Name: 대사 라벨링 및 얇은 층 크로마토그래피에 의한 사카로미세스 세레시아의 중립 지질 합성 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 배우세요 대사 라벨링과 얇은 층 크로마토그래피를 이용한 Saccharomyces cerevisiae 중성 지질 합성 정량 분석 방법입니다. 이 기술은 효소 조절과 지질 대사 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자는 이 연구의 완성에 도움이나 개념적 조언을 준 Henne 연구소의 회원들에게 감사를 표하고 싶습니다. W.M.H.는 웰치 재단(I-1873), NIH NIGMS(GM119768), 아라 파레스기 안의학 연구 기금, UT 남서부 인다우먼트 학자 프로그램의 기금으로 지원됩니다. S.R은 T32 프로그램 교부금(5T32GM0008297)에 의해 지원되었습니다.

1. 14C-아세트산을 가진 효모 세포의 성장 및 라벨
<ol><li>접시에서 식민지를 수확하고 2 % 덱스트로스를 포함하는 합성 완전 (SC) 매체의 20 mL로 분배하여 효모 문화를 접종 (SC 미디어의 조리법에 대한 보충 파일 참조). 200 rpm에서 흔들면서 하룻밤 동안 30 °C에서 배양하십시오. 참고: 성장 상태, 샘플 볼륨 및 치료는 관심의 지질에 따라 다를 것입니다. 전체 실험을 실행하기 전에 최적의 성장 조건과 배양 량을 경험적으로 결정해야 합니다. 이 프로토콜은 고정 된 단계로 성장 하는 효 모 배양의 방사선 라벨링에 대해 논의, 바이오 멤브레인 및 세포 성장 둔화 하는 성장 단계, 그리고 NL 합성은 매우 활성.</li>
	<li>분광광계를 이용하여 야간 배양의 OD600을 측정하고 효모 세포 배양을 2% 덱스트로스를 함유한 신선한 SC 배지50mL에서 0.2의 최종 OD600으로 희석한다. 24 시간 동안 또는 고정 된 단계에 도달 할 때까지 셀을 성장시면 (일반적으로 OD600 측정을 두 배로 하는 셀의 평평한 안감에 의해 정의됩니다).</li>
	<li>셀을 수집하기 전에 담금질 버퍼를 만듭니다(자세한 내용은 보충 파일 참조). 각 샘플(즉, 각 샘플에 대한 40mL 담금질 버퍼)에 대해 20mL 의 담금질 버퍼를 만들고 두 개의 50mL 원문 튜브로 균등하게 분할합니다. 담금질 버퍼 알리코를 -80°C에 저장하여 향후 사용을 위해 사용합니다.</li>
	<li>배양이 원하는 OD 또는 성장 단계에 도달하면 10 분 동안 4,100 x g에서 원심분리하여 세포를 수집하십시오. 시료가 원심분리기에 있는 동안, 10 μCi/mL의 최종 농도에서 덱스트로오스가 없는 SC 미디어에[1-14C]아세트산 나트륨 염을 추가하여 방사성 라벨링 미디어를 준비한다. 주의: 방사성 물질로 작업할 때는 항상 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용해야 합니다. 방사성 물질의 적절한 저장, 사용 및 폐기에 대한 현지 지침을 항상 따르십시오. 참고: 라벨링 매체의 14C-아세트산 농도와 방사성 라벨링 인큐베이션 시간은 모두 관심의 대사산물(들)에 따라 조정되어야 한다. 여기서, 20 분 방사성 라벨 펄스 배큐브가 사용되며, 이는 풍부한 범위의 NL 종을 표시하기에 충분하다.</li>
	<li>펠릿 세포에서 상체를 제거하고, 피펫으로 펠릿을 다시 분리하여 덱스트로스없는 SC 매체의 20 mL로 한 번 셀 펠릿을 세척합니다. 5 분 동안 4,100 x g에서 원심 분리하여 세포를 다시 수집합니다.</li>
	<li>덱스트로스가 없는 SC 매체의 1mL에서 세포를 다시 중단하고, 표지된 2mL 마이크로센심분리기 튜브로 세포를 이송한다. 2 분 동안 4,100 x g에서 원심 분리하여 세포를 다시 수집합니다.</li>
	<li>덱스트로스 없는 SC 매체의 500 μL에서 다시 한 번 세포를 다시 중단합니다. -10°C 또는 최저 온도 설정에 50mL 원심관을 장착한 원심분리기를 미리 식힙니다.</li>
	<li>각 500 μL의 세포 현탁액(최종 14C-아세트산 농도 = 5 μCi/mL)에 500 μL의 방사성 라벨링 미디어를 빠르게 추가하여 방사성 라벨링 기간을 시작합니다. 라벨링 기간이 끝나기 전에 30°C에서 30°C에서 2분 동안 회전 인큐베이터에서 튜브를 배양하고- 80°C 냉동고에서 얼음 양동이로 각 샘플에 대해 담금질 버퍼의 20mL 알리쿼트 1개를 전송합니다.</li>
	<li>무선 라벨링 기간이 끝나면 파이펫을 사용하여 전체 1mL 샘플을 20mL의 냉담금 버퍼로 떨어지도록 합니다. 5-10 s의 원식 튜브를 소용돌이치면 샘플이 담금질 버퍼와 철저히 혼합되었는지 확인합니다. 얼음에 2 분 동안 담금질 버퍼에 샘플을 배양.</li>
	<li>-10°C로 설정하거나 최저 온도 설정에서 3분 동안 5,000 x g에서 원심분리기에서 회전하여 셀 펠릿을 수집합니다. 샘플 튜브가 회전하는 동안 - 80°C 냉동고에서 얼음으로 채워진 양동이로 다른 담금질 버퍼 알리쿼트 세트를 전송합니다(즉, 샘플 당 담금질 버퍼 의 20mL 튜브).</li>
	<li>담금질 버퍼 상체를 셀 펠릿에서 제거하고 20mL 신선하고 차갑고 담금질 버퍼로 교체하십시오. 소용돌이와 펠릿이 원물 관의 바닥에서 빠져나와 담금질 버퍼에서 완전히 재장식 될 때까지 샘플을 흔들어 주세요. 샘플을 -10°C에서 3분 동안 5,000 x g에서 다시 원심분리하여 세포를 수집합니다.</li>
	<li>세포가 펠릿화되면, 상류체를 부어 파이펫으로 과잉을 제거하여 샘플에서 모든 담금질 버퍼를 철저히 제거합니다. 추가 처리를 위해 -80 °C에 튜브를 저장합니다.</li>
</ol>2. 효모에서 총 지질의 격리
참고: 지질 차단을 위한 다음 프로토콜은 대부분의 중성 지질종(17,18)을효율적으로 추출하는 잘 확립되고 자주 사용되는 방법을 기반으로 합니다. 주의: 유기 용매를 사용할 때는 항상 적절한 PPE를 착용하고 가능하면 연기 후드 내부에서 작업하십시오. 지질 추출 하는 동안, 유기 용매와 호환 되지 않는 플라스틱을 사용 하지 마십시오. 폴리 프로필렌 튜브는 다음 프로토콜에 적합합니다.
<ol><li>각 샘플에 대해 산세척 유리 구슬 의 무게0.3 g의 무게와 얼음에 2 mL 미세 원심 분리 튜브에 저장합니다. -80°C 냉동고에서 셀 펠릿을 제거하고 얼음 위에 보관하십시오. 각 샘플에 350 μL 메탄올과 700 μL 클로로폼을 추가하고, 재주중단하고, 미리 계량된 유리 구슬이 들어 있는 미세원심분리기 튜브로 이송합니다.</li>
	<li>1 분 동안 소용돌이 3 x에 튜브를 교반하여 세포를 lyse, 동요 사이의 얼음에 30 s 배양. 대안적으로, 세포는 3개의 1분 주기에 대한 미니 비드 비터를 사용하여 용해될 수 있다. 25-30 μL의 전체 셀 용재를 별도의 튜브에 저장하여 반짝이는 계수를 계산하십시오. 참고: 저장된 lysate는 펄스 기간 동안 각 샘플에서 차지하는 방사성 동위 원소의 상대적 양을 결정하는 데 사용되며, 이는 TLC 플레이트에 로드된 각 샘플의 양에 영향을 미칩니다. 이는 3.2단계에서 더 논의됩니다.</li>
	<li>2mL 마이크로센심분리기 튜브의 전체 내용을 15mL 유리 원심분리기 튜브 [Tube A]에 붓습니다. 메탄올 1mL를 추가하고 10-15s의 소용돌이를 추가하여 2mL 마이크로센트심분리기 튜브를 세척합니다. 1mL 메탄올 세척을 튜브 A로 옮기고 튜브 A에 2mL의 클로로폼을 추가하고 4.45mL의 최종 시료 부피를 위해 400 μL의 물을 튜브 A에 넣습니다.</li>
	<li>1 분 동안 소용돌이 샘플은 1,000 x g에서 5 분 원심 분리가 뒤따릅니다. 원심분리 후 수성(위) 및 유기(하부) 위상은 인터페이스에 누워 있는 세포 파편과 시각적으로 명확하게 분리되어야 한다.</li>
	<li>유리 파스퇴르 파이펫을 사용하여 튜브 A에서 유기 상을 수집하고 새로운 15 mL 유리 원심 분리기 튜브 (튜브 B)로 이동합니다. 튜브 B에 1M KCl의 1mL를 추가합니다. 튜브 A에, 메탄올 1mL및 클로로폼 2mL, 200 μL MiliQ 물을 추가합니다. 튜브 A에서 소용돌이 및 원심 분리 단계를 반복합니다.</li>
	<li>다시 한번 튜브 A에서 유기 상을 수집하고 튜브 B. 적절한 용기에 튜브 A의 처분에 추가합니다. 1 분 동안 소용돌이 튜브 B는 1,000 x g에서 5 분 원심 분리가 뒤따릅니다.</li>
	<li>튜브 B에서 상부 수성 층을 제거하고 폐기합니다. 1mL의 신선한 1M KCl을 튜브 B에 다시 넣고 소용돌이/원심분리 단계를 반복합니다. 층이 분리되면 전체 하단 유기 층을 표지된 4mL 유리 유리 바이알로 조심스럽게 수집합니다. 참고: 이 단계에서 지질 추출물은 -80°C로 저장될 수 있거나, 또는 규의 TLC 분리를 위해 프로토콜을 계속할 수 있다.</li>
</ol>3. 얇은 층 크로마토그래피에 의한 방사성 동위원소 표지 형 LL의 분리 및 정량화
<ol><li>지질 추출물을 -80°C에 배치한 경우 얼음을 배양하고 이후에 벤치탑에 배양하여 서서히 실온으로 가져옵니다. 진공 건조 또는 불활성 가스의 부드러운 스트림 (예 : 아르곤 또는 질소)의 부드러운 스트림을 사용하여 지질 추출물에서 용매를 완전히 증발시다. 한편, TLC 플레이트를 가열하기 위해 오븐을 145°C로 예열합니다.</li>
