행동을 기록하는 방법을 보여줍니다.

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다이아몬드 광원에서 빔라인 I23의 진공 장거리 결정예 촬영을 위한 샘플 준비 및 전송 프로토콜

이 기고는 결정-온-크리스탈 장치에서 단백질 결정화를 설정하는 방법과 온칩 결정화 플랫폼을 사용하여 실온에서 자동화된 직렬 데이터 수집을 수행하는 방법을 설명합니다.

온칩 결정화 및 실온에서의 대규모 연속 회절

당사는 Harwell의 Research Complex에 있는 결정화 시설을 사용하여 단백질의 결정화를 위한 프로토콜을 제시하고 Diamond의 Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) 빔라인에서 플레이트 내의 결정으로부터 후속 in situ X선 결정학 데이터 수집을 제시합니다. 시료 요구 사항, 결정화 프로토콜 및 데이터 수집 지침에 대해 설명합니다.

Harwell 및 Beamline VMXi의 결정화 시설을 사용한 결정화 및 현장 실온 데이터 수집, Diamond Light Source

이 프로토콜은 설치류 심장의 복잡한 심장 구조를 조사하기 위해 적응된 조직 투명화 방법과 함께 고급 광시트 현미경을 활용하여 심장 형태 형성 및 리모델링을 이해하는 데 큰 잠재력을 가지고 있습니다.

설치류 심장의 심장 구조를 밝히기 위한 Light-Sheet Imaging

학습하세요 고정 대상 직렬 동기가속기 결정학 방법으로 단백질 역학을 연구하는 기법을. 실리콘 칩 준비와 정렬, 실시간 데이터 처리 과정을 통해 제한된 시료로도 고품질 회절 데이터를 획득할 수 있습니다.

다이아몬드 광원의 대상 시리얼 데이터 수집 수정

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