	<li>샘플을 TLC 플레이트에 로드하기 전에 세포에 의해 채택된 상대적인 양의 방사성 라벨을 결정합니다. 전체 셀의 파이펫 10 μL은 2.2단계에서 6mL 유리 신자극 바이알로 lysate, 6mL의 신자극액을 추가하고 선반에 바이알을 배치합니다. 신경화 카운터를 사용하여 1분 계산 시간으로 설정된 카운트 싱글 랙 옵션을 사용하여 각 샘플의 cpm 또는 dpm을 측정합니다. 각 전체 셀 용액을 복제하여 각 샘플에 대한 평균을 얻습니다. 야생 유형 또는 참조 샘플에 따라 적재량 조정 참고: TLC 플레이트에 로드할 각 샘플의 양은 다음과 같은 방정식(평균 샘플 수)/(평균 참조 수) x 원하는 적재 량을 사용하여 결정할 수 있습니다. 예를 들어, 기준 샘플의 20 μL이 TLC 플레이트에 로드되고 평균 수가 1,000인 경우 평균 수 2,000개에 대한 실험 샘플은 TLC 플레이트에 10μL을 로드합니다.</li>
	<li>1:1 (v/v%) 클로로폼:메탄올의 40-50 μL에서 시료 지질을 재구성하여 5분 동안 소용돌이를 가한다. 유리 졸업 실린더에서 이동상 용매의 101mL를 준비하십시오(50:40:10:1 (v/v/v/ v%) 헥산:석유 에테르:Diethyl ether:Diethyl ether:Acetic acid 용매에 의해 주요 NL 종 분리의 예를 위한 대표 결과 섹션을 참조하십시오.</li>
	<li>용매를 20 x 20 TLC 채도 패드와 꽉 끼는 뚜껑이 들어 있는 유리 TLC 챔버에 붓습니다. 연필을 사용하여 접시 바닥 1.5cm 의 라인을 부드럽게 표시하여 채널20 x 20 실리카 젤 60 G 플레이트를 준비합니다. 선은 기원과 지질이 로드되는 위치를 지정합니다. 선 아래에는 각 차선에 로드될 샘플에 부드럽게 레이블을 지정합니다. TLC 플레이트가 준비되면 플레이트를 145°C 오븐에 145°C 오븐에 배양하여 플레이트를 예열하고 과도한 수분을 제거합니다.</li>
	<li>플레이트가 충분히 가열되고 TLC 포화 패드가 용매로 포화되면 오븐에서 TLC 플레이트를 제거하고 즉시 TLC 플레이트를 적재합니다. 플레이트를 따뜻하게 하면서 적재하면 빠른 용매 증발이 보장됩니다. 관심있는 각 지질 종에 대해, 분리 및 예상 이동 거리를 추적하기 위해 TLC 플레이트의 차선에 정제 된 지질 표준의 5-20 μg를로드합니다. 파이펫을 사용하여 TLC 플레이트 의 하단 1.5cm 에 위치한 각 차선의 원점까지 5μL의 샘플을 발견하십시오. 샘플의 20-40 μL이 각 차선에 로드 될 때까지 5 μL 반점의 반복 적재. 참고: 라벨이 부착되지 않은 정제지질의 5-20 μg는 각 시료 차선에 지질의 TLC 분리 후 염색및 시각화할 수 있는 트레이서로 첨가할 수 있습니다. 스테인드 스탠다드의 존재는 후속 신경 세이를 위해 방사성 표지지질 밴드의 쉽게 추적 및 절제할 수 있게 해줍니다. 플레이트에 적재되는 정제 기준은 NL 종의 관심에 의해 결정됩니다. 올레산(FFA), 1,2디올리틸-글리세롤(DG), 트리레인(TG), 콜레스테롤(철), 콜스테릴 리놀레아테(SE), 스쿼렌을 시료 차선에 인접한 차선에서 분리하는 예를 들어 대표적인 결과 섹션을 참조하십시오.</li>
	<li>표준 및 실험 샘플이 적재되면 플레이트를 개발 챔버에 놓고 용매가 플레이트 의 상단에 도달 할 때까지 기다립니다 (40-60 분). 플레이트가 완전히 개발되면 챔버에서 제거하고 연기 후드에서 20 분 동안 건조할 수 있습니다.</li>
	<li>접시가 말린 후 플라스틱 필름으로 덮고 사인 라디오 그래피 스크린이있는 개발 카세트에 놓습니다. 플레이트가 24-48h의 화면으로 개발할 수 있도록 합니다.</li>
</ol>4. TLC 분리 지질의 시각화 및 정량화
<ol><li>개발 중인 카세트에서 화면을 제거하고 인광선 이미지기 내부에 배치합니다. 인광 화상 진찰 옵션을 선택하고 800-1000 V에서 개발하십시오. 참고: 인광 화상 진찰은 TLC 플레이트에 방사성 표지된 지질의 질적 보기를 제공합니다. 그러나, 방사성 표지지질의 정량화는 신자극 계산에 의해 가장 잘 달성되고, 이는 이후에 설명된다.</li>
	<li>p-아니살데히드 시약 100mL를 혼합하고(보충 파일참조) 유리 스프레이 병에 보관하십시오. 실리카가 포화 될 때까지 p-anisaldehyde 시약으로 TLC 플레이트를 스프레이하십시오. 접시를 145°C 오븐에서 5분간 굽거나 밴드가 나타나기 전까지는 굽습니다.</li>
	<li>방사성 라벨 신경수 계수를 사용하여 개별 지질 종을 정량화하려면 면도날을 사용하여 유리 TLC 플레이트에서 실리카 젤을 긁어냅니다. 단일 방사성 표지지질 종에 대응하는 각 실리카 젤 밴드를 유리 신자극 바이알로 옮기고 6mL 의 신자극액을 추가한다. 실리카 밴드가 작은 조각으로 감소 될 때까지 소용돌이 적극적으로.<ol>
<li>대안적으로, 지질은 3절에서 지질 추출 프로토콜을 사용하여 실리카 겔 대역에서 추출될 수 있다. 실리카 젤에서 지질을 추출하면 3.1 단계에서와 같이 용매를 완전히 증발시키고 말린 지질에 6mL 의 신자극액을 추가합니다. 신경병 바이알이 들어 있는 랙을 신경화 카운터에 넣습니다. 단일 랙 카운트 옵션을 선택하고 계산 시간을 바이알당 2분으로 조정합니다. 신경화 카운터의 결과가 인쇄되고 막대 그래프로 시각화할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Konige, M., Wang, H., Sztalryd, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+adipose+specific+lipid+droplet+proteins+in+maintaining+whole+body+energy+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Role of adipose specific lipid droplet proteins in maintaining whole body energy homeostasis.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1842 (3), 393-401 (2014).</li>
<li>Arrese, E. L., Saudale, F. Z., Soulages, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+as+signaling+platforms+linking+metabolic+and+cellular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Lipid+Insights%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets as signaling platforms linking metabolic and cellular functions.</a> Lipid Insights. 7, 7-16 (2014).</li>
<li>Walther, T. C., Chung, J., Farese, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplet+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Lipid droplet biogenesis.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 491-510 (2017).</li>
<li>Olzmann, J. A., Carvalho, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+functions+of+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamics and functions of lipid droplets.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (3), 137-155 (2019).</li>
<li>Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+the+fat%3A+lipid+droplets+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Balancing the fat: lipid droplets and human disease.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).</li>
<li>Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenesis+of+atherosclerosis%3A+A+perspective+for+the+1990s%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The pathogenesis of atherosclerosis: A perspective for the 1990s.</a> Nature. 362 (6423), 801-809 (1993).</li>
<li>Zhang, C., Liu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lipid+droplet%3A+A+conserved+cellular+organelle%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+%26+Cell%22%5BJournal%5D)">The lipid droplet: A conserved cellular organelle.</a> Protein & Cell. 8 (11), 796-800 (2017).</li>
<li>Wältermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+lipid-body+formation+in+prokaryotes%3A+How+bacteria+fatten+up%3A+Lipid-body+formation+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mechanism of lipid-body formation in prokaryotes: How bacteria fatten up: Lipid-body formation in prokaryotes.</a> Molecular Microbiology. 55 (3), 750-763 (2004).</li>
<li>Borrull, A., López-Martínez, G., Poblet, M., Cordero-Otero, R., Rozès, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+the+separation+and+quantification+of+neutral+lipid+species+using+GC-MS%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Lipid+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">A simple method for the separation and quantification of neutral lipid species using GC-MS.</a> European Journal of Lipid Science and Technology. 117 (3), 274-280 (2015).</li>
<li>Kotapati, H. K., Bates, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+phase+HPLC+method+for+combined+separation+of+both+polar+and+neutral+lipid+classes+with+application+to+lipid+metabolic+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography.+B%2C+Analytical+Technologies+in+the+Biomedical+and+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Normal phase HPLC method for combined separation of both polar and neutral lipid classes with application to lipid metabolic flux.</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1145, 122099(2020).</li>
<li>Knittelfelder, O. L., Weberhofer, B. P., Eichmann, T. O., Kohlwein, S. D., Rechberger, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+ultra-high+performance+LC-MS+method+for+lipid+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%22%5BJournal%5D)">A versatile ultra-high performance LC-MS method for lipid profiling.</a> Journal of Chromatography B. 951-952, 119-128 (2014).</li>
<li>Ruiz, J. I., Ochoa, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+in+the+subnanomolar+range+of+phospholipids+and+neutral+lipids+by+monodimensional+thin-layer+chromatography+and+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Quantification in the subnanomolar range of phospholipids and neutral lipids by monodimensional thin-layer chromatography and image analysis.</a> Journal of Lipid Research. 38 (7), 1482-1489 (1997).</li>
<li>Bui, Q., Sherma, J., Hines, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+high+performance+thin+layer+chromatography-densitometry+to+study+the+influence+of+the+prion+%5BRNQ%2B%5D+and+its+determinant+prion+protein+Rnq1+on+yeast+lipid+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Separations%22%5BJournal%5D)">Using high performance thin layer chromatography-densitometry to study the influence of the prion [RNQ+] and its determinant prion protein Rnq1 on yeast lipid profiles.</a> Separations. 5 (1), 5010006(2018).</li>
<li>Pronk, J. T., de Steensma, H., Van Dijken, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyruvate+metabolism+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Pyruvate metabolism in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 12 (16), Chichester, England. 1607-1633 (1996).</li>
<li>Buttke, T. M., Pyle, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+unsaturated+fatty+acid+deprivation+on+neutral+lipid+synthesis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Effects of unsaturated fatty acid deprivation on neutral lipid synthesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Bacteriology. 152 (2), 747-756 (1982).</li>
<li>Touchstone, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin-layer+chromatographic+procedures+for+lipid+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%3A+Biomedical+Sciences+and+Applications%22%5BJournal%5D)">Thin-layer chromatographic procedures for lipid separation.</a> Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 671 (1-2), 169-195 (1995).</li>
<li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).</li>
<li>Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Bligh+and+Dyer%22+and+Folch+methods+for+solid-liquid-liquid+extraction+of+lipids+from+microorganisms.+Comprehension+of+solvatation+mechanisms+and+towards+substitution+with+alternative+solvents%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">"Bligh and Dyer" and Folch methods for solid-liquid-liquid extraction of lipids from microorganisms. Comprehension of solvatation mechanisms and towards substitution with alternative solvents.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 708(2017).</li>
<li>Fuchs, B., Süß, R., Teuber, K., Eibisch, M., Schiller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+analysis+by+thin-layer+chromatography-A+review+of+the+current+state%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Lipid analysis by thin-layer chromatography-A review of the current state.</a> Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).</li>
</ol>

저자는이 원고의 준비에 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.

여기서, 효모에서 NL 종의 합성을 정량적으로 모니터링하는 다목적 방사성 라벨링 프로토콜이 제시된다. 이 프로토콜은 매우 모듈식이므로 3-6 일 이내에 절차를 완료 할 수 있습니다. 또한, TLC 용매시스템(16,19)의간단한 변화와 함께 관심 있는 여러 지질 종을 검출할 수 있도록 하는 지질종과 대사산물을 분리하기 위해 TLC를 사용하는 데 많은문헌이존재한다. 이 프로토콜은 방사성 표지지질의 분리, 검출 및 정량화에 도움이 됩니다. 또한 레이블이 지정되지 않은 미디어의 추적 기간과 결합하여 레이블이 지정되지 않은 LL의 회전율을 감지할 수 있습니다.
HPLC, GC-MS 및 UPLC-MS와 같은 다른 방법은 지질 분리 및 정량화의 더 높은 해상도를 제공합니다. 그러나, 이것은 안정동위원소를 사용하여 극복될 수 있더라도, MS를 통해 방사성 표지된 견본을 실행하는 것이 일반적...

아세틸-코아는 중성 지질(LL)을 포함한 다양한 생체분자의 기본 구성 블록으로, 멤브레인 을 구축하고 ATP를 생성하며 세포 신호1,2를조절하는 다목적 생체 분자 통화로 작용한다. 이러한 각 경로 중 어느 경로로든 LS를 회피할 수 있는 가용성은 부분적으로 스토리지에 의해 규제됩니다. 지질 방울(LDs), 트리글리세라이드(TGs) 및 스테롤 에스테르(SEs)의 소수성 코어로 구성된 세포질 세포기관은 대부분의 셀룰러 LL의 주요 저장 칸입니다. 이와 같이, LDs 격리 및 조절 LL, 이는 저하 될 수 있으며, 그 후 생화학 및 신진 대사과정에활용3,4. NL 및 LD 관련 단백질의 잘못된 조절은 lipodystrophy 및 대사 증후군5,6을포함하여 병리학의 개시와 상관관계가 있는 것으로 알려져 있습니다. 이 때문에, 현재 LD 연구는 NL 합성이 공간적으로, 현세적으로, 그리고 다세포 유기체의 뚜렷한 조직에 걸쳐 어떻게 규제되는지에 집중됩니다. LL에 대한 유비쿼터스 세포 역할로 인해 LL의 합성 및 조절을 담당하는 많은 효소가 진핵생물7을통해 보존됩니다. 실제로 일부 prokaryotes도 LDS8에L을 저장합니다. 따라서, Saccharomyces cerevisiae (신진 효모)와 같은 유전적 인 기관체는 NL 합성 및 조절의 연구에 유용했습니다.
세포 추출물로부터의 LL의 분리 및 정량화는 가스 크로마토그래피 질량 분석법(GC-MS), 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 초고성능 액체 크로마토그래피 질량 분석법(UPLC-MS)9,10,11을포함한 무수한 방법으로 달성될 수 있다. 아마도 LL을 분리하는 가장 간단한 방법은 표준곡선(12,13)에서후속 밀도 정량화를 허용하는 얇은 층 크로마토그래피(TLC)를 통해서일 수 있다. TLC는 L의 코스 그레인 분리만 제공하지만 저렴하기 때문에 강력한 기술로 남아 있으며 여러 샘플에서 동시에 L을 신속하게 분리할 수 있습니다. TLC를 통해 LL의 연구에 직면 하는 가장 상당한 과제의 두 가지는: 1) NL 종 및 그들의 중간체의 세포 풍부의 광범위 한 범위, 그리고 2) NL 합성 경로 내에서 지질 중간체의 소수성/소수성의 범위. 따라서, TLC를 통해 NL 종의 정량화는 일반적으로 가장 풍부한 종으로 제한됩니다; 그러나, 14C-아세트산 방사성 라벨의 도입은 NL 경로 내에서 낮은 풍부 중간체의 검출을 크게 향상시킬 수 있습니다. 아세트산은 아세틸-코아 시냅스 ACS214에의해 아세틸-코아로 빠르게 변환되어, 이는 14C-아세트산을 효모15에서적합한 방사성 라벨기질로 만든다. 또한, 다수의 용매시스템(16)을사용하여 TLC에 의해 소수성 LL 및 LL의 친성 중급자 모두의 분리를 달성할 수 있다. 여기서, 효모에서 14C-아세트산 대사 라벨링을 사용하여 LL의 분리를 위한 방법이 제시된다. 펄스 기간 동안 표지된 지질은 그 후 잘 확립된 총 지질 격리프로토콜(17)에의해 격리되고, 그 다음으로 TLC에 의한 NL 종의 분리가 뒤따릅니다. 라벨이 부착된 지질을 시각화하기 위해 사인 방사선 촬영으로 TLC 플레이트를 개발하고 총 지질을 시각화하는 화학 스프레이를 개발하여 여러 가지 정량화 방법을 허용합니다. 개별 지질 밴드는 또한 면도날을 사용하여 TLC 플레이트에서 쉽게 추출할 수 있으며, 신경화 계수는 밴드 내의 방사성 라벨 재료의 양을 정량화하는 데 사용될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>[1-C14] 아세트산 나트륨 염 특정 활성도 : 45-60mCi</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC084H001MC</td><td></td></tr><tr><td>18 : 1 1,2 디올레올 -sn- 글리세롤</td><td>Avanti</td><td>800811O</td><td></td></tr><tr><td>200 증거 절대 에탄올</td><td>시그마</td><td>459836</td><td></td></tr><tr><td>산성 세척 유리 구슬 425-600um</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>Pastuer 피</td><td>펫</td> <td>용 앰버 전구03-448-24</td><td></td></tr><tr><td>황산 암모늄 >99 %</td> <td>시그마</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>벡크 만 LS6500 섬광 카운터</td><td>PerkinElmer</td><td>A481000</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름 (HPLC 등급)</td> <td>Fisher</td><td>C607SK</td><td></td></tr><tr><td>콜레스테롤 >99 %</td> <td>시그마</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>콜레스테릴 리놀리 에이트 >98 %</td> <td>시그마</td><td>C0289</td><td></td></tr><tr><td>진한 황산</td><td>Sigma</td><td>339741</td><td></td></tr><tr><td>Corning 50mL 원뿔형 튜브, 센트리스타 캡이 있는 폴리프로필렌</td><td>Sigma</td><td>CLS430829</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose, 무수 등급</td><td>Sigma</td><td>D9434</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl ether 무수 등급</td><td>Sigma</td><td>296082</td><td></td></tr><tr><td>건조 오븐</td><td>Fisher</td><td>11-475-155</td><td></td></tr><tr><td>EcoLume 섬광 액체</td><td>VWR</td><td>IC88247001</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5424R 원심분리기</td><td>Fisher</td><td>05-401-205</td><td></td></tr><tr><td>GE 스토리지 형광체 스크린</td><td>Sigma</td><td>GE28-9564-75</td><td></td></tr><tr><td>GE Typhoon FLA9500 이미저</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>빙초산, ACS 등급</td><td>Sigma</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>Glass 6mL 섬광 바이알</td><td>Sigma</td><td>M1901</td><td></td></tr><tr><td>유리 원심 분리기 튜브 캡</td><td>Fisher</td><td>14-595-36A</td><td></td></tr><tr><td>유리 원심 분리기 튜브</td><td>Fisher</td><td>14-595-35A</td><td></td></tr><tr><td>유리 파스퇴르 피펫</td><td>Fisher</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>헥산, 무수 등급</td><td>Sigma</td><td>296090</td><td></td></tr><tr><td>L-아데닌 >99%</td><td>Sigma</td><td>A8626</td><td></td></tr><tr><td>L-알라닌 >98%</td><td>Sigma</td><td>A7627</td><td></td></tr><tr><td>L-아르기닌 >99%</td><td>시그마</td><td>A1270000</td><td></td></tr><tr><td>L-아스파라긴 >98%</td><td>시그마</td><td>A0884</td><td></td></tr><tr><td>L-아스파르테이트 >98%</td><td>시그마</td><td>A9256</td><td></td></tr><tr><td>L-시스테인 >97%</td><td>시그마</td><td>W326305</td><td></td></tr><tr><td>L-글루탐산 일나트륨 일수화물 >98%</td><td>시그마</td><td>49621</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민 >99%</td><td>시그마</td><td>G3126</td><td></td></tr><tr><td>L-글리신 >99%</td><td>시그마</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>L-히스티딘 >99%</td><td>시그마</td><td>H8000</td><td></td></tr><tr><td>L-이소류신 >98%</td><td>시그마</td><td>I2752</td><td></td></tr><tr><td>L-류신 >98%</td><td>시그마</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>L-라이신 >98%</td><td>시그마</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>L-메티오닌, HPLC 등급</td><td>시그마</td><td>M9625</td><td></td></tr><tr><td>L-페닐알라닌, 시약 등급</td><td>시그마</td><td>P2126</td><td></td></tr><tr><td>L-프롤린 >99%</td><td>시그마</td><td>P0380</td><td></td></tr><tr><td>L-세린 >99%</td><td>시그마</td><td>S4500</td><td></td></tr><tr><td>L-테로닌, 시약 등급</td><td>시그마</td><td>T8625</td><td></td></tr><tr><td>L-트립토판 >98%</td><td>시그마</td><td>T0254</td><td></td></tr><tr><td>L-티로신 >98%</td><td>시그마</td><td>T3754</td><td></td></tr><tr><td>L-Uracil >99%</td><td>Sigma</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>L-발린>98%</td><td>Sigma</td><td>V0500</td><td></td></tr><tr><td>메탄올, ACS 등급</td><td>Fisher</td><td>A412</td><td></td></tr><tr><td>올레산 >99%</td><td>Sigma</td><td>O1008</td><td></td></tr><tr><td>p-anisaldehyde</td><td>Sigma</td><td>A88107</td><td></td></tr><tr><td>석유 에테르, ACS 등급</td><td>Sigma</td><td>184519</td><td></td></tr><tr><td>포스파티딜콜린, 디팔미토일 >99%</td><td>Sigma</td><td>P1652</td><td></td></tr><tr><td>피펫</td><td>Eppendorf</td><td>2231000713</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨, ACS 등급</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨 펠릿, ACS 인증</td><td>Fisher</td><td>S318-100</td><td></td></tr><tr><td>스쿠알렌 >98%</td><td>Sigma</td><td>S3626</td><td></td></tr><tr><td>숙신산 결정질/인증</td><td>Fisher</td><td>110-15-6</td><td></td></tr><tr><td>TLC 포화 패드</td><td>Sigma</td><td>Z265225</td><td></td></tr><tr><td>TLC 실리카겔 60G 유리 채널링 플레이트</td><td>Fisher</td><td>NC9825743</td><td>형광 표시기 없음</td></tr><tr><td>투명 플라스틱 필름</td><td>Apollo</td><td>829903</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>Triolein >99%</td><td>Sigma</td><td>T7140</td><td></td></tr><tr><td>볼텍스 믹서</td><td>Fisher</td><td>02-215-414</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 노출 카세트</td><td>Sigma</td><td>WHA29175523</td><td></td></tr><tr><td>황산 암모늄 및 아미노산이 없는 효모 질소 염기</td><td>Sigma</td><td>Y1251</td><td></td></tr></tbody></table>

대사 라벨링 및 얇은 층 크로마토그래피에 의한 사카로미세스 세레시아의 중립 지질 합성 분석

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

중성 지질 (LL)은 에너지와 지질 항상성에 중요한 역할을하는 소수성, 불책임한 생체 분자의 클래스입니다. LLs는 아세틸-CoA로부터 합성드 노보이며 트리글리세라이드(TGs) 및 스테롤 에스테르(SEs)의 형태로 주로 진핵생물에 존재한다. LL의 합성을 담당하는 효소는 Saccharomyces cerevisiae (효모)에서 인간에게 매우 보존되어 효모는 NL 신진 대사 효소의 기능과 조절을 해부하는 유용한 모델 유기체입니다. 아세틸-CoA가 다양한 NL 종으로 변환되는 방법에 대해 많은 알려져 있지만, NL 대사 효소를 조절하기 위한 메커니즘, 그리고 잘못된 규제가 세포 병리학에 어떻게 기여할 수 있는지에 대해서는 여전히 발견되고 있습니다. NL 종의 고립과 특성화를 위한 수많은 방법은 수십 년 동안 연구를 통해 개발되고 사용되었습니다. 그러나 주요 NL 종의 포괄적인 특성화를 위한 정량적이고 단순한 프로토콜은 논의되지 않았습니다. 여기서, 효모에서 주요 NL 종의 드 노보 합성을 정량화하는 간단하고 적응 가능한 방법이 제시된다. 우리는 얇은 층 크로마토그래피와 결합 된 14C-아세트산 대사 라벨링을 적용하여 다양한 생리학적으로 중요한 LL을 분리하고 정량화합니다.

이 프로토콜에서, 우리는 NL 종의 라벨링, 검출 및 정량화가 14C-아세트산 대사 라벨링에 의해 달성될 수 있다는 것을 입증했습니다. 주요 NL 종은 50:40:10:10:1 (v/v/v/v%) 헥산:석유 에테르:Diethyl 에테르:아세트산(그림1A,B)의용매 시스템에서 분리될 수 있다. 인광 화상 진찰은 표지된 자유 지방산 (FFA), 트리아실글리세롤 (TG), diacylglycerol (DG), 콜레스테롤 (철), 및 스쿼렌 (SQ)의 시각화를 허용합니다(그림 1A). SEs는 이 용매의 다른 NL 종과 분리될 수 있지만, 20분 펄스에 따라 자동 라디오그램에서 검출되는 것은 없습니다. 이것은 효모에 있는 성장의 고정단계 도중 느린 SE 합성에 기인할 지도 모릅니다. 또한 정제지질종은 이 방법으로 분리될 수 있으며, 이후 P-아니살데히드 시약(도<strong cla...

여기서, 중성 지질의 분리를 위한 얇은 층 크로마토그래피와 결합된 14C-아세트산을 가진 효모의 대사 라벨링을 위한 프로토콜이 제시된다.

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...

이 기술은 대부분의 실험실 환경에서 일반적으로 발견되는 계측을 사용하며 여러 샘플을 동시에 분석할 수 있습니다. 이 방법은 지질 대사 효소가 세포 문맥과 다른 유전 적 배경에서 어떻게 조절되는지에 대한 주요 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 효모 배양판에서 식민지를 200rpm에서 흔들며 하룻밤 동안 섭씨 30도에 2%의 덱스트로스를 함유한 SC 미디어의 20밀리리터로 접종합니다.다음 날, 신선한 매체의 50 밀리리터에서 문화를 최종 OD0.2로 희석하고 고정 단계에 도달할 때까지 24 시간 동안 성장합니다. 각 샘플에 대해 담금질 버퍼의 두 밀리리터 알리쿼트두를 준비하고 영하 80도에서 저장합니다. 동시에, 백리터 당 10 마이크로큐리의 최종 농도에서 덱스트로스 무료 SC 미디어에 아세트산 나트륨 염을 추가하여 방사성 라벨링 미디어를 준비한다.10 분 동안 4, 100 x g에서 원심 분리하여 세포를 수집합니다. 상체를 제거하고 덱스트로스 무료 SC 미디어의 20 밀리리터로 한 번 셀 펠릿을 세척하십시오. 5 분 동안 4, 100 x g에서 원심 분리하여 세포를 다시 수집하고 덱스트로우스 프리 미디어를 사용하여 라벨이 붙은 2 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로 전송합니다.세포를 또 다른 2분 동안 원심분리합니다. 덱스트로스 무료 SC 미디어의 500 마이크로리터에서 세포를 다시 중단하고 각 세포 현탁액에 500 마이크로리터의 방사성 라벨링 미디어를 신속하게 추가하여 방사성 라벨링 기간을 시작합니다. 회전하는 인큐베이터에서 20분 동안 30도의 배양합니다.한편, 50 밀리리터 원뿔관을 장착한 원심분리기를 영하 10도까지 미리 식히고 담금질 버퍼의 20밀리리터 알리쿼트 하나를 해동하십시오. 무선 라벨링 기간이 끝나면 파이펫을 사용하여 1밀리리터 샘플 전체를 얼음 위에 해동된 담금질 버퍼로 떨어집니다. 3 분 동안 5, 000 x g에서 미리 냉각 된 원심 분리기에서 회전하여 셀 펠릿을 수집하고 신선한 차가운 담금질 버퍼 20 밀리리터를 추가하십시오.소용돌이와 완전히 담금질 버퍼에서 그들을 다시 중단하고 세포를 수집하기 위해 샘플을 원심 분리하기 위해 샘플을 흔들어. 세포가 펠릿화되면, 상류체를 부어 파이펫으로 과잉을 제거하여 샘플에서 모든 담금질 버퍼를 철저히 제거합니다. 튜브를 영하 80도에 저장하여 추가 처리를 위해 튜브를 보관하십시오.각 샘플에 대해 0.3 그램의 산 세척 유리 구슬을 무게와 얼음에 2 밀리리터 미세 원심 분리 튜브에 저장합니다. 영하 80도 냉동고에서 셀 펠릿을 제거하고 얼음 위에 놓습니다. 그런 다음 각 샘플에 메탄올 350 마이크로리터와 700 마이크로리터의 클로로폼을 추가하고 세포를 다시 중단합니다.미리 계량된 유리 구슬이 들어 있는 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기십시오. 1 분 동안 세 번 소용돌이에 의해 세포를 lyse, 와 함께 30 동요 사이의 얼음에 잠복. 세포를 15밀리리터 유리 원심분리기 튜브에 붓고 튜브 A.Wash 와 마이크로센트심분리기 튜브를 메탄올 1밀리리터로 세척하고, 소용돌이를 피하고, 메탄올을 튜브 A.에 2밀리리터를 넣고 4.45밀리리터의 최종 샘플 볼륨을 위해 튜브 A에 400 마이크로리터를 넣습니다.1분 동안 시료를 1000 x g로 5분간 원심분리하여 계면에 세포 파편이 있는 수성 및 유기상을 명확하게 분리합니다. 유리 목초지 파이펫을 사용하여, B 라벨새로운 유리 원심 분리튜브에 유기 상을 수집하고 하나의 어금니 칼륨 염화 칼륨의 1 밀리리터를 추가합니다. 메탄올 1밀리리터와 클로로폼 2밀리리터를 튜브 A에 넣고 소용돌이 및 원심분리 단계를 반복합니다.소용돌이 및 원심분리기 튜브 B는 수성 및 유기상을 분리합니다. 상부 수성 층을 제거하고 전체 하단 유기 층을 4 밀리리터 유리 바이알로 수집합니다. 불활성 가스 하에서 건조하여 지질 추출물에서 용매를 완전히 증발시키고 오븐을 섭씨 145도로 예열하여 TLC 플레이트를 가열합니다.TLC 플레이트에 적재하기 전에 세포에서 채택한 상대적인 양의 방사성 라벨을 결정합니다. 5분 동안 소용돌이를 통해 1대1 비율로 혼합된 클로로폼과 메탄올의 40~50마이크로리터에서 시료 지질을 재구성한다. 유리 졸업 실린더에서 이동상 용매의 101 밀리리터를 준비합니다.그런 다음 20 tLC 포화 패드와 타이트 핏 뚜껑을 포함하는 유리 TLC 챔버에 용매를 붓습니다. 20 x 20 실리카 젤 60G 플레이트를 계측하고 연필을 사용하여 플레이트 바닥 의 1.5센티미터 를 표시합니다. 플레이트가 충분히 가열되고 TLC 포화 패드가 용매로 포화되면 오븐에서 TLC 플레이트를 제거하고 즉시 적재합니다.파이펫을 사용하여 TLC 플레이트 의 바닥 1.5센티미터에 위치한 각 차선의 원점까지 5마이크로리터의 시료를 발견하고 20~40마이크로리터의 시료가 각 차선에 적재될 때까지 로딩을 반복합니다. 표준과 샘플이 로드되면 플레이트를 개발 챔버에 놓고 용매가 플레이트 의 상단에 도달 할 때까지 기다립니다. 플레이트가 완전히 개발되면 챔버에서 꺼내 연기 후드에서 20 분 동안 건조시키십시오.접시가 말린 후 플라스틱 필름으로 덮고 사인 라디오 그래피 스크린이있는 개발 카세트에 놓습니다. 개발 중인 카세트에서 화면을 제거하고 인광선 이미지기 내부에 놓습니다. 실리카가 포화 될 때까지 P-아니살데히드 시약으로 TLC 플레이트를 분무한 다음 5 분 동안 또는 밴드가 등장 할 때까지 145도 오븐에서 구워줍니다.지질 종을 정량화하려면 개별 지질 종을 포함하는 실리카 젤을 긁어 유리 반짝이 바이알로 옮습니다. 실리카 밴드가 작은 조각으로 감소 될 때까지 6 밀리리터의 신경유체와 소용돌이를 적극적으로 추가합니다. 신경병 바이알이 있는 랙을 신경화 카운터에 넣고 바이알당 계산 시간을 2분으로 조정하여 계산합니다.인광 화상 진찰은 라벨이 없는 지방산, 트리아실글리세롤, 디아실리세롤, 콜레스테롤 및 스쿼레인의 자동 방사선 사진의 시각화를 허용합니다. 정제된 지질종은 이 방법으로 분리될 수 있으며, 이어서 P-아니살데히드 시약으로 TLC 플레이트의 분무에 의해 시각화될 수 있음을 입증하였다. 시각화 된 종은 멸균 에스테르 이외에 이전에 언급 된 모든 지질을 포함한다.맥박 에 이어 라디오라벨이 없는 매체에 10분 추격 기간을 적용함으로써, 스쿼레인의 주요 풀에서 관찰되었고 총 콜레스테롤이 상승되었다. 유사하게, 추격 기간에 투석기의 출현은 자유 지방산 신호의 감소와 상관관계가 있다. 전체 프로토콜을 수행하기 전에 세포가 성장 상태 및 관심의 유전 적 배경에서 아세트산 방사성 라벨을 섭취 할 지 여부를 결정하는 것이 중요합니다.

analysis-neutral-lipid-synthesis-saccharomyces-cerevisiae-metabolic

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

여기 Saccharomyces cerevisiae의에서 단백질 단지를 식별하기위한 새로운 양적 proteomics 기술을 설명합니다. 본 연구에서는, 우리는 높은 특이성과 ER 단백질 Scs2p의 바인딩 파트너를 식별하는 탠덤 질량 분석계 다음 친화 정화와 함께 SILAC 방법을 사용했습니다.

S. cerevisiae의의 양적 proteomics와 단백질 단지의 식별

우리는 조사 스캔 전기 분무 이온화 질량 분광법 (ESI / MS)를 사용하여 효모의 수많은 지질 수종을 식별하기위한 새로운 양적 lipidomics 방법을 설명합니다. 이 방법은 현재 lipids, 감도 및 속도의 다양한 분자 형태를 해결하는 능력 지질 식별 및 부량 사용할 방법을 초과했습니다.

전기 분무 이온화 질량 분광법을 사용하여 효모 Lipidome의 양적 평가

면역 기관과 세포의 glycosphingolipid 항원의 표현 프로필에 대한 통찰력을 얻을 수있는 구체적이고 민감한 방법을 설명합니다. 방법은 화학적으로 합성 표준에 비해 구조 분석을위한 glycosphingolipid 분자의 단계 - 현명한 조각을 허용 이온 트랩 질량 분광법을 활용합니다.

Glycosphingolipid 항원의 대량 Spectrometric 분석

우리는 공부에 대한 강력한 생화학 및 미세 방법을...

에서 지방 질량의 생화학 및 높은 처리량 미세 평가<em&gt; Caenorhabditis Elegans</em

여기에서 우리는 완전히 15 N 표시 애기 장대 세포 배양 레이블의 혼합물에 따라 세제 저항하고 세제 용해 막에 식물 세포막의 분별과 생체 내에서 강력한 방법을 설명합니다. 절차는 시그널링 프로세스를 이해하기 위해, 비교 단백체 연구에 적용된다.

비교 단백체 분석을위한 신진 대사 라벨링 및 막 분별<em&gt; 애기 장대</em&gt; 서스펜션 세포 배양

여기, 우리가 셀 높은 처리량 실험에서 경작된에 triacylglycerols의 역학을 공부 하는 지질 작은 물방울 인덱스 (LD)를 얻기 위해 프로토콜을 설명 합니다. LD 인덱스 분석 결과 BODIPY 493/503을 사용 하는 쉽고 안정적인 방법입니다. 이 분석 결과 dispendious 지질 추출 또는 현미경 분석 필요 하지 않습니다.

곰 팡이 병원 체 Ustilago Maydis 에 액체 형광 복구 하 여 지질 인덱스 결정

여기에서, 우리는 핵분열과 신진 효모 세포의 형광 현미경 심상에 있는 지질 방울의 자동적인 탐지 그리고 정량적인 설명의 MATLAB 구현을 제시합니다.

자동 이미지 처리를 사용하여 핵분열 및 신진 효모의 지질 방울 함량 분석

우리는 Saccharomyces cerevisiae에있는 중요한 세포 지질을 확인하고 정량화하기 위하여 탠덤 질량 분광법과 결합된 액체 크로마토그래피를 사용하여 프로토콜을 제시합니다. 효모 세포 내의 주요 지질 클래스의 정량적 평가를 위한 설명된 방법은 다재다능하고, 견고하며, 민감하다.

탠덤 질량 분석과 결합 된 액체 크로마토그래피를 사용하여 사카로 미세화세세비시아의 세포 지질의 정량분석

베이커의 효모 미토콘드리아 게놈은 8개의 폴리펩티드를 인코딩합니다. 현재 프로토콜의 목표는 모든 프로토콜에 레이블을 지정한 다음 별도의 대역으로 시각화하는 것입니다.

베이커효모사카로미세스 세레비시아에 미토콘드리아 게놈 발현 제품의 라벨링 및 시각화

프로토콜은 복잡한 lysate 기반 세포 없는 시스템에서 대사 반응을 연구하기 위한 굴절 지수 또는 질량 분광 검출에 결합된 고성능 액체 크로마토그래피 방법을 설명합니다.

리자테 기반 세포 없는 시스템에서 대사산물 프로파일링을 위한 굴절률 또는 질량 분광 검출에 결합된 액체 크로마토그래피

배우세요 대사 라벨링과 얇은 층 크로마토그래피를 이용한 Saccharomyces cerevisiae 중성 지질 합성 정량 분석 방법입니다. 이 기술은 효소 조절과 지질 대사 연구에 활용됩니다.

대사 라벨링 및 얇은 층 크로마토그래피에 의한 사카로미세스 세레시아의 중립 지질 합성 분석

더 많은 동영상 탐